一株降解亞硝酸鹽植物乳桿菌的生長特性及其在泡菜制作中的應(yīng)用

劉瑋，邱崇順，何宇星，塔娜，梁程媛，張恩馨，烏云達(dá)來*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

（2.聯(lián)邦制藥（內(nèi)蒙古）有限公司，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000）

泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因富含膳食纖維、有機(jī)酸，具有較好的風(fēng)味及較長的貨架期而被世界各地消費(fèi)者所喜愛[1-3]，雖然我國蔬菜產(chǎn)量在全球排第一，但近年來一直存在新鮮蔬菜污染有害細(xì)菌或致病菌[4]，生產(chǎn)過程不易控制[5]，亞硝酸鹽和食鹽含量高[6]等問題。亞硝酸鹽（Nitrite，NIT）是一種被食品工業(yè)廣泛應(yīng)用的護(hù)色劑和防腐劑。然而，過量食用亞硝酸鹽會出現(xiàn)急性中毒等癥狀，微量或少量長期攝入也會對人體產(chǎn)生毒副作用[7,8]，因此，有必要控制食品中亞硝酸鹽的含量。據(jù)研究報道，乳酸菌在泡菜發(fā)酵中起關(guān)鍵作用[9]，與自然發(fā)酵相比，純菌接種發(fā)酵能讓優(yōu)勢菌群快速增殖，縮短發(fā)酵周期[10,11]，提高游離氨基酸等代謝產(chǎn)物[12]，降低亞硝酸鹽含量，提高感官評價分?jǐn)?shù)[13-16]。此外，在酸菜中接種乳酸菌可加速發(fā)酵體系中pH值的降低，并提高亞硝酸鹽降解率[17]。

當(dāng)前，降解亞硝酸鹽的方法有物理降解法、化學(xué)降解法、生物降解法[18]，利用乳酸菌降解亞硝酸鹽是生物降解法最常見的方法之一[19]，其降解亞硝酸鹽的機(jī)理主要是酸降解、酶降解和抑制有害微生物的生長[20]，鄒輝等[21]研究表明草酸、檸檬酸、乳酸等對食品中亞硝酸鹽有顯著的降解作用。林浩等[22]將乳酸直接添加去離子水來降解亞硝酸鹽，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推進(jìn)亞硝酸鹽含量都出現(xiàn)不同程度的下降，而對照組亞硝酸鹽含量基本不變。乳酸能夠去除亞硝酸鹽是因為乳酸與亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應(yīng)（2H++3NO2-=NO3+2NO↑+H2O），證實了植物乳桿菌降解亞硝酸鹽主要是依靠酸降解。李文婷等[23]研究表明，使用乳酸菌制劑（泡樂美1號）接種泡菜，試驗組中pH值降低速度高于自然發(fā)酵組；就亞硝酸鹽峰值而言，試驗組（9.13 mg/kg）明顯低于自然發(fā)酵組（12.07 mg/kg），可見乳酸菌產(chǎn)生的酸對亞硝酸鹽的降解起著重要作用。張慶芳等[24]研究發(fā)現(xiàn)短乳桿菌產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶對亞硝酸鹽的降解起著重要作用。因此，本研究自行分離篩選的具有降解亞硝酸鹽作用的植物乳桿菌36為供試菌株，運(yùn)用于泡菜制作中研究其泡菜亞硝酸鹽含量的影響，為提高發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量與安全性提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株36是從蒙古國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選的一株具有降解亞硝酸鹽作用的植物乳桿菌，在NCBI中登錄號為MN611150，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全實驗室提供[25]。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌36的生長特性分析

1.2.1.1 菌種活化及發(fā)酵劑的制備

將菌株36活化3次，接種于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到107CFU/mL，4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.1.2 生長曲線的測定

將菌株36以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定培養(yǎng)液OD600nm值、活菌數(shù)對數(shù)值。以時間為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)液OD600nm值、活菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制其生長曲線。

1.2.1.3 耐酸性的測定

將菌株36按2%（V/V）的接種量接種于不同pH值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，測定發(fā)酵液OD600nm值。

