參貝咀嚼片的免疫調(diào)節(jié)活性及其安全性評價(jià)

張婷婷，葉子，王萌，趙璠，伊揚(yáng)磊*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西咸陽 712100）（2.陜西華州醫(yī)藥生物工程有限公司，陜西西安710054）（3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西咸陽 712100）

人參作為一種名貴的中藥材，具有十分悠久的藥用史，相關(guān)研究表明其具有提高免疫力[1]、緩解疲勞[2]、改善心腦血管情況[3]、抗腫瘤[4]等作用。人參的活性成分有皂苷、揮發(fā)油、人參多糖等，其最主要的營養(yǎng)成分以及功能因子人參皂苷[5]。人參皂苷共有50種類型，如人參二醇型、人參三醇型、齊墩果酸型等，其中人參皂苷Re是人參三醇型皂苷的主要成分，同時(shí)其也是人參莖葉中含量最多的皂苷[6]，其具有降血糖、抗氧化以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種功能[7-9]。平貝母為多年生草本植物，是一種百合科貝母屬的名貴中草藥。其在傳統(tǒng)中醫(yī)中主要用于緩解肺熱燥咳、治療干咳少痰、陰虛勞嗽、咳痰帶血等癥[10-12]。平貝母中含有多糖類、生物堿類、生物堿苷類、核苷類以及皂苷類等多種活性成分，具有抗氧化、抗衰老和降血糖等功能。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥材的應(yīng)用范圍得到極大的擴(kuò)展。人參、平貝母等中藥材，由于其對人體具有良好的效果且具有較好的安全性，早已被列入衛(wèi)計(jì)委公布的藥食同源名錄中。以人參、平貝母為基礎(chǔ)的保健食品具有較為廣泛的應(yīng)用前景?，F(xiàn)代生活的快節(jié)奏使得亞健康人群數(shù)量逐漸增加，人們對保健食品在提高免疫力且食用便捷方面的需求也逐步上升。前期研究發(fā)現(xiàn)人參與平貝母組合物能夠提高免疫力，但其劑量與安全性沒有驗(yàn)證。因此，本研究采用浸泡、濃縮等系列操作，以人參和平貝母為主要原料，制備主要活性成分為人參皂苷Re和生物堿的參貝咀嚼片。

根據(jù)《保健食品功能評價(jià)方法（2020年版）征求意見稿》[13]和《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）》[14]，對參貝咀嚼片進(jìn)行較為系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)活性及安全性評價(jià)，以期為參貝咀嚼片的合理安全應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

參貝咀嚼片，自制，其標(biāo)志性成分及含量為：人參皂苷Re（1.30 mg/g）、總生物堿（0.10 mg/g）。自制參貝咀嚼片的主要原料為人參和平貝母，輔料為蔗糖、乳糖、糊精、甘露醇、硬脂酸鎂。實(shí)驗(yàn)前，先將試驗(yàn)樣品研碎，以蒸餾水為溶劑溶解樣品，隨用隨配。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括SD大鼠100只和SPF級昆明種小鼠300只，均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（陜）2018-001。試驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)條件如下：溫度20～25 ℃，濕度45%～65%。

1.1.3 主要菌株

用于細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)的菌株，包括TA97、TA98、TA100、TA102四種菌株，均購自上海北諾生物科技有限公司。

1.1.4 主要試劑

SA緩沖液、Hank's液、補(bǔ)體（豚鼠血清）、Gimsa染液，北京索萊寶科技有限公司；ConA、MTT，美國Sigma-Aldrich公司；SRBC，天津市大茂化學(xué)試劑廠；RPMI1640培養(yǎng)液，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品制備

將人參、平貝母經(jīng)凈制、檢驗(yàn)合格后供制備使用。取人參、平貝母，以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇為溶劑，回流提取2次，溶劑用量分別為10倍量、8倍量，提取時(shí)間分別為2 h、1 h，過濾后合并濾液，減壓濃縮濾液（-0.065～-0.075 MPa，65 ℃），濃縮為相對密度為1.30～1.35（60 ℃）的清膏。

取上述醇提后的藥渣，加入10倍量水（m/V）為溶劑提取1.5 h，過濾并收集濾液（藥渣另器保存），濾液減壓濃縮（-0.065～-0.075 MPa，65 ℃）至相對密度為1.30～1.35（60 ℃）的清膏。合并同種原料的兩次浸膏并減壓干燥（-0.085 MPa，65 ℃），將所得干膏粉碎成細(xì)粉，過80目篩。

