靈芝孢子油番茄紅素復合物的抗腫瘤作用

井子良，吳純宇，張慧敏，孫建博*

（1.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009）（2.江蘇盛世康禾生物技術有限公司，江蘇常州 213032）

在腫瘤治療過程中，中草藥以及天然植物毒副作用少、臨床應用廣、提高免疫能力明顯，是輔助腫瘤治療的最佳藥物。靈芝是一味歷史悠久的中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品藥材，是最受推崇的中藥之一。靈芝孢子油是從破壁的靈芝孢子粉中提取得到的油狀脂質物，含有三萜及甾醇類、核苷類、脂肪酸、維生素等多種成分[1]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明靈芝具有調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力、改善心腦血管和呼吸功能等功效[1]。此外，靈芝及其提取物不僅可通過提高免疫力抑制腫瘤，還具有直接抗腫瘤作用，且其抑瘤作用呈濃度依賴性[1]。番茄紅素結構中存在的大量不飽和雙鍵，能夠有效地吸收長波和淬滅單線態(tài)氧，是自然界中抗氧化能力極強的疏水性無環(huán)類胡蘿卜素，抗氧化能力是維生素E的100倍[2]。番茄紅素具有防治糖尿病血管并發(fā)癥、增強免疫力、預防前列腺癌和心血管疾病等功能[3,4]。已有研究證實，番茄紅素還能在一定程度上抑制胃癌、卵巢癌等癌癥的進展[3,4]。

靈芝孢子油番茄紅素復合物（LZFQ）是將靈芝孢子油作為主要成分，加入適量番茄紅素作為輔料復合配比組成，復方中總三萜含量占比22.22%，番茄紅素含量占比16.67%。該復合物有望通過靈芝孢子油和番茄紅素的協(xié)同作用發(fā)揮有效的抗腫瘤活性。本實驗研究了LZFQ對人非小細胞肺癌細胞（A549）、人胃癌細胞（BGC823）、人乳腺癌細胞（MCF-7）和人結腸癌細胞（HCT116）的生長活性影響，通過裸鼠移植瘤模型研究LZFQ在體內(nèi)對腫瘤的抑制作用，并對LZFQ的抗腫瘤活性機制進行初步探討，旨在證實靈芝孢子油和番茄紅素復合物具有開發(fā)為優(yōu)良抗腫瘤活性制劑的潛力，以期為靈芝孢子油和番茄紅素藥學研究和臨床應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

靈芝孢子油番茄紅素復合物（批號：20210326），購自康道生物（南通）有限公司；RPMI-1640不完全培養(yǎng)基（貨號：KGM31800-500）、DMEM不完全培養(yǎng)基（貨號：KGM12800NH-500）、胰蛋白酶（貨號：KGY0012）、PBS（貨號：KGB5001）、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KGA108），江蘇凱基生物技術股份有限公司；胎牛血清（貨號：04-001-1ACS），Biological Industries；四甲基噻唑藍（ST316），碧云天；DMSO，國藥試劑公司；環(huán)磷酰胺（批號：SLBC0666V），杭州吉諾醫(yī)藥生物科技有限公司。

1.2 細胞株

人非小細胞肺癌細胞（A549）、人胃癌細胞（BGC823）、人乳腺癌細胞（MCF-7）和人結腸癌細胞（HCT116）來源于凱基生物技術股份有限公司。

1.3 儀器與設備

60L/TOMSX-700高壓蒸汽滅菌鍋，Tomy Digital Biology；ESCO ISOtherm烘箱，新加坡藝思高科技有限公司；MSC-Advantage生物安全柜，Thermo；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱，Thermo；TDZ4A-WS臺式低速離心機，湘儀；Ts100倒置顯微鏡，Nikon；MX-F漩渦混勻儀，賽洛捷克；POLARstar多功能酶標儀，Omega；Ts2R倒置熒光顯微鏡，Nikon；Accuri C6小型流式細胞儀，BD Biosciences；FV3000激光共聚焦顯微鏡，Olympus。

1.4 MTT實驗

細胞培養(yǎng)在含10%體積分數(shù)的胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液中，并孵育在含體積分數(shù)5% CO2的恒溫（37 ℃）孵箱內(nèi)。細胞培養(yǎng)一段時間后，首先用顯微鏡觀察，判斷細胞狀態(tài)是否良好和數(shù)量是否達到80%以上，若符合以上條件，即可進行傳代，首先將舊培養(yǎng)基除去，PBS清洗；其次加入1 mL胰酶（含EDTA）消化，均勻搖晃培養(yǎng)盤，保證胰酶能與培養(yǎng)盤表面充分接觸，根據(jù)細胞種類的不同，在培養(yǎng)箱中消化不同時間（本實驗所用細胞消化時間為1～3 min），消化結束后可進行鏡檢；加入完全培養(yǎng)基終止消化，通過吹打可見細胞成流沙狀掉落，收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，除上清；最后使用培養(yǎng)基重懸細胞，將適量懸液打入培養(yǎng)盤中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中。當細胞狀態(tài)處于指數(shù)生長期時準備接種，先傾倒培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化約2 min，加入1 mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，細胞計數(shù)并稀釋至每毫升5×103個，并將細胞懸液以每孔200 μL接種于96孔板上，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ和對照藥物靈芝孢子油（LZBZ），每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h。將MTT試劑加入96孔板中（每孔20 μL），培養(yǎng)箱孵育4 h。用酶標儀在570 nm波長處測吸光值（OD值），并計算細胞抑制率和受試化合物的IC50值。