1.2.1.4 耐鹽性的測定

將菌株36按2%（V/V）的接種量接種于不同NaCl濃度（0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，測定發(fā)酵液OD600nm值。

1.2.2 植物乳桿菌36在泡菜制作中的應(yīng)用

1.2.2.1 泡菜制作的工藝流程

圖1 泡菜制作工藝流程Fig.1 Production process of pickle

參照郭云仙[26]的方法用乳酸菌接種發(fā)酵制作泡菜，將新鮮白菜去除老葉、根須等附屬物，切成大小5～6 cm左右，厚度0.5 cm左右的薄塊，用清水洗凈并置于陰涼處晾干，裝入泡菜壇，以料液比約1.5:1（g/mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的食鹽溶液，加入輔料，在無菌條件下，接入菌體濃度達(dá)107CFU/mL的植物乳桿菌36發(fā)酵劑，然后用紗布將壇口進(jìn)行密封，發(fā)酵9 d。制作工藝流程如圖1所示。

1.2.2.2 泡菜中pH值的測定

用pH計對泡菜發(fā)酵液的pH值進(jìn)行測定，于第1、3、5、7、9天進(jìn)行測量，每組測量三次，取均值。

1.2.2.3 測定泡菜中總酸含量

參照文獻(xiàn)[27]測定泡菜中總酸含量（g/kg），于第1、3、5、7、9天進(jìn)行測量，每組測量三次，取均值。

1.2.2.4 測定泡菜中亞硝酸鹽含量

參照鹽酸萘乙二胺法[28]測定泡菜中亞硝酸鹽含量（mg/kg），于第1、3、5、7、9天進(jìn)行測量，每組測量三次，取均值。

1.2.2.5 乳酸菌數(shù)的測定

參照平板計數(shù)法[29]測定泡菜中乳酸菌數(shù)（lg CFU/mL），于第1、3、5、7、9天進(jìn)行測量，每組測量三次，取均值。

1.2.2.6 泡菜感官品質(zhì)的評定

泡菜感官評定參照文獻(xiàn)[30]的方法在基礎(chǔ)上做稍微調(diào)整，具體評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 泡菜感官評定表Table 1 Sensory evaluation form of pickle

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個樣本均進(jìn)行3次平行試驗，結(jié)果以ˉ x±SD表示；組間比較采用單因素ANOVA分析，部分?jǐn)?shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中的Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌36的生長特性分析

2.1.1 生長曲線的測定

將菌株36以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定OD600nm值、活菌數(shù)對數(shù)值。由結(jié)果（圖2）可知，菌株36在0～2 h活菌數(shù)和OD600nm值緩慢上升，2 h進(jìn)入對數(shù)生長期，6 h后進(jìn)入穩(wěn)定期且較長時間內(nèi)保持菌株活性，其中在12 h活菌數(shù)最大（9.49 lg CFU/mL），菌株36的生長曲線為其在后續(xù)泡菜發(fā)酵中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖2 植物乳桿菌36的生長曲線Fig.2 Growth curve of L. plantarum 36

2.1.2 耐酸性和耐鹽性的測定

由菌株36耐酸性試驗結(jié)果（圖3a）可知，菌株36在pH值4.0～6.0的范圍內(nèi)，都能較好的生長，當(dāng)pH值低于4.0時，菌株36的生長能力顯著下降（p＜0.05），當(dāng)pH值降到2.0時，菌株36仍能生長（OD600nm值為0.47），可知菌株36具有較強(qiáng)的耐酸性。由菌株36耐鹽性試驗結(jié)果（圖3b）可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～8%以內(nèi)，菌株36能較好的生長，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)10%～14%時生長被顯著抑制，特別是當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)14%時，菌株36仍能生長（OD600nm值為0.32），表明菌株36有較強(qiáng)的耐鹽能力，通常發(fā)酵蔬菜所需鹽濃度為3%～5%[31]，由此可知菌株36可滿足后續(xù)泡菜試驗。

