甘薯去氫表雄酮的體外抗氧化活性與抗癌功效初探

陳蓬鳳，鄒浩峰,2，黃師榮,2，蔡芳，隋勇，熊添，施建斌，蔡沙，陳學(xué)玲，梅新*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064）

（2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭 411105）

甘薯（Ipomoea batatsLan.）又名甜薯、地瓜、番薯、白薯、紅薯等，屬旋花科草質(zhì)藤本作物，起源于熱帶美洲，于16世紀(jì)末從南洋傳入中國(guó)[1]。我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)甘薯種植面積和產(chǎn)量分別為2.37×106hm2和5.20×107t，分別占世界甘薯種植面積的30.55%和產(chǎn)量的56.62%。甘薯中含有酚醛酸（例如綠原酸，咖啡酸和二咖啡?？崴幔?、類胡蘿卜素、花青素、黏蛋白、去氫表雄酮等多種生理活性物質(zhì)。

去氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）化學(xué)名稱為3β-羥基雄甾-5-烯-17-酮，分子式為C19H28O2，分子量為288.42，是一種非共軛的△5,6-雙鍵及可酯化的3β-羥基甾體。去氫表雄酮外觀呈白色立方體晶體或結(jié)晶性粉末，不溶于水，溶于石油醚、苯、氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑。在機(jī)體內(nèi)，DHEA是制造許多甾體激素的中間體，也是睪酮和雌二醇性激素的前體物質(zhì)[2]。去氫表雄酮的硫酸鹽代謝物（DHEA-S）是含量最豐富的內(nèi)源性循環(huán)類固醇激素。DHEA具有治療肥胖、防治糖尿病、提高免疫力、保護(hù)神經(jīng)、改善卵巢功能等多種生理功效[3-9]，已應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域，目前，DHEA主要依賴于化學(xué)合成，且主要市售DHEA片劑或膠囊（青春素）均為進(jìn)口，價(jià)格不菲，成品藥在國(guó)際市場(chǎng)上的價(jià)格高達(dá)52 000元/kg[10]。

目前，DHEA主要獲取途徑是通過(guò)微生物降解或化學(xué)合成，從天然產(chǎn)物中提取DHEA并研究其體外活性的研究報(bào)道較少[11]。賀磊[12]發(fā)現(xiàn)薯皮中DHEA含量遠(yuǎn)超薯肉，預(yù)發(fā)酵時(shí)間、超聲功率、pH、提取溫度對(duì)DHEA提取有顯著影響。Ran等[13]采用超聲波-微波協(xié)同法提取甘薯渣中的DHEA，產(chǎn)量可達(dá)117.25 μg/100 g。Wang等[14]指出DHEA能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，降低胰島素抵抗。Mukohara等[15]對(duì)糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DHEA是預(yù)防糖尿病、肌腱病的有效藥物。本研究以甘薯中提取的DHEA為對(duì)象，通過(guò)對(duì)DPPH、ABTS、OH自由基清除率、總還原力的測(cè)定，旨在研究DHEA的抗氧化能力；此外研究了DHEA對(duì)α-淀粉酶、酪氨酸酶的活性抑制率，為精準(zhǔn)降低人體血糖水平及抗衰老提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用作出探索，為開發(fā)高品質(zhì)DHEA功能產(chǎn)品及甘薯天然產(chǎn)物的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉孢子粉，沂水錦潤(rùn)生物科技有限公司；甘薯，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所種質(zhì)資源圃；乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞HeLa、肺癌細(xì)胞A549，武漢恒意賽生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀、石油醚、抗壞血酸、水楊酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DHEA標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；DPPH（HPLC＞98%），梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS（HPLC＞98%），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；熊果苷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，杭州天杭生物科技有限公司；胰酶-EDTA、PBS，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；色譜甲醇，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；α-淀粉酶，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；多酚氧化酶，上海源葉生物科技有限公司；DNS顯色液，福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters alliance高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；BCM-1000型生物潔凈工作臺(tái)，蘇州鴻基潔凈科技股份有限公司；壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，SHEL LAB；倒置顯微鏡，OLYMPUS；酶標(biāo)檢測(cè)儀，Diatek；生化培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SB-5200D超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮甘薯洗凈、切片，測(cè)完水分后置于65 ℃烘箱中干燥，后磨粉過(guò)80目篩，標(biāo)記備用。