將上述二種膏粉與蔗糖、糊精、乳糖、甘露醇混勻，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇制成軟材，16目篩制粒，于55～60 ℃干燥后14目篩整，將硬脂酸鎂加入上述干顆粒中，混合均勻、壓片、包裝、檢驗(yàn)即得。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)中：選用200只SPF級昆明種雄性小鼠（體質(zhì)量為18～22 g），將其分為五大組：（一）小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）測定、淋巴器官/體質(zhì)量比值測定；（二）抗體生成細(xì)胞檢測、血清溶血素測定；（三）小鼠碳廓清試驗(yàn)；（四）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)；（五）ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測定。每大組40只小鼠并隨機(jī)分為4小組，每小組10只小鼠。灌胃劑量為人體推薦量的30倍、20倍、10倍，即1.20、0.80、0.40 g/kg（以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)，下同）三個(gè)劑量組，另設(shè)陰性對照組（蒸餾水）。受試樣品配制：取適量樣品研碎，分別稱取1.20 g、0.80 g、0.40 g加蒸餾水至20.00 mL，混合均勻，配制成濃度為6.00%、4.00%、2.00%的混懸液，備用[13]。

安全性試驗(yàn)中：選取雌雄SD大鼠各10只（體質(zhì)量為180～220 g），用于大鼠急性毒性試驗(yàn)，以最大耐受劑量20.00 g/kg（以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)）進(jìn)行灌胃；選取昆明種小鼠雌雄各25只（體質(zhì)量為25～30 g），隨機(jī)分為五組，每組10只，雌雄各半，用于小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，設(shè)置高（10.00 g/kg）、中（5.00 g/kg）、低（2.50 g/kg）三個(gè)劑量處理組和溶劑對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組（CP，40.00 mg/kg，按小鼠體質(zhì)量計(jì)，下同）；受試樣品配制：取適量樣品研碎，分別稱取10.00 g、5.00 g、2.50 g加蒸餾水至20.00 mL，混合均勻，配制成質(zhì)量濃度為50.00%、25.00%、12.50%的混懸液，備用。選取雄性昆明種小鼠50只（體質(zhì)量為25～35 g），將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，用于小鼠精子畸形試驗(yàn)，設(shè)置高（10.00 g/kg）、中（5.00 g/kg）、低（2.50 g/kg）三個(gè)劑量處理組和溶劑對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組（CP，40.00 mg/kg）；受試樣品配制：取適量樣品研碎，分別稱取10.00 g、5.00 g、2.50 g加蒸餾水至20.00 mL，混合均勻，配制成濃度為50.00%、25.00%、12.50%的混懸液，備用。選取離乳SD大鼠雌雄各40只（體質(zhì)量為60～95 g），隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，用于30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，以人體推薦量的100、50、25倍設(shè)置劑量組，即4.00、2.00、1.00 g/kg三個(gè)劑量組，另設(shè)陰性對照組（蒸餾水）。受試樣品配制：取適量樣品研碎，分別稱取4.00 g、2.00 g、1.00 g加蒸餾水至20.00 mL，混合均勻，配制成質(zhì)量濃度為20.00%、10.00%、5.00%的混懸液，備用[14]。

1.2.3 免疫功能評價(jià)試驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞免疫試驗(yàn)

小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）試驗(yàn)：各組小鼠在灌胃處理的第26 d，于腹腔處注入2.00%（V/V）的綿陽紅細(xì)胞（SRBC）0.20 mL，用于致敏小鼠，在致敏后的第4天，于每只小鼠的左后跖部皮下注射20 μL 20.00%（V/V）SRBC進(jìn)行攻擊。在用第二次注射SRBC的前后各24 h對小鼠左后足跖的厚度進(jìn)行測量，并用SRBC攻擊前后小鼠足跖的厚度差作為免疫激活指標(biāo)[13]。

刀豆蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：將小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液并調(diào)整為每毫升3×106個(gè)細(xì)胞，將每一份細(xì)胞懸液分為兩孔，以每孔1.00 mL的劑量加到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別為試驗(yàn)組和對照組。其中實(shí)驗(yàn)組孔中額外添加ConA溶液75 μL，對照組不做任何處理，置于37 ℃、5.00% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68 h。之后吸取0.70 mL上清液棄掉，并向各孔中加入0.70 mL RPMI1640培養(yǎng)液和50 μL MTT（5 mg/mL），于同一條件下再次培養(yǎng)4 h后，加入1.00 mL酸性異丙醇，紫色結(jié)晶完全溶解后，用紫外分光光度計(jì)測定其在570 nm處的吸光度值（OD）[13]。

1.2.3.2 體液免疫實(shí)驗(yàn)