圖3 植物乳桿菌36耐酸性和耐鹽性的測定Fig.3 Determination of acid and salt tolerance of L.plantarum 36

2.2 植物乳桿菌36在泡菜制作中的應(yīng)用

2.2.1 泡菜中pH值和總酸含量的變化

為了消除初始pH值對泡菜后續(xù)發(fā)酵的影響，自然發(fā)酵組和試驗組初始pH值均調(diào)至6.18，由圖4可知，自然發(fā)酵組pH值從第1天開始顯著下降，第7天開始趨于平穩(wěn)（3.42），總酸含量從第1天開始緩慢升高，到第7天達(dá)最高值（4.11 g/kg）并趨于平穩(wěn)；而試驗組pH值從第1天開始顯著下降，第3天開始趨于平穩(wěn)（3.34），總酸含量從第1天開始大幅度升高，到第5天達(dá)最高值（6.16 g/kg）并趨于平穩(wěn)。雖然兩組數(shù)據(jù)中的pH值與總酸含量均呈負(fù)相關(guān)，但接種菌株36的試驗組pH值下降速度更快，產(chǎn)酸量更高。據(jù)研究報道，王新惠等[32]利用植物乳桿菌接種發(fā)酵辣椒醬與對照組對比，對照組發(fā)酵35 h后pH值和總酸含量分別達(dá)到3.81和7.86 g/kg；而實驗組pH值和總酸含量分別達(dá)到3.59和8.27 g/kg。乳酸菌在發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生乳酸、蘋果酸等物質(zhì),對比自然發(fā)酵組，接種植物乳桿菌發(fā)酵泡菜，其發(fā)酵前期能產(chǎn)生更多的乳酸，縮短發(fā)酵周期。

圖4 泡菜中pH值和總酸含量的變化（p＜0.05）Fig.4 Changes in pH and total acid content in pickle (p<0.05)

2.2.2 泡菜中亞硝酸鹽含量的變化

利用鹽酸萘乙二胺法測定泡菜中的亞硝酸鹽含量（圖5）可知，自然發(fā)酵組第3天達(dá)最高值，峰值為15.17 mg/kg，到第5天顯著降至3.74 mg/kg（p＜0.05），第9天達(dá)2.10 mg/kg；而試驗組從第1天的最高值（2.24 mg/kg）到第3天顯著降至1.16 mg/kg（p＜0.05），然后隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸下降，到第9天亞硝酸鹽含量維持在1.13 mg/kg左右，顯著低于自然發(fā)酵組（p＜0.05）。就亞硝酸鹽含量峰值而言，自然發(fā)酵組在第3天，試驗組在第1天，這是因為發(fā)酵初期乳酸菌處于延滯期，泡菜表面自帶的部分雜菌分泌硝酸還原酶，將原料中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽所致，試驗組接種發(fā)酵泡菜的亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時間早且峰值低，說明菌株36對亞硝酸鹽具有明顯的轉(zhuǎn)化作用。據(jù)報道，馬艷弘等[33]將植物乳桿菌M1接種發(fā)酵山藥，發(fā)酵11 d時，山藥接種發(fā)酵的亞硝酸鹽含量達(dá)3.4 mg/kg。發(fā)酵14 d時，其亞硝酸鹽含量達(dá)0.4 mg/kg；而山藥自然發(fā)酵11 d時，山藥接種發(fā)酵的亞硝酸鹽含量達(dá)5.7 mg/kg。發(fā)酵14 d時，其亞硝酸鹽含量達(dá)3.9 mg/kg?？梢姡?6具有良好降解泡菜中亞硝酸鹽的能力。在GB 2714-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—醬腌菜》中規(guī)定，腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量必須低于20 mg/kg[34]，雖然兩種發(fā)酵方式制作的泡菜中亞硝酸鹽含量均低于國家標(biāo)準(zhǔn)要求，但試驗組亞硝酸鹽含量顯著低于自然發(fā)酵組（p＜0.05），這有利于提高泡菜的安全性。