1.5 細胞凋亡實驗

將處于對數(shù)生長期的A549細胞消化下來，接種于6孔板中（每孔4×105個細胞），置于恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸去舊的培養(yǎng)基，根據(jù)組別設置加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組（DMSO）。在藥物作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化液消化細胞，加入1 mL的完全培養(yǎng)基終止消化，根據(jù)組別設置，轉移至相應的5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min。吸去上清液，加入1 mL的PBS，將細胞團塊吹打均勻后轉移至1.5 mL的離心管中，2 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入1 mL的PBS，再次離心沉淀細胞。吸去上清液，然后將細胞重懸于500 μL緩沖液中，依次加入Annexin V-FITC（5 μL）和碘化丙啶PI（5 μL），室溫避光條件下孵育15 min后用流式細胞儀在488 nm處檢測細胞凋亡情況。

1.6 Western blot實驗

將處于對數(shù)生長期的A549細胞消化下來，接種于6孔板中（每孔4×105個細胞），置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸去舊的培養(yǎng)基，根據(jù)組別設置加入不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組（DMSO）。在藥物作用24 h后，收集并用細胞裂解液（RAPI）裂解細胞，提取蛋白，將蛋白濃度稀釋至3 mg/mL（BCA定量方法），金屬浴100 ℃變性10 min。在SDS-PAGE泳道中每孔上樣10 μL，電泳1.5 h，轉膜，用質量分數(shù)1%的BSA溶液封閉。一抗4 ℃孵育過夜，吸去一抗，加入二抗孵育1 h，天能凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照，用Image J軟件處理數(shù)據(jù)。

1.7 實驗動物與飼養(yǎng)條件

BALB/c Nude裸小鼠，購自南京青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，相對濕度：60%±10%，自然光線，自由飲水進食，適應性飼養(yǎng)7 d。本實驗已獲得中國藥科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.8 動物模型的建立及分組

分別將6×106個A549細胞皮下接種于Balb/c裸鼠的小鼠背部右側皮下。飼養(yǎng)7 d后，取小鼠稱體質量，隨機分為5組，每組6只。第1組為模型對照組，第2組為LZFQ低劑量組（0.50 g/kg），第3組為LZFQ中劑量組（1.00 g/kg），第4組為LZFQ高劑量組（2.00 g/kg），第5組為環(huán)磷酰胺組（0.075 g/kg）。每2 d測量一次體質量，在連續(xù)14 d的灌胃喂食后，將所有小鼠處死并稱其質量，解剖剝離瘤塊，并稱其質量。根據(jù)公式（1）計算腫瘤抑制率。

式中：

S——腫瘤抑制率，%；

C——給藥組平均瘤重，g；

T——對照組平均瘤重，g。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

所有的數(shù)據(jù)結果均以±s表示，采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件行組間單因素方差分析，多組間比較行F值檢驗，組間對比行獨立樣本t檢驗，若p＜0.05則表示存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 MTT實驗結果

采用MTT法對LZFQ進行了體外抗腫瘤活性測試，并以LZBZ為陽性對照，測定了它們對人非小細胞肺癌細胞（A549）、人胃癌細胞（BGC823）、人乳腺癌細胞（MCF-7）和人結腸癌細胞（HCT116）的抑制活性（表1）。結果如表1所示，相較于靈芝孢子油，LZFQ對人非小細胞肺癌細胞（IC50=0.49 mg/mL）、人乳腺癌細胞（IC50=0.53 mg/mL）和人結腸癌細胞（IC50=0.61 mg/mL）有不同程度的提高。其中LZFQ對A549細胞的IC50值為0.49 mg/mL，在四種癌細胞中抗腫瘤活性最好，因此，選取A549細胞對LZFQ進行抗腫瘤機制研究。

表1 LZFQ對4種腫瘤細胞的抗增殖作用Table 1 Antiproliferative effects of LZFQ on four tumor cells(mg/mL,±s, n=3)

表1 LZFQ對4種腫瘤細胞的抗增殖作用Table 1 Antiproliferative effects of LZFQ on four tumor cells(mg/mL,±s, n=3)

注：*p＜0.05，**p＜0.01 vs A549 by LZFQ。

組別 IC50/(mg/mL)A549 BGC823 MCF-7 HCT116 LZFQ 0.49±0.02 0.58±0.04* 0.53±0.01* 0.61±0.04**LZBZ 0.54±0.03 0.56±0.04 0.58±0.05 0.66±0.03