抗體生成細(xì)胞檢測：將各組小鼠于腹腔處注入0.20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.00% SRBC，用于致敏小鼠，在致敏4 d后，取小鼠的脾臟制成細(xì)胞懸液（每毫升5×106個(gè)細(xì)胞）?；旌?%（m/V）的瓊脂糖凝膠與相同體積2倍濃度的Hank's液，以每管0.50 mL的體積轉(zhuǎn)移至小試管中，同時(shí)向試管中加入50 μL 10%的SRBC，20 μL脾細(xì)胞懸液，混勻。然后傾注入鋪有瓊脂底層的載玻片上，待瓊脂凝固后于CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。孵育結(jié)束之后，再加入一定量補(bǔ)體，之后轉(zhuǎn)移載玻片至培養(yǎng)箱內(nèi)并在同一條件下再次孵育1.5 h，觀察玻片上的溶血空斑數(shù)[13]。

血清溶血素的測定：在對小鼠進(jìn)行灌胃處理的第26天，將各組小鼠于腹腔處注射0.20 mL的2.00%（V/V）SRBC懸液，連續(xù)免疫4 d。4 d后，于眼球處采血，室溫靜置后通過水平離心方法分離得到血清，將100 μL用生理鹽水稀釋過的血清轉(zhuǎn)移至微量血凝板內(nèi)，同時(shí)向孔內(nèi)添加等量0.50% SRBC，用移液槍混合均勻。將微量血凝板轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫箱中溫育3 h，使其中物質(zhì)反應(yīng)徹底。具體測定時(shí)，取其上清液以測定在波長為540 nm處的OD值，用以統(tǒng)計(jì)血球凝集度[13]。

1.2.3.3 單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性測定

小鼠碳廓清試驗(yàn)：在小鼠尾部靜脈注射印度墨汁，于不同時(shí)間點(diǎn)在小鼠眼眶處取血20.00 μL，加到提前準(zhǔn)備好的2.00 mL 0.10%的碳酸鈉溶液中，用移液槍將樣品混合均勻，測定其在600 nm處的光密度值（OD）。測量小鼠體質(zhì)量并取其肝臟和脾臟分別稱其質(zhì)量。按下述公式（1）計(jì)算出吞噬指數(shù)（a）。

式中：

Ta——吞噬指數(shù)（a）；

M——小鼠體質(zhì)量，g；

M肝——小鼠肝臟質(zhì)量，g；

M脾——小鼠脾臟質(zhì)量，g；

OD1、OD2——注射后2、10 min時(shí)取血處理后所測得的光密度值[13]。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)：在各組小鼠的腹腔處注射1.00 mL的20% SRBC，于注射結(jié)束30 min后處死小鼠，再經(jīng)腹腔注射2.00 mL生理鹽水后吸取1.00 mL腹腔洗液制成細(xì)胞涂片。統(tǒng)計(jì)所制涂片中對雞紅細(xì)胞具有吞噬能力的巨噬細(xì)胞的數(shù)量和被吞噬的雞紅細(xì)胞的數(shù)量以及其被消化的程度，以此計(jì)算細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)（b）[13]。

式中：

S——吞噬百分?jǐn)?shù)，%；

Tb——吞噬指數(shù)（b）；

n——計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞總數(shù)；

n1——吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)；

n2——被吞噬的紅細(xì)胞數(shù)。

NK細(xì)胞活性測定：各取100 μL靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞（1∶50），轉(zhuǎn)移至U型96孔板中，向其中一孔中添加100 μL靶細(xì)胞和相同體積的培養(yǎng)液，即靶細(xì)胞自然釋放孔；另一孔中加入相同體積的靶細(xì)胞和1% NP40，即靶細(xì)胞最大釋放孔；兩孔均設(shè)置三組平行孔，于CO2體積分?jǐn)?shù)為5.00%的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，1 500 r/min離心5 min，取一普通96孔培養(yǎng)板，向各孔中添加100 μL LDH基質(zhì)液，將U型96孔培養(yǎng)板中各孔取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至其中，在室溫下孵育8 min后于每孔內(nèi)加入30 μL濃度為1 mol/L的HCl溶液，并用酶標(biāo)儀測得混合液于490 nm波長處的OD值。按照公式（4）計(jì)算NK細(xì)胞的活性[13]。

式中：

H——NK細(xì)胞活性，%；

OD反——反應(yīng)孔OD值；

OD自——自然釋放孔OD值；

OD最——最大釋放孔OD值。

1.2.4 安全性評價(jià)試驗(yàn)

1.2.4.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)

對大鼠進(jìn)行禁食處理，期間對其飲水不做限制，處理16 h后將受試樣品以20.00 mL/kg的體積灌胃給大鼠。在對大鼠進(jìn)行灌胃處理后14 d，每日觀察其是否有中毒癥狀或死亡情況出現(xiàn)，分別于灌胃之后第7天、第14天稱其體質(zhì)量，并在第14天稱重之后解剖大鼠，檢查其臟器是否有異常改變出現(xiàn)[14]。

