微泡菌ALW1重組β-半乳糖苷酶的異源表達和酶學性質(zhì)

唐桂均，李鶴賓，朱艷冰,3，姜澤東,3，倪輝,3，李清彪,3，陳艷紅,3*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021）（2.廈門醫(yī)學院藥學系，福建廈門 361023）（3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23）又稱乳糖酶（Lactase），是一種重要的生物催化劑[1]，歸屬于不同糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GH）家族：GH1、GH2、GH35、GH42和GH59[2]。β-半乳糖苷酶不僅可以通過水解乳糖中的β-1,4-D-半乳吡喃糖苷鍵以達到降解乳糖的作用，還可以通過轉(zhuǎn)糖苷生成具有益生作用的低聚半乳糖（GOS）[3,4]。

乳糖是乳品中重要的碳水化合物，它是以單體分子形式存在于乳品中的雙糖。人體無法直接吸收雙糖分子，雙糖攝入后，需分解成單糖才可被吸收利用。β-半乳糖苷酶可降解乳制品中的乳糖為半乳糖和葡萄糖，有利于人體的吸收，同時避免乳制品（如冰淇淋和某些類型的奶酪）在冷藏條件下形成乳糖結(jié)晶[5,6]，保證乳制品質(zhì)量。在工業(yè)生產(chǎn)中常利用β-半乳糖苷酶水解乳糖，具有反應產(chǎn)物單一、不污染奶源，以及不破壞其他成分等優(yōu)點，因此該酶在食品行業(yè)具有重要的應用價值。此外，β-半乳糖苷酶還可以與葡萄糖氧化酶聯(lián)合使用制備生物傳感器，用于測定牛奶等乳制品中乳糖的含量[7]，也可以用于乳清中乳糖的水解，從而減緩乳清排放后對水造成的污染[8]。

β-半乳糖苷酶在植物、微生物及動物體中較為常見，大部分β-半乳糖苷酶來源于微生物[8,9]。來源于微生物的β-半乳糖苷酶具有高產(chǎn)、低成本、酶源廣等優(yōu)點。在工業(yè)應用中，β-半乳糖苷酶存在著穩(wěn)定性差、酶活力不高等問題。因此，研究不同微生物來源的β-半乳糖苷酶，篩選具有優(yōu)良特性的酶具有重要意義[10]。不同來源的β-半乳糖苷酶具有不同的酶學特性，包括最適反應溫度、最適反應pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等，這也決定了酶的不同用途。例如，黑曲霉來源的β-半乳糖苷酶在酸性條件下具有好的穩(wěn)定性和酶活力，可用于治療乳糖不耐癥[11]；絲狀真菌來源的β-半乳糖苷酶在堿性條件下酶活力良好，常用于面包發(fā)酵[12]。

在先前的研究中，從腐爛海帶中分離出海洋微泡菌ALW1[13]，并進行了該菌株的基因組測序，發(fā)現(xiàn)一個預測編碼β-半乳糖苷酶的基因（GenBank收錄號：Mw366919）。本研究對來自微泡菌的β-半乳糖苷酶進行克隆、表達和純化，并對其酶學性質(zhì)進行研究，為微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNP-Gal）、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷（pNP-Glu）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷（pNP-α-L-F）、4-硝基苯基-β-D-吡喃巖藻糖苷（pNP-β-D-F）、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷（pNPM）和4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNP-xyl），Sigma-Aldrich公司；Ni-NTA agarose，GE Healthcare Life Sciences公司。

1.2 主要儀器與設備

Epoch2T酶標儀，美國博騰儀器有限公司；Avanti?J-25冷凍離心機，美國Beckman公司；Unic3-18K冷凍離心機，Sigma-Aldrich公司；超聲破碎儀，上海虔鈞科學儀器有限公司；JS-680C凝膠成像系統(tǒng)，上海昕瑞有限公司。