1.3.2 甘薯中DHEA提取物的制備

取少量米曲霉孢子粉于無(wú)菌條件下接種于PDA斜面培養(yǎng)基活化一周，將活化后的米曲霉孢子用無(wú)菌生理鹽水沖洗，得到米曲霉孢子懸浮液作為接種液，同時(shí)調(diào)整接種液的濃度約為每毫升1×107～3×107個(gè)。按料液比1:20（m/V，g/mL）將蒸餾水與甘薯粉末充分混勻，加入2 g/L的蛋白胨，在121 ℃下高壓滅菌得發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn)，按體積比6%（V/V）接入米曲霉孢子懸浮液，于30 ℃下發(fā)酵72 h后高溫滅菌停止發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物冷卻至室溫后于4 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，將沉淀干燥，粉碎過(guò)40目篩，按1:15料液比（m/V，g/mL）與石油醚混合超聲密閉提取3次，每次20 min，超聲功率為500 W，合并提取液，過(guò)硅膠柱純化，減壓濃縮后以色譜級(jí)甲醇定容至5 mL，得DHEA提取液。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]的方法，稍做修改。取0.1 mL不同濃度的樣品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，搖勻，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度Ai。以等量的甲醇代替樣品溶液測(cè)定空白吸光度A0。以抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率（記為F1，%），并通過(guò)計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.4 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法，稍做修改。準(zhǔn)確量取2 mL 20 mmol/L ABTS溶液和2 mL 2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，將兩溶液充分混合后在室溫且避光的條件下靜置12～16 h，取出1 mL混合液用甲醇稀釋，于734 nm下測(cè)定吸光度值，調(diào)整其吸光度至0.7左右，即可得到ABTS儲(chǔ)備工作液。

取0.1 mL樣品液與3 mL ABTS工作液，混勻后于室溫避光放置30 min，記錄734 nm波長(zhǎng)下的吸光值A(chǔ)1，以甲醇代替ABTS溶液測(cè)定不同濃度樣品溶液吸光度A2，用蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0，Vc作陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（2）計(jì)算ABTS+自由基清除率（記為F2，%），并通過(guò)計(jì)算IC50濃度（清除率為50%時(shí)所需濃度）比較樣品抗氧化能力。

1.3.5 羥基自由基清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法，稍做修改。分別吸取0.2 mL不同濃度樣品溶液，依次加入0.1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，0.1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混勻，靜置30 min，于510 nm處測(cè)定吸光度Ai，用蒸餾水代替FeSO4測(cè)定不同濃度樣品溶液吸光度Aj，用蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（3）計(jì)算羥基自由基清除率（記為F3，%），并通過(guò)計(jì)算IC50濃度比較樣品抗氧化能力。

1.3.6 還原能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法，稍做修改。取磷酸二氫鈉1.74 g、磷酸氫二鈉2.70 g與氯化鈉1.70 g，加水溶解定容至400 mL，即得pH為6.6的磷酸鹽緩沖液。

分別吸取1 mL不同濃度樣品溶液，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.6）、1%鐵氰化鉀溶液各1 mL，混勻，50 ℃水浴20 min后快速冷卻，加入1 mL 10%三氯乙酸（Trichloroacetic Acid，TCA）終止反應(yīng)，取1 mL樣液，依次加入1 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后于700 nm下測(cè)定吸光度，以相應(yīng)濃度Vc作陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定結(jié)果越高證明樣品的還原性越強(qiáng)。

1.3.7α-淀粉酶活性抑制測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19,20]的方法，稍作修改。取0.5 mL樣品溶液，以PBS緩沖液（pH值6.8）定容至1 mL，加0.5 mLα-淀粉酶溶液，搖勻后于37 ℃水浴10 min，再加0.25 mL 0.5%可溶性淀粉溶液，混勻后于37 ℃水浴10 min，加入2 mL DNS溶液，置于沸水浴5 min，待冷卻后于540 nm下測(cè)定吸光值。以不加淀粉酶作空白調(diào)零，PBS緩沖液代替樣品對(duì)照。

1.3.8 酪氨酸酶活性抑制測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]的方法，稍作修改。取0.5 mL的不同濃度的提取液，分別加入1 mL PBS緩沖液和酪氨酸酶（375 U/mL）水溶液，30 ℃水浴10 min，再加入2.5 mL 0.03% L-酪氨酸溶液混勻，水浴20 min，于475 nm下測(cè)定吸光度。以熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.9 DHEA提取物對(duì)癌細(xì)胞抑制效果