1.2.4.2 遺傳毒性試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)：用不同的間接致突變物（每皿10 μg 2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100菌株，每皿50.00 μg 1,8-二羥基蒽醌用于TA102菌株）測定經(jīng)誘導(dǎo)后的大鼠肝微粒體酶（S-9）的活性。試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片設(shè)每皿5 000.00、1 000.00、200.00、40.00、8.00 μg五個(gè)劑量組并設(shè)置溶劑對照組、自發(fā)回變組和陽性對照組。在添加與未添加誘導(dǎo)后大鼠肝微粒體酶的試驗(yàn)條件下采用平板摻入法試驗(yàn)進(jìn)行檢測，每個(gè)組均設(shè)置三個(gè)平行皿[14]。

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：在首次對小鼠進(jìn)行灌胃處理的24 h后再次對其灌胃給樣，在進(jìn)行二次灌胃處理的6 h后取小鼠股骨處的骨髓制成骨髓涂片，觀察各小鼠的嗜多染紅細(xì)胞（PCE）及其中的微核細(xì)胞數(shù)、嗜多染紅細(xì)胞中成熟紅細(xì)胞數(shù)（NCE），并計(jì)算二者比值（PCE/NCE）及微核的千分率[14]。

小鼠精子畸形試驗(yàn)：連續(xù)灌胃給樣5 d。在最后一次灌胃的30 d后，取小鼠兩側(cè)附睪制成涂片，各小鼠統(tǒng)計(jì)一千條完整的精子，記錄精子涂片中畸形精子數(shù)量和具體畸形類型并以此計(jì)算出各組小鼠的精子畸形率[14]。

1.2.4.3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

在30 d試驗(yàn)期內(nèi)，每天以10.00 mL/kg的容量對大鼠進(jìn)行灌胃處理一次，期間每日觀察大鼠的一般行為表現(xiàn)，觀察大鼠是否有中毒癥狀和死亡情況出現(xiàn)，每星期記錄一次大鼠體質(zhì)量和二次食物攝入量，用以計(jì)算大鼠每星期的食物利用率和試驗(yàn)期間的總食物利用率，在試驗(yàn)期間不限制大鼠的進(jìn)食及飲水。在試驗(yàn)結(jié)束后的16 h內(nèi)對大鼠進(jìn)行禁食處理，稱量其空腹體質(zhì)量，測定其血液學(xué)指標(biāo)和血液生化學(xué)指標(biāo)，之后解剖大鼠觀察內(nèi)臟是否發(fā)生改變及具體改變情況，取其肝、腎、脾、睪丸作組織病理學(xué)檢查并稱量各臟器的濕質(zhì)量，用以計(jì)算其臟器質(zhì)量/體質(zhì)量比值[14]。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用SPSS 21.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、Dunnett比較或方差分析[13,14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 參貝咀嚼片對小鼠體質(zhì)量及淋巴器官/體質(zhì)量比值的影響

采用三種劑量的參貝咀嚼片每日灌胃小鼠，持續(xù)30 d。結(jié)果如圖1所示，處理組小鼠增加質(zhì)量在20.60～20.90 g，與對照組（20.50 g）相比，沒有顯著性差異（p＞0.05）；三個(gè)劑量組小鼠的胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量比分別為2.88/103、2.97/103、2.92/103，與對照組（2.90/103）相比，沒有顯著性差異（p＞0.05）；各劑量組小鼠脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量（3.18/103、3.36/103、3.33/103）比與對照組（3.50/103）相比，沒有顯著差異（p＞0.05），即試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片對小鼠的體質(zhì)量增長、胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量比和脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量比沒有明顯影響。

圖1 參貝咀嚼片對小鼠體質(zhì)量（a）、胸腺/體質(zhì)量比值（b）、脾臟/體質(zhì)量比值（c）的影響Fig.1 Effects of Ginseng - Fritillaria chewable tablet on body weight (a), thymus/body weight ratio (b), spleen/body weight ratio (c) in mice

2.2 參貝咀嚼片對細(xì)胞免疫功能的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）為一類由T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，是評價(jià)中藥和天然活性物質(zhì)免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一[15]。在對小鼠進(jìn)行三種劑量的參貝咀嚼片灌胃處理30 d后，檢測并記錄小鼠各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果如圖2a所示，高劑量組小鼠經(jīng)SRBC誘導(dǎo)的左后足跖厚度為0.60 mm，與陰性對照組相比，增加了17.65%，且差異顯著（p＜0.05）。