1.3 β-半乳糖苷酶的序列分析

利用DNAMAN軟件對β-半乳糖苷酶的基因序列進行分析，使用ExPASy中的ProtParam分析β-半乳糖苷酶的理論分子量和pI，使用SignalP 5.0分析β-半乳糖苷酶的信號肽。利用BLAST對GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，使用ClustalX2程序生成蛋白質(zhì)序列的比對。在碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzyme，CAZy）數(shù)據(jù)庫中搜索、下載來自不同家族的典型β-半乳糖苷酶的基因序列，利用ClustalX2和MEGA7.0軟件構(gòu)建β-半乳糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 β-半乳糖苷酶的基因工程表達菌株構(gòu)建

以微泡菌ALW1的基因組DNA為模板，使用PCR技術(shù)對β-半乳糖苷酶基因進行擴增。利用DNA回收試劑盒進行純化后，使用EcoRI和SalI分別對目的基因和表達載體pET-28a(+)進行雙酶切反應。目的基因和表達載體使用DNA回收試劑盒純化后進行連接反應，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α中。轉(zhuǎn)化后的細胞均勻涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)菌落PCR驗證后，對插入的序列進行測序分析，將測序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21中，獲得含有β-半乳糖苷酶基因重組表達質(zhì)粒的E. coliBL21（DE3）基因工程菌株。

1.5 β-半乳糖苷酶的表達和純化

將含微泡菌β-半乳糖苷酶基因的E. coliBL21（DE3）按1%（V/V）的接種量接種到250 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8時，加入25 μL IPTG（0.5 mol/L），在18 ℃、180 r/min條件下誘導表達20 h。將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體沉淀，用10 mL緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、15 mmol/L咪唑，pH 8.0）重懸菌體，冰浴條件下對菌體進行超聲破碎，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。參照GE Healthcare Life Sciences公司的Ni-NTA使用說明書純化重組蛋白。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析目的蛋白的純度及其分子量大小。蛋白質(zhì)濃度的測定參照Bradford法[14]，使用凝膠過濾層析法確定β-半乳糖苷酶的天然分子量[15]。

1.6 β-半乳糖苷酶的活力測定

以pNP-Gal為底物測定β-半乳糖苷酶的活力。配制2.5 mmol/LpNP-Gal底物溶液（溶于50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH值4.5）。90 μL底物溶液中加入10 μL酶液（0.1 mg/mL），在30 ℃反應10 min后，立即加入200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，在405 nm處測定吸光度值。每組做三個平行，以滅活的酶液作為空白組。β-半乳糖苷酶的酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘釋放1 μmolpNP所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.7 重組β-半乳糖苷酶的酶學性質(zhì)研究

1.7.1 酶的底物特異性

用50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值4.5）配制2.5 mmoL/L的不同人工底物溶液，包括4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷和4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷，按1.6的方法測定酶對不同底物的活力，研究酶的底物特異性。

1.7.2 溫度對酶活力和穩(wěn)定性的影響

將β-半乳糖苷酶在不同溫度下（15、20、25、30、35、40和45 ℃）反應10 min，測定酶的活力，研究酶的最適反應溫度。為探究β-半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性，將酶置于不同溫度（4、15、20、25、30和35 ℃）下放置2 h，每隔30 min取樣，測定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定為100%。

1.7.3 pH對酶活力和穩(wěn)定性的影響

用50 mmol/L不同pH值的緩沖液分別配制2.5 mmol/L的pNP-Gal底物溶液，在不同pH條件下測定酶的活力，研究酶的最適反應pH。為探究β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性，將酶分別置于不同pH值的緩沖液中，在25 ℃下放置60 min后，測定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定為100%。

1.7.4 酶的動力學參數(shù)的測定

用50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值4.5）配制不同濃度（2.5、5、10、15、20、25 mmol/L）的pNP-Gal底物溶液。將β-半乳糖苷酶分別與不同濃度的底物反應，測定酶的活力。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算重組β-半乳糖苷酶的最大反應速率（Vmax）與底物親和常數(shù)（Km）。

1.8 化學添加劑對酶穩(wěn)定性的影響

將β-半乳糖苷酶分別與不同金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+和Fe3+）或其他化學試劑（Triton X-100、吐溫20、吐溫80、SDS、CTAB、β-ME、DTT、EDTA、尿素）混合，使化學添加劑達到不同的指定終濃度。酶與化學試劑25 ℃溫育30 min后，加入pNP-Gal底物，測定酶的殘余活力。以未添加化學試劑處理的酶活力定為100%。