所選細(xì)胞株（乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞HeLa、肺癌細(xì)胞A549）均置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中，接種于含10%滅活胎牛血清的高糖DMEM（1640）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每周更換3次培養(yǎng)基，每2 d傳代一次，用胰蛋白酶消化傳代，通常取傳代4次、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，按每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸浮液，置于CO2（5%）培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)基更換為100 μL細(xì)胞樣品各自對(duì)應(yīng)的含有一定濃度藥物的培養(yǎng)基，對(duì)照組更換為含溶劑的培養(yǎng)基。所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值OD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 8.0、OriginPro 8.5進(jìn)行顯著性分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯DHEA提取物的純化效果

將甘薯DHEA提取物經(jīng)硅膠吸附柱純化后，進(jìn)行液相色譜分析得到色譜分離圖如圖1所示，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，樣品中DHEA的保留值為11.21 min，并結(jié)合DHEA的工作曲線：Y=35 801X-113 428（R2=0.992 2），樣品中DHEA的峰面積占比達(dá)76.44%。吳睿等[22]利用超聲波輔助提取薯皮中DHEA，利用HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅薯中DHEA保留時(shí)間約為2.70 min，并且在色譜分析中幾乎沒(méi)有雜質(zhì)干擾。因此證明甘薯DHEA提取物純化效果良好，可為進(jìn)一步提純優(yōu)化做出參考。

圖1 甘薯DHEA提取物純化后液相色譜分離圖Fig.1 Separation of DHEA extracts from sweet potato by liquid chromatography

2.2 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 DPPH自由基清除能力

圖2 純化前后的DHEA提取物的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of DHEA extracts before and after purification

以Vc為對(duì)照，純化前后DHEA對(duì)DPPH自由基清除能力如圖2所示，甘薯DHEA提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力存在極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.01）。在所選濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH自由基的清除率呈顯著地線性增加的趨勢(shì)（p＜0.05）。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)，樣品與Vc的DPPH自由基清除率均達(dá)到最高。周旭珍[23]研究甘薯清酒加工工藝時(shí)也得出一致結(jié)論，隨著樣品的用量的提高，DPPH自由基清除能力隨之增大。純化前的DHEA提取物要比純化后的DPPH自由基清除能力高，這可能是由于粗提物中含有糖苷、黃酮等其他活性物質(zhì)，對(duì)DPPH自由基產(chǎn)生一定清除能力[24,25]。而純化后的DHEA可能是由于硅膠柱吸附了一些物質(zhì)導(dǎo)致其DPPH自由基清除能力有所下降，但仍比Vc要高。通過(guò)SPSS分析，Vc、純化前、純化后樣品對(duì)DPPH自由基清除力的IC50數(shù)值分別為0.17、0.05、0.11 mg/mL，說(shuō)明甘薯DHEA提取物對(duì)DPPH自由基有較好的清除力。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

純化前后DHEA提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力的對(duì)比由圖3可知，甘薯DHEA提取物純化前后與Vc在相同濃度水平下對(duì)ABTS+自由基的清除能力存在極顯著差異（p＜0.01）。在所選濃度范圍內(nèi)，隨著各樣品濃度的增加，ABTS+自由基的清除率呈顯著地線性增加的趨勢(shì)（p＜0.05），在0.10 mg/mL時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)濃度在0.02～0.06 mg/mL時(shí)，純化前的DHEA提取物的ABTS+自由基清除率在三種樣品間最高，而純化后的樣品與Vc的ABTS+自由基清除率無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。另一方面，Vc的IC50為0.06 mg/mL；純化前的樣品IC50為0.05 mg/mL；純化后的樣品IC50為0.09 mg/mL。說(shuō)明甘薯DHEA提取物對(duì)ABTS+自由基有較好的清除力。Ji等[26]對(duì)小鼠體內(nèi)外免疫功能的影響研究發(fā)現(xiàn)，DHEA有較好的抗氧化能力，能對(duì)動(dòng)物和人的炎癥反應(yīng)提供有效保護(hù)，趙志明等[27]也得出相似結(jié)論，DHEA能能增加靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力，可能是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的有效機(jī)制之一。

圖3 純化前后DHEA提取物ABTS+自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of DHEA extracts before and after purification