刀豆蛋白A（ConA）是一種特異性T細(xì)胞分裂原，由ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖常用于評價(jià)保健食品的免疫增強(qiáng)效果[16]。高劑量和中劑量參貝咀嚼片處理組中，ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化增殖反應(yīng)有輕度的增強(qiáng)作用，其OD差值分別為0.14和0.15，但與對照組相比（0.13），差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著（p＞0.05），低劑量組OD差值與對照組相比亦無顯著性差異（p＞0.05）（如圖2b）。綜合上述兩項(xiàng)結(jié)果，說明參貝咀嚼片能夠提升小鼠細(xì)胞免疫功能。

圖2 參貝咀嚼片對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（a）、ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力（b）的影響Fig.2 Effects of Ginseng - Fritillaria chewable tablet on delayed type hypersensitivity (a), ConA-induced splenic lymphocyte transformation (b), lymphoid organ/body weight ratio of mice

2.3 參貝咀嚼片對體液免疫功能影響

在對小鼠以不同劑量的參貝咀嚼片灌胃30 d后，測得各項(xiàng)體液免疫相關(guān)指標(biāo)變化情況如圖3所示，小鼠溶血空斑數(shù)和小鼠溶血素濃度均隨參貝咀嚼片劑量的上升而上升，高劑量組小鼠溶血空斑數(shù)（每106個(gè)脾細(xì)胞1 062個(gè)）與對照組（每106個(gè)脾細(xì)胞950個(gè)）相比有顯著提升（p＜0.05）。在血清溶血素水平方面，高劑量組小鼠的抗體積數(shù)（184.10）與對照組（165.90）相比亦有顯著提升（p＜0.05）。由此表明，參貝咀嚼片可以增加抗體生成細(xì)胞數(shù)量，提升血清溶血素水平，具有增強(qiáng)機(jī)體體液免疫的潛力。

圖3 參貝咀嚼片對小鼠抗體生成細(xì)胞功能（a）和小鼠溶血素水平（b）的影響Fig.3 Effects of Ginseng-Fritillaria chewable tablet on antibodyproducing cell function (a) and hemolysin level (b) in mice

2.4 參貝咀嚼片對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性的影響

使用不同劑量參貝咀嚼片對小鼠經(jīng)口灌胃給樣，各組小鼠進(jìn)行碳粒廓清試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定。結(jié)果如表1所示，高劑量組小鼠的碳廓清能力為7.04，與對照組（5.72）相比有顯著性提升（p＜0.05）。在巨噬細(xì)胞吞噬功能方面，高劑量組的吞噬百分率（31.10%）與對照組（28.80%）相比有顯著性提升（p＜0.05）。且上述指標(biāo)的增加程度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。但在NK細(xì)胞活性方面，各劑量組與陰性對照組相比，均沒有顯著性變化（p＞0.05）（表1）。由此表明，參貝咀嚼片可以有效提升小鼠碳粒廓清能力和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提升機(jī)體的免疫清除能力。但是，在所測試劑量范圍內(nèi)，參貝咀嚼片對NK細(xì)胞的活性沒有顯著影響。

2.5 參貝咀嚼片安全性評價(jià)結(jié)果

2.5.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

將參貝咀嚼片按大鼠的最大耐受劑量（MTD）（20.00 g/kg）進(jìn)行灌胃。在14 d觀察期內(nèi)，大鼠生長良好、行為正常、反應(yīng)敏捷，無中毒癥狀，無大鼠死亡（表2）。在體質(zhì)量增加方面，雌、雄大鼠在第7天體質(zhì)量增長率分別為12.92%和22.46%，第14天體質(zhì)量增長率分別為24.44%和41.33%，增長與歷史對照相當(dāng)。上述結(jié)果說明雌、雄大鼠的急性經(jīng)口毒性MTD均大于20.00 g/kg。觀察期過后解剖大鼠，檢查其主要臟器，結(jié)果顯示大鼠的主要臟器均沒有出現(xiàn)明顯異常。即試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片屬于無毒級產(chǎn)品。

2.5.2 遺傳毒性試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，不論體系中是否存在S-9，各參貝咀嚼片劑量組的回變菌落數(shù)于溶劑對照組相比，差異最大為5.77%，且所有劑量組的回變菌落數(shù)均小于二倍的自發(fā)回變菌落數(shù)，也沒有劑量-反應(yīng)關(guān)系的存在，該結(jié)果表明試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片沒有誘發(fā)菌株突變的能力。

表1 參貝咀嚼片對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性的影響Table 1 Effects of Ginseng - Fritillaria chewable tablet on the function of monocyte - macrophage and NK cell activity in mice (±s)

表1 參貝咀嚼片對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性的影響Table 1 Effects of Ginseng - Fritillaria chewable tablet on the function of monocyte - macrophage and NK cell activity in mice (±s)