1.9 β-半乳糖苷酶的三維建模及酶與pNP-Gal底物的分子對接

在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫獲取模板，利用Modeller 9.18構(gòu)建β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，pNP-Gal的三維結(jié)構(gòu)在NCBI中的PubChem下載pdb文件。應用AutoDock進行酶與底物的分子對接，選擇構(gòu)象最佳的對接結(jié)果，使用Discovery Studio 2019軟件進行分析和圖像顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-半乳糖苷酶的序列分析

微泡菌β-半乳糖苷酶基因的長度為141 9 bp，編碼472個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的理論分子量和pI分別為52.8 ku和5.29，該β-半乳糖苷酶不含有信號肽。蛋白序列的同源性分析表明，微泡菌β-半乳糖苷酶與來源于Actinoalloteichus hymeniacidonis（AOS64332.1）、Amycolatopsis albispora（AXB42219.1）、AActinoplanessp. N902-109（AGL19093.1）和Amycolatopsis albispora（AXB41531.1）的β-半乳糖苷酶分別具有51%、50%、49%和48%的相似性。蛋白質(zhì)序列比對分析顯示，β-半乳糖苷酶含有GH1家族的β-半乳糖苷酶典型的氨基酸序列NEP（185-187位氨基酸）和ENG（370-372位氨基酸），其中Glu186預測為酸堿催化殘基，Glu370預測為親核催化殘基；差異序列主要集中于蛋白質(zhì)中間區(qū)域及C末端（圖1）。采用系統(tǒng)進化分析來確定微泡菌β-半乳糖苷酶所屬家族。利用碳水化合物活性酶家族（CAZy）數(shù)據(jù)庫中5個糖苷水解酶（GH）家族的16個特征性β-半乳糖苷酶構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。該酶與來自Acidilobussp. 7（AMD30575.1）和Acidilobus saccharovorans345-15（ADL19795.1）的β-半乳糖苷酶在同一分支，它們是GH1家族的代表成員。這些結(jié)果表明，本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶歸屬于GH1家族。

圖1 微泡菌β-半乳糖苷酶與其他β-半乳糖苷酶蛋白序列的比對分析Fig.1 Alignment of β-galactosidase from Microbulbifer sp.with other β-galactosidase protein sequences

圖2 β-半乳糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-galactosidase

2.2 β-半乳糖苷酶的表達和純化

pET-28a(+)表達質(zhì)粒插入外源基因后，可表達出帶有多聚組氨酸標簽的重組蛋白。含有微泡菌β-半乳糖苷酶基因的E. coliBL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導表達和純化后，SDS-PAGE分析顯示，與經(jīng)IPTG誘導表達的含pET-28a(+)陰性菌（圖3，泳道1）相比，經(jīng)IPTG誘導表達的含重組質(zhì)粒的陽性菌在蛋白理論分子量大小的位置附近有明顯的蛋白表達條帶（圖3，泳道2），說明有目的蛋白表達。β-半乳糖苷酶大量誘導表達后，利用超聲進行菌體破碎，上清過Ni-NTA Agarose親和層析柱，獲得重組β-半乳糖苷酶，重組酶的分子質(zhì)量約為64 ku（圖3，泳道3）。使用Sephacryl S-200凝膠過濾層析法測定純化的重組酶分子量為64.6 ku。這些結(jié)果表明，微泡菌β-半乳糖苷酶是單亞基蛋白質(zhì)。

圖3 β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達Fig.3 Expression of β-galactosidase gene in E. coli

2.3 微泡菌β-半乳糖苷酶的酶學性質(zhì)

2.3.1β-半乳糖苷酶的底物特異性

根據(jù)酶與不同底物反應生成pNP的含量不同來研究β-半乳糖苷酶的底物特異性。如表1所示，相比于4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，微泡菌β-半乳糖苷酶對4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷的相對酶活力分別為153.79%和158.16%，對4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷無活力。結(jié)果表明，微泡菌β-半乳糖苷酶對具有立體化學偏好的芳基-β-糖苷具有特異性作用。