2.2.3 羥基自由基清除力結(jié)果

純化前后的樣品與Vc對(duì)羥基自由基清除能力的對(duì)比由圖4可知，甘薯DHEA提取物與Vc在相同濃度下的羥基自由基清除能力存在極顯著差異（p＜0.01）。Anna等[28]研究發(fā)現(xiàn)DHEA可降低地塞米松誘導(dǎo)的兔腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激，并且能降低NADPH氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)使用DHEA處理的兔子羥基自由基生成減少，證明DHEA對(duì)羥基自由基有較好的抑制能力。在所選濃度范圍內(nèi)，羥基自由基的清除率與樣品濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)，不同濃度水平間的清除率具有極顯著差異（p＜0.01）。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)，DHEA提取物與Vc的羥基自由基清除率均達(dá)到最高。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.02～0.06 mg/mL時(shí)，純化前提取物的羥基清除力顯著高于另外二者，而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，三種樣品間的羥基自由基清除力無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。Ding等[29]研究發(fā)現(xiàn)，DHEA預(yù)處理可增加過(guò)氧化物酶活性來(lái)防止由H2O2引起的細(xì)胞氧化損傷，從而抑制羥基自由基的形成。此外，經(jīng)SPSS分析得到Vc、純化前、純化后樣品的IC50值分別為0.05、0.04、0.05 mg/mL。說(shuō)明甘薯DHEA提取物對(duì)羥基自由基有較好的清除力。

圖4 純化前后的DHEA提取物羥基自由基清除能力Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability of DHEA extracts before and after purification

2.2.4 總還原能力結(jié)果

純化前后的樣品與Vc的總還原能力的對(duì)比由圖5可知，在所選濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，吸光值越來(lái)越大，還原力呈顯著地線性增加的趨勢(shì)（p＜0.05）。由圖5可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)，樣品與Vc的總還原能力均達(dá)到最高。當(dāng)濃度為0.02 mg/mL時(shí)，各樣品間總還原力差異極顯著（p＜0.01），大小排序?yàn)椋杭兓埃炯兓螅綱c；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.04～0.06 mg/mL時(shí)，DHEA提取物純化前后同一濃度下的還原力無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；DHEA提取物純化前后和Vc三者的還原力在0.08 mg/mL和0.10 mg/mL質(zhì)量濃度下均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。楊筍等[30]曾研究DHEA對(duì)活性氧自由基的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)DHEA可明顯抑制因氧化受損引起的胸腺細(xì)胞凋亡進(jìn)而起到抗氧化損傷的作用。

圖5 純化前后DHEA提取物還原能力Fig.5 The reduction ability of DHEA extracts before and after purification

2.3 α-淀粉酶活性抑制結(jié)果

圖6 純化前后DHEA提取物的α-淀粉酶活性抑制能力Fig.6 α-amylase activity inhibition ability of DHEA extracts before and after purification

α-淀粉酶是影響人體血糖水平的重要酶之一，可通過(guò)作用α-1,4-糖苷鍵水解淀粉成低聚糖、葡萄糖等物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)造成血糖濃度升高[31]。如圖6所示，在選定的濃度范圍內(nèi)，甘薯DHEA提取物和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制作用隨濃度的升高而增大，在質(zhì)量濃度0.80 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到最大。袁向華等[32]探究了以馬鈴薯淀粉為底物時(shí)阿卡波糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)阿卡波糖在體外對(duì)胰α-淀粉酶有明顯的抑制作用，并且抑制作用隨濃度的升高而增大，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。純化后DHEA提取物的α-淀粉酶活性抑制率在2.16%～55.54%之間，并且遠(yuǎn)低于純化前樣品與陽(yáng)性對(duì)照組。由圖6可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.10～0.40 mg/mL時(shí)，純化前后的DHEA提取物與阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率差異極顯著（p＜0.01），純化后提取物的α-淀粉酶抑制率要遠(yuǎn)低于其他兩者；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.60～0.80 mg/mL時(shí)，純化前提取物與阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。DHEA純化前后以及阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性抑制的IC50值分別為：0.05、0.68、0.13 mg/mL，說(shuō)明純化前的DHEA提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制能力更高。Anna等[33]研究發(fā)現(xiàn)，DHEA會(huì)影響肝臟和腎臟中不同結(jié)合位點(diǎn)的糖異生，降低胰島素敏感性和血漿葡萄糖水平，具有一定的降血糖作用，因此將純化前的DHEA應(yīng)用到臨床治療糖尿病是未來(lái)的研究方向之一。