注：各劑量組與陰性對照組比較，*表示p＜0.05。

組別 劑量/(g/kg) 吞噬指數(shù)a p值吞噬百分率/% p值吞噬指數(shù)b p值NK細(xì)胞活性/% p值高劑量 1.20 7.04±1.04* 0.03 31.10±2.00* 0.02 0.83±0.10*0.04 33.69±2.73 1.00中劑量 0.80 6.74±0.88 0.11 30.50±1.70 0.10 0.78±0.08 0.38 32.56±2.18 0.71低劑量 0.40 6.32±0.94 0.47 29.80±1.70 0.46 0.76±0.08 0.74 33.02±2.50 0.94陰性對照 0.00 5.72±1.44 - 28.80±1.70 - 0.74±0.07 - 33.53±2.46 -

表2 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of acute toxicity test in rats (±s)

表2 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of acute toxicity test in rats (±s)

性別 動(dòng)物數(shù)/只 劑量/(g/kg) 初始體質(zhì)量/g第7天體質(zhì)量/g第14天體質(zhì)量/g 出現(xiàn)中毒癥狀動(dòng)物數(shù)/只 死亡數(shù)/只雌性 10 20.00 192.70±12.20 217.60±12.90 239.80±17.60 0 0雄性 10 20.00 203.00±12.20 248.60±14.90 286.70±19.20 0 0

表3 Ames試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Ames test (±s)

表3 Ames試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Ames test (±s)

注：以上結(jié)果為3個(gè)平皿的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

劑量/(μg，按每皿計(jì))TA97 TA98-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000.00 147.00±7.00 149.00±10.10 34.30±4.00 35.30±4.00 1000.00 150.30±9.00 151.70±10.00 35.00±4.00 35.70±3.10 200.00 153.30±11.10 152.30±9.10 35.70±2.50 35.30±3.50 40.00 154.30±8.30 153.30±11.10 35.70±4.00 35.00±3.00 8.00 153.30±10.00 154.70±8.70 34.70±3.10 34.30±3.50溶劑對照 156.00±11.10 151.70±11.00 34.00±3.00 34.70±2.10自發(fā)回變 157.30±7.50 152.00±9.50 34.70±3.50 36.00±2.60陽性對照 2194.30±56.40 1716.00±145.90 1148.30±32.20 5324.70±103.80敵克松每皿50.00 μg 2-AF每皿10.00 μg敵克松每皿50.00 μg 2-AF每皿10.00 μg劑量/(μg，按每皿計(jì))TA100 TA102-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000.00 170.70±9.00 171.30±9.60 268.70±13.60 267.70±14.20 1000.00 167.70±10.00 176.00±8.00 279.30±14.00 281.70±16.50 200.00 167.30±9.00 170.00±11.10 278.00±19.70 275.70±16.20 40.00 171.70±10.00 171.30±8.10 278.70±21.20 276.00±15.10 8.00 173.70±10.00 171.30±10.30 274.00±16.70 278.30±15.60溶劑對照 167.70±9.00 173.00±8.50 274.70±13.60 274.70±18.60自發(fā)回變 175.00±6.00 173.00±10.10 277.00±14.40 279.30±14.00陽性對照 2976.00±157.50 3041.30±76.80 786.70±57.10 833.30±49.20 NaN3每皿1.50 μg 2-AF每皿10.00 μg敵克松每皿50.00 μg 1,8-二羥基蒽酮每皿50.00 μg

表4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，各劑量組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率范圍在0.80至1.00，溶劑對照組為1.20，二者無顯著性差異（p＞0.05）。而環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核率與溶劑對照組相比有極顯著性差異（p＜0.01）。各劑量的PCE/NCE比值均在正常值范圍內(nèi)，且PCE占紅細(xì)胞總數(shù)的比例均不少于溶劑對照組的20%，與溶劑對照組比較也無明顯差異。由此，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表明，參貝咀嚼片在體內(nèi)對小鼠骨髓細(xì)胞沒有致突變作用。

精子畸形類型主要表現(xiàn)以無定形、無鉤、香蕉形和胖頭為主。小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，高、中、低三個(gè)劑量組的精子畸形率分別為1.65%、1.70%、1.66%，與溶劑對照組（1.65%）相比，無顯著差異（p＞0.05），而環(huán)磷酰胺陽性對照組（6.76%）與溶劑對照組比較，差異性極顯著（p＜0.01）。表明參貝咀嚼片對小鼠精子無致畸性作用。

表5 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of sperm malformation test in mice

圖4 參貝咀嚼片對大鼠體質(zhì)量（a/b）、進(jìn)食量（c）及總食物利用率（d）的影響Fig.4 Effects of Ginseng-Fritillaria chewable tablet on weight (a/b), total food intake (c) and total food utilization (d) of rats