表1 β-半乳糖苷酶的底物特異性Table 1 Substrate specificity of β-galactosidase

2.3.2 溫度對β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

圖4 溫度對β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of β-galactosidase

溫度對微泡菌β-半乳糖苷酶活力的影響結(jié)果（圖4a）顯示，β-半乳糖苷酶的最適溫度為30 ℃，在20～40 ℃之間相對活性保持在60%以上，在45 ℃時，相對活性急劇下降至13.75%。溫度對β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果（圖4b）顯示，隨著時間變化，酶的穩(wěn)定性呈下降趨勢。溫度≤25 ℃時，酶活力下降較慢，在4 ℃和25 ℃放置2 h后，酶分別具有78.26%和38.35%的相對酶活力。溫度為30 ℃和35 ℃時，酶活力下降顯著，在30 ℃和35 ℃放置30 min后，相對酶活力迅速分別降至53.05%和7.58%。目前商業(yè)β-半乳糖苷酶大多為中溫酶，而乳品加工中許多工藝以及貯運均在低溫下進行[16]。朱五二等[17]研究的鹽單胞菌S62來源低溫β-半乳糖苷酶生成低聚半乳糖的最適反應溫度為40 ℃。Turkiewicz等[18]的研究中，Pseudoalteromonassp.22b來源的低溫β-半乳糖苷酶最適反應溫度為40 ℃。與上述報道的低溫β-半乳糖苷酶相比，本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶的最適反應溫度相對較低，且在低溫條件下仍能保留較高的酶活力，因此本研究的β-半乳糖苷酶在乳品加工中具有應用潛力。

2.3.3 pH對β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

圖5 pH對β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of β-galactosidase

pH對微泡菌β-半乳糖苷酶活力的影響如圖5a所示。β-半乳糖苷酶的最適pH為4.5，pH值在4.0～5.5時，相對酶活力在55%以上。為探究β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性，在不同pH條件下對酶處理1 h。結(jié)果表明（圖5b），β-半乳糖苷酶在pH值4.0～5.0范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，殘余酶活力在80%以上。在以往的報道中，Erwiniasp. E602來源β-半乳糖苷酶[19]的最適反應pH值為7.0，在pH 4.0下處理1 h后的殘余酶活力為55%；Paracoccus marcusiiKGP來源β-半乳糖苷酶[20]的最適反應pH為8.0，在pH 4.0下處理30 min后無酶活力。而本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶的最適pH相對較低，且在酸性條件下具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。

2.3.4β-半乳糖苷酶的動力學參數(shù)

圖6 β-半乳糖苷酶作用于pNP-Gal的雙倒數(shù)曲線Fig.6 The lineweaver-burk of β-galactosidase acting on pNP-Gal

以pNP-Gal為底物，研究微泡菌β-半乳糖苷酶的動力學參數(shù)。當β-半乳糖苷酶與不同濃度的pNP-Gal進行反應后，通過計算反應初速度繪制出雙倒數(shù)曲線（圖6），計算出微泡菌β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分別為10.98 mmol/L和7.48 U/mg，高于來自Akkermansia muciniphila[21]的β-半乳糖苷酶的Km和Vmax。

2.3.5 不同來源β-半乳糖苷酶的酶學性質(zhì)比較

不同來源β-半乳糖苷酶的酶學性質(zhì)見表2，可以看出，相較于其他來源的酶，本研究中微泡菌來源β-半乳糖苷酶的最適反應溫度較低，而且酶的溫度穩(wěn)定性不高；該酶在酸性條件下起作用，并在pH值4.0～5.0的條件下具有優(yōu)良的耐酸性，使其更適用于酸性乳清和干酪的水解。動力學參數(shù)比較分析顯示，微泡菌來源β-半乳糖苷酶具有較高的Km值，該酶的Vmax值高于Lactobacillus plantarumFMNP01和Akkermansia muciniphila來源的β-半乳糖苷酶，低于Erwiniasp. E602、Paracoccus marcusiiKGP和Lactobacillus curieaeM2011381來源的β-半乳糖苷酶。