2.4 酪氨酸酶活性抑制結(jié)果

如圖7所示，在選定的濃度范圍，甘薯DHEA提取物和熊果苷對(duì)酪氨酸酶抑制作用隨濃度的升高而增大，在質(zhì)量濃度0.10 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，且不同樣品間的差異極顯著（p＜0.01）。從圖7中可看出，純化后DHEA提取物的酪氨酸酶活性抑制率在5.55%～50.57%之間。當(dāng)濃度在0.04 mg/mL時(shí)，純化前提取物與純化后提取物的酪氨酸酶活性抑制率無(wú)顯著性差異（p＞0.05），其他濃度水平下，純化前提取物的酪氨酸酶抑制率均顯著高于純化后提取物。純化前DHEA提取物在質(zhì)量濃度0.08 mg/mL和0.10 mg/mL濃度下的酪氨酸酶抑制率無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。通過(guò)計(jì)算得到熊果苷、純化前、純化后提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的IC50值分別為：0.07、0.07、0.10 mg/mL，說(shuō)明甘薯DHEA提取物對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用。殷復(fù)建等[34]研究發(fā)現(xiàn)，DHEA可能使機(jī)體內(nèi)分泌激素改變，同時(shí)改變某些相關(guān)基因的表達(dá)量，進(jìn)而減少機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，從而達(dá)到延緩衰老進(jìn)程的作用。Xu等[35]研究發(fā)現(xiàn)熊果苷酯通過(guò)使酪氨酸酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)更松散和更不穩(wěn)定來(lái)抑制酪氨酸酶，抑制率可達(dá)15.60%，這為之后研究DHEA對(duì)酪氨酸酶活性抑制機(jī)理提供了思路。

圖7 DHEA提取物與熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制Fig.7 Inhibition of tyrosinase activity by sweet potato DHEA extract and arbutin

2.5 對(duì)癌細(xì)胞的抑制結(jié)果

圖8 純化后DHEA提取物對(duì)三種癌細(xì)胞的影響Fig.8 Effect of purified DHEA extracts on three cancer cells

純化后的甘薯DHEA提取物對(duì)三種癌細(xì)胞的抑制效果如圖8所示。本研究選定了三種癌細(xì)胞進(jìn)行活性篩選，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DHEA提取物對(duì)肺癌細(xì)胞A549的影響存在顯著性差異（p＜0.05），對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela、乳腺癌細(xì)胞MCF-7的影響存在極顯著差異（p＜0.01）。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，在所選的濃度范圍內(nèi)，以空白組作對(duì)照，甘薯DHEA提取物僅在質(zhì)量濃度2.30 mmol/L時(shí)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用（p＜0.05），抑制率達(dá)47.50%，而其余兩種癌細(xì)胞未受到DHEA提取物的抑制作用。Rebeca等[36]對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和Hs578T進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DHEA誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞壞死增加20%，能抑制所有乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，是治療乳腺癌的有效藥物。因此，可選乳腺癌細(xì)胞MCF-7做后續(xù)抑制試驗(yàn)研究對(duì)象。唐雪峰[37]曾構(gòu)建小鼠S180荷瘤模型研究山藥DHEA提取物的抗腫瘤功效，發(fā)現(xiàn)各DHEA藥物試驗(yàn)組的抗腫瘤效果均呈劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)小鼠腫瘤有顯著地抑制效果。

3 結(jié)論

將甘薯DHEA提取物經(jīng)硅膠吸附純化后，樣品中DHEA保留值為11.21 min，峰面積占比達(dá)76.44%。通過(guò)對(duì)DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率以及還原能力的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)DHEA提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)樣品純化前后的抗氧化活性均存在極顯著差異（p＜0.01），當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)，抗氧化能力達(dá)到最強(qiáng)。由純化前后樣品以及Vc的IC50數(shù)值可以看出，DHEA提取物在純化前后均有很好的抗氧化活性。通過(guò)對(duì)α-淀粉酶、酪氨酸酶抑制率的測(cè)定分別考察甘薯DHEA提取物的降血糖、抗衰老活性，并且同時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)甘薯DHEA提取物在純化前后均具有一定的抗衰老、降血糖效果。純化后DHEA提取物的α-淀粉酶活性抑制率在2.16%～55.54%之間，酪氨酸酶活性抑制率在5.55%～50.57%之間。此外，選取了三種癌細(xì)胞（肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela、乳腺癌細(xì)胞MCF-7）作為DHEA對(duì)癌細(xì)胞抑制作用的活性篩選，通過(guò)與空白對(duì)照發(fā)現(xiàn)純化后的DHEA提取物僅對(duì)MCF-7細(xì)胞在2.30 mmol/L質(zhì)量濃度時(shí)有顯著的抑制效果，而對(duì)其他兩種癌細(xì)胞無(wú)顯著的抑制效果。本研究通過(guò)對(duì)甘薯DHEA提取物的體外抗氧化、降血糖、抗衰老及癌細(xì)胞抑制作用的研究，為DHEA的功能性產(chǎn)品開發(fā)及甘薯天然活性成分的利用提供一定的依據(jù)。