2.5.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

在用不同劑量灌胃的30 d期間內(nèi)，各劑量組的大鼠健康狀況良好，無中毒癥狀存在，體質(zhì)量正常上升且與對照組水平相當(dāng)。大鼠在試驗(yàn)期內(nèi)各星期的體質(zhì)量及該星期的食物利用率如圖4所示，各劑量組雌性大鼠的總增加質(zhì)量范圍在102.70～105.40 g，雄性大鼠總增加質(zhì)量范圍在180.10～181.40 g，與雌、雄對照組（103.00 g、179.30 g）相比，均無顯著性差異（p＞0.05）。另外，各劑量組大鼠的總進(jìn)食量和食物利用率與對照組相比差異均不顯著（p＞0.05）。上述結(jié)果表明試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片在大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及食物利用率方面沒有明顯影響。

參貝咀嚼片對大鼠血液生化指標(biāo)影響試驗(yàn)結(jié)果見圖5，處理組雌、雄性大鼠的白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量方面與對照組相比，無顯著性差異（p＞0.05）（圖5a～5c）。在骨髓細(xì)胞組成比例方面，各處理組小鼠的的粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞含量比與對照組相比差異亦不顯著（p＞0.05）（圖5d～5e）。由此表明，參貝咀嚼片對大鼠的血液生化指標(biāo)不存在明顯影響。

參貝咀嚼片對大鼠臟體比影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量組雌、雄大鼠的肝/體比、脾/體比、腎/體比以及雄鼠的睪丸/體比與對照組比較，差異均不顯著（p＞0.05）。說明參貝咀嚼片對大鼠的臟體沒有明顯影響。對大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胃腸、睪丸、卵巢進(jìn)行病理學(xué)檢查，結(jié)果為：高劑量組大鼠與溶劑對照組中均觀察到1例雌鼠輕度肝小葉空泡變、2例雄鼠輕度肝小葉空泡變，而肝小葉空泡變屬于動(dòng)物自發(fā)輕型病變，未發(fā)現(xiàn)各劑量組參貝咀嚼片有引起大鼠組織發(fā)生中毒性損傷改變的情況。上述結(jié)果表明試驗(yàn)樣品參貝咀嚼片沒有誘導(dǎo)組織病變的能力。

圖5 參貝咀嚼片對大鼠血液中白細(xì)胞數(shù)量（a）、紅細(xì)胞數(shù)量（b）、血紅蛋白數(shù)量（c）、大鼠骨髓細(xì)胞各組分（d/e）的影響Fig.5 The effects of Ginseng - Fritillaria chewable tablet on the number of white blood cells (a), red blood cells (b), hemoglobin(c) and bone marrow cell components (d/e) of rats

3 討論

人參和平貝母均為我國傳統(tǒng)中藥材，擁有較廣的應(yīng)用范圍。本研究基于對中藥傳統(tǒng)功效以及現(xiàn)代科學(xué)研究數(shù)據(jù)，將人參和平貝母組合制成咀嚼片，為開發(fā)相關(guān)功保健食品提供基礎(chǔ)資料。研究結(jié)果表明，參貝咀嚼片具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞功能的能力。此外，安全性評價(jià)結(jié)果顯示，參貝咀嚼片對雌、雄大鼠的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量均大于20.00 g/kg（按小鼠體質(zhì)量計(jì)），屬于無毒級。且Ames試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果說明參貝咀嚼片沒有致突變和損害生殖系統(tǒng)能力。

人參及其制品的安全性在長期以來實(shí)踐過程中得到了驗(yàn)證，李世芬等[17]對以人參等為主要原料制得的保健產(chǎn)品參茸杞酒進(jìn)行了安全性評價(jià)，分別對小鼠急性經(jīng)口毒性、遺傳毒性進(jìn)行檢測，并進(jìn)行了30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，各項(xiàng)結(jié)果均表明該產(chǎn)品具有食用安全性?，F(xiàn)代研究表明，人參在較大劑量范圍內(nèi)對小鼠具有良好的安全性，無急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性，在高達(dá)10.16 g/kg劑量的人參粉劑服用下，對小鼠的骨髓嗜多染紅細(xì)胞突變率，小鼠精子畸形率等指標(biāo)沒有顯著性影響[18]。但在過高劑量（20.00 g/kg）的人參服用情況下，對小鼠會產(chǎn)生一定的遺傳毒性，小鼠精子畸形率由13.40%升至23.00%，但未有顯著性差異，且該毒性與陽性組（59.80%）相比明顯較少[19]。