表2 不同來源β-半乳糖苷酶的酶學性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of β-galactosidases from different sources

2.4 化學添加劑對β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響

金屬離子能通過調(diào)節(jié)催化過程或酶的結(jié)構(gòu)對酶活力產(chǎn)生影響[24]。將微泡菌β-半乳糖苷酶利用不同金屬離子處理后，測定酶的剩余活力。由圖7可得，測試的金屬離子（包括K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+和Fe3+）對β-半乳糖苷酶活力存在不同程度的抑制作用。其中，10 mmol/L的K+、Ca2+、Mn2+處理后，β-半乳糖苷酶保留80%的相對酶活力；Zn2+和Cu2+處理后，β-半乳糖苷酶幾乎喪失其酶活力，這與來自Alteromonassp. ML117和Akkermansia muciniphila的β-半乳糖苷酶的研究結(jié)果相似[21,25]。

其他化學添加劑對微泡菌β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果如表3所示。β-半乳糖苷酶對非離子型去垢劑吐溫80和低濃度的吐溫20具有良好的穩(wěn)定性，當吐溫20濃度為1%時，酶活力提高到157.09%；非離子型去垢劑Triton X-100對酶活力具有抑制作用。離子型去垢劑SDS和CTAB存在時，β-半乳糖苷酶幾乎喪失活性。還原試劑DTT對β-半乳糖苷酶活力具有促進作用；低濃度的β-ME還原試劑對酶活力沒有影響，但高濃度下呈現(xiàn)中等抑制作用。金屬螯合劑EDTA對β-半乳糖苷酶表現(xiàn)出中等抑制作用，表明它可能是一種對二價陽離子有一定要求的金屬酶，而對于來自Bacillus subtilis的β-半乳糖苷酶[26]，EDTA則不會影響其活力。變性劑尿素強烈抑制β-半乳糖苷酶的活力，2.5 mol/L尿素處理后，酶的活力完全喪失。

圖7 金屬離子對β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of metal ions on the stability of β-galactosidase

表3 其他化學添加劑對β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of other chemical reagents on the stability of β-galactosidase

2.5 β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)及酶與底物的相互作用

將微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶進行三維建模，在PDB數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索，模板的PDB登入號為1UYQ，氨基酸殘基的范圍為24-471，與模板序列相似度為42.9%。微泡菌β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)中觀察到糖苷水解酶GH1家族典型的（α/β）8桶結(jié)構(gòu)域，其中催化殘基Glu186和Glu370被標記（圖8a）。

為進一步從分子水平上認知β-半乳糖苷酶與底物相互作用模式，利用分子對接研究了pNP-Gal在活性位點處的作用模式。pNP-Gal與β-半乳糖苷酶的分子對接結(jié)果如圖8b所示，酸/堿催化殘基Glu186和親核催化殘基Glu370在糖環(huán)兩側(cè)，Tyr314、Thr315、Glu370和Glu431與pNP-Gal形成氫鍵（圖8b，綠色線條），Tyr314還與底物形成Pi-Pi T型作用力（圖8b，紫色線條）。

圖8 微泡菌β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)（a）及酶與底物的分子對接（b）Fig.8 The tertiary structure of β-galactosidase from Microbulbifer sp. (a) and molecular docking of β-galactosidase and pNP-Gal substrate (b)

3 結(jié)論

本研究將來自微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶進行表達和純化，研究其酶學性質(zhì)。微泡菌β-半乳糖苷酶歸屬于GH1家族，在溫度低于25 ℃時具有良好的溫度穩(wěn)定性，在酸性條件（pH值4.0～5.5）下表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。β-半乳糖苷酶對還原試劑DTT、一些非離子型去垢劑（吐溫80和吐溫20）顯示良好的穩(wěn)定性。分子對接提供了微泡菌β-半乳糖苷酶與pNP-Gal底物相互作用模式的深入了解，對微泡菌β-半乳糖苷酶的應用奠定理論基礎。