圖5 不同發(fā)酵方式亞硝酸鹽含量的變化Fig.5 Changes of nitrite content in different fermentation methods (p<0.05)

2.2.3 泡菜中乳酸菌數(shù)的變化

圖6 不同發(fā)酵方式乳酸菌數(shù)變化Fig.6 Changes of lactic acid bacteria number in different fermentation methods (p<0.05)

測定泡菜中的乳酸菌數(shù)（圖6）可知，自然發(fā)酵組到第3天乳酸菌數(shù)達(dá)最高值（8.16 lg CFU/mL），然后乳酸菌數(shù)量緩慢減少；而試驗組的乳酸菌數(shù)均高于自然發(fā)酵組，到第7天乳酸菌數(shù)達(dá)最高值（9.95 lg CFU/mL），而且比自然發(fā)酵組高一個數(shù)量級。這是因為發(fā)酵前期，試驗組中的菌株36快速發(fā)酵而產(chǎn)熱，導(dǎo)致環(huán)境溫度達(dá)到乳酸菌適宜的生長溫度而大量繁殖，試驗組耐溫性和耐酸性要高于自然發(fā)酵組，因此接種菌株36發(fā)酵泡菜的乳酸菌數(shù)始終高于自然發(fā)酵組。金樂天等[35]將植物乳桿菌550接種于朝鮮泡菜中，與自然發(fā)酵組相比，試驗組活菌數(shù)在發(fā)酵4 d后達(dá)7.10×107CFU/mL以上。

2.2.4 泡菜的感官評定

對自然發(fā)酵組及試驗組泡菜進(jìn)行感官評定（表2）可知，自然發(fā)酵組在香氣和質(zhì)地及滋味方面優(yōu)于試驗組，而在色澤及形態(tài)方面，試驗組優(yōu)于自然發(fā)酵組?？傊匀话l(fā)酵組與試驗組間無顯著差異（p＞0.05）。

表2 泡菜感官評定Table 2 Sensory evaluation of pickle

3 結(jié)論

本研究將具有降解亞硝酸鹽作用的植物乳桿菌36作為對象，研究其生長特性及在泡菜制作中的應(yīng)用，探索其降低泡菜中亞硝酸鹽含量，提高泡菜的食用安全性提供依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)菌株36具有較強(qiáng)的耐酸性和耐鹽能力；在泡菜發(fā)酵初期，pH值＞4.5，亞硝酸鹽的降解主要通過乳酸菌的亞硝酸鹽還原酶來實現(xiàn)；當(dāng)pH值＜4.0，則通過大量積累的乳酸來降解亞硝酸鹽。通過將菌株36應(yīng)用于泡菜制作中得知，試驗組中的pH值發(fā)酵至第3 d開始就降至4.0以下，且總酸含量和亞硝酸鹽降解率隨之升高。而自然發(fā)酵組的pH值發(fā)酵至第5 d才降至4.0以下，且總酸含量和亞硝酸鹽降解率也隨之升高?？梢娫囼灲M中pH值下降速度、總酸含量、亞硝酸鹽降解率顯著高于自然發(fā)酵組，表明接種菌株36發(fā)酵泡菜產(chǎn)酸能力更強(qiáng)、亞硝酸鹽降解率更高、發(fā)酵周期更短，這主要是因為乳酸菌在培養(yǎng)過程中不斷產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵泡菜中H+濃度的升高（即pH值的降低和總酸的升高），較高的酸度可以分解破壞亞硝酸鹽，從而使亞硝酸鹽降解率升高，且試驗組（9.95 lg CFU/mL）的乳酸菌數(shù)顯著高于自然發(fā)酵組（8.16 lg CFU/mL）?？傊匀话l(fā)酵組和試驗組的感官評定無顯著差異（p＞0.05）。由此可見，接種菌株36發(fā)酵泡菜具有很大的優(yōu)越性，其具有較高的產(chǎn)酸能力，能夠縮短發(fā)酵周期、提高亞硝酸鹽降解率和泡菜的食用安全性。本試驗結(jié)果為植物乳桿菌36的益生作用研究和在泡菜中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。