人參具有多種藥理功能，其中包括免疫增強(qiáng)功能。人參的有效活性成分以人參皂苷為代表，具有較多的生物學(xué)功能，如抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等?，F(xiàn)有研究表明人參具有通過提高體液免疫、細(xì)胞免疫和單核-巨噬細(xì)胞功能的方式提高免疫力的作用[20-23]。曹坦等[24]通過進(jìn)行小鼠血清溶血素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中劑量（0.04 g/kg）、高劑量（0.10 g/kg）的人參不定根可使小鼠半數(shù)溶血值（111.06、137.47）較陰性組小鼠（84.74）有極顯著增加。人參制品中，人參皂苷需含量越高，免疫調(diào)節(jié)作用越強(qiáng)[25]。趙剛等[26]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3（2.00 mg/kg）可將小鼠CD3+、CD4+含量分別從42.14%、26.95%提升至48.63%、34.89%，有效增強(qiáng)并改善了H22荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫功能。張才軍等[27]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1（40 mg/kg）和人參皂苷Rh1（20 mg/kg）均對免疫功能低下小鼠的T淋巴細(xì)胞有增殖作用，兩組小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖OD570mm分別為0.18、0.19，與模型對照組（0.13）相比，有極顯著提升。本研究中高劑量參貝咀嚼片（1.20 g/kg）處理組小鼠相當(dāng)于灌胃人參皂苷Re 1.56 mg/kg。與上述兩項(xiàng)研究相比，劑量較低。從本研究結(jié)果也顯示，該劑量下參貝咀嚼片對機(jī)體免疫是一種中等增強(qiáng)。對DTH反應(yīng)有增強(qiáng)作用而對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖沒有顯著增強(qiáng)作用（圖2），對單核-巨噬細(xì)胞功能有增強(qiáng)作用而對NK細(xì)胞活性沒有顯著增強(qiáng)作用（表1）?？紤]到功能性食品的開發(fā)應(yīng)兼顧功能性、安全性、經(jīng)濟(jì)性，本文中所用人參皂苷劑量在合理范圍。但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，人參皂苷不應(yīng)低于此含量。

相比于以單獨(dú)人參為主要原料制得的保健食品，參貝咀嚼片對巨噬細(xì)胞活性增強(qiáng)效果顯著提高[28]。本研究中參貝咀嚼片增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞功能的增強(qiáng)作用與現(xiàn)有學(xué)者對人參、平貝母的免疫增強(qiáng)效果研究結(jié)果相同，但未發(fā)現(xiàn)參貝咀嚼片對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力存在顯著影響。而其他學(xué)者在利用人體細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1可以有效地抑制ConA刺激的外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性，同時(shí)能夠增加CD4＋CD25＋T細(xì)胞比例，維持Th1/Th2免疫平衡[29]，這種差異可能是由研究對象差異或者是咀嚼片中人參皂苷Rb1含量差異導(dǎo)致。

平貝母富含生物堿，且生物堿為其重要活性成分，且其亦具有提高免疫力的藥理作用。于曉龍等[30]利用流式細(xì)胞技術(shù)，研究了平貝母醇提物（0.42 g/kg）對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的吞噬百分率的影響，發(fā)現(xiàn)其可將吞噬百分率由9.29%提升至14.94%，表明平貝母擁有提高單核/巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用，有利于增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。生物堿是貝母的主要活性成分，寧貝母總生物堿（12.50 mg/kg）給小鼠分組灌胃后，可使小鼠抗體效價(jià)由232.38升至319.96，小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)從19.46%、0.43提升至36.61%、0.77，但總生物堿劑量為100 mg/kg組小鼠出現(xiàn)中毒情況，抗體效價(jià)顯著減少至134.54[31]。周劍俠等[32]研究發(fā)現(xiàn)，貝母生物堿中的貝母辛含量為33～45 mg/kg時(shí)對家兔具有致畸作用。因此，平貝母作為保健食品原料需要平衡有效劑量和安全劑量?？紤]到過高含量生物堿的毒性作用，本研究自制的參貝咀嚼片中，總生物堿含量為0.10 mg/g，高劑量組相當(dāng)于灌胃總生物堿為0.12 mg/kg。在此劑量下，安全性可以得到充分保證，同時(shí)發(fā)揮平貝母的免疫增強(qiáng)作用。

4 結(jié)論

以中草藥為原料所制得的保健食品通常具有多種保健功效，本研究對以人參和平貝母為主要原料制得的參貝咀嚼片進(jìn)行了免疫增強(qiáng)功能、安全性進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，結(jié)果顯示其具有增強(qiáng)免疫能力的效果且為無毒級保健食品，為開發(fā)相關(guān)的保健食品提供了依據(jù)，但其增強(qiáng)免疫的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。