2.2 LZFQ誘導A549細胞凋亡

為了確定LZFQ是否誘導A549細胞凋亡，在A549細胞中采用annexin V-FITC/PI雙染色法來研究。如圖1所示，A549細胞在不同濃度（0.125、0.25、0.50 mg/mL）的LZFQ作用48 h后，早期（annexin-V+/PI）和晚期（annexin-V+/PI+）凋亡細胞比例分別為11.20%、20.50%和25.30%。結果表明LZFQ可以濃度依賴性的誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖1 不同濃度LZFQ對A549細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of different concentration of LZFQ on apoptotic in A549 cell (±s, n=3)

2.3 LZFQ對凋亡相關蛋白的影響

表2 LZFQ對凋亡相關蛋白的影響Table 2 Effects of LZFQ on the apoptosis related proteins.(±s, n=3)

表2 LZFQ對凋亡相關蛋白的影響Table 2 Effects of LZFQ on the apoptosis related proteins.(±s, n=3)

注：*p＜0.05；**p＜0.01 vs DMSO group。

LZFQ/(mg/mL) Ratio of apoptosis related proteins/GAPDH Bcl-2 Bax Cleaved-caspase-3 0 0.91±0.07 0.18±0.01 0.25±0.03 0.125 0.85±0.08 0.23±0.03 0.37±0.05*0.25 0.60±0.04* 0.36±0.02* 0.59±0.02**0.50 0.42±0.05** 0.44±0.04** 0.68±0.04**

下調(diào)Bcl-2（抗凋亡蛋白）水平及上調(diào)Bax（促凋亡蛋白）水平可激活凋亡通路。為進一步闡明LZFQ的促凋亡機制，測試了其對凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase-3的影響作用。實驗結果如表2所示，隨著給藥濃度逐漸升高（0、0.125、0.25、0.50 mg/mL），LZFQ濃度依賴性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平（Bcl-2/GAPDH為0.91、0.85、0.60、0.42）、并提高促凋亡蛋白Bax（Bax/GAPDH為0.18、0.23、0.36、0.44）及Caspase-3（Cleaved-Caspase-3/GAPDH為0.25、0.37、0.59、0.68）的水平。本實驗表明，LZFQ能夠影響癌細胞中凋亡相關蛋白的水平，從而發(fā)揮誘導癌細胞凋亡的作用。

2.4 LZFQ對小鼠體內(nèi)移植瘤的影響

為了評價LZFQ在體內(nèi)的抗腫瘤活性，將A549細胞接種于小鼠背部右側皮下，建立小鼠肺腺癌異種移植瘤模型。結果如表3所示，LZFQ低、中、高劑量組對A549荷瘤小鼠抑瘤率分別為43.27%、51.92%、60.58%，三種劑量組明顯減小了腫瘤質量，與模型對照組相比有顯著性差異（p＜0.01）。陽性對照組腫瘤顯著減小，與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。另外，LZFQ低、中、高劑量給藥荷瘤小鼠與模型組實驗前后各組體重基本一致（分別為22.52、22.49和23.08 g），而環(huán)磷酰胺組體重有所降低（18.34 g），表明LZFQ對體重沒有顯著影響。

靈芝孢子油是從破壁的靈芝孢子中提取的脂質活性物，目前主要的提取方法包括索式提取法、超臨界CO2萃取法、超聲波提取法以及水酶法。靈芝孢子油富含三萜類、核苷類及部分多糖類化合物，是靈芝孢子有效成分的集合體[5,6]。隨著靈芝孢子油提取工藝和方法的進步，人們對靈芝孢子油的研究日益重視和深入?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子油具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、降血脂和保肝護肝等活性[6,7]。在抗腫瘤方面，靈芝孢子油能顯著誘導多種腫瘤細胞凋亡，這與其上調(diào)Bax同時下調(diào)Bcl-2和VEGF的mRNA表達水平，降低線粒體膜電位和細胞色素c的釋放等關鍵因素有關[8-13]。番茄紅素是一種天然類胡蘿卜素，是由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成的直鏈碳氫化合物，主要存在于成熟的番茄、西瓜、番石榴、玫瑰果、木瓜和葡萄柚等果實中[14]。人體自身不能合成番茄紅素，其攝入量的85%來源于番茄和以番茄為基礎的產(chǎn)品[15]。藥理研究表明，番茄紅素在抗氧化、提高機體免疫力等方面具有較好的作用[16-26]，因而被廣泛應用于保健品、化妝品中。

表3 LZFQ對A549荷瘤小鼠腫瘤質量的影響Table 3 Inhibitory effects of LZFQ on tumor growth in A549 tumor-bearing mice (±s, n=6)

表3 LZFQ對A549荷瘤小鼠腫瘤質量的影響Table 3 Inhibitory effects of LZFQ on tumor growth in A549 tumor-bearing mice (±s, n=6)

注：與模型對照組相比*p＜0.05，**p＜0.01。

組別 劑量/(g/kg) 腫瘤質量/g 平均抑瘤率/% 小鼠體質量/g模型對照組 - 1.04±0.09 - 23.16±0.14 LZFQ低劑量組 0.50 0.59±0.03** 43.27 22.52±0.19 LZFQ中劑量組 1.00 0.50±0.03** 51.92 22.49±0.23 LZFQ高劑量組 2.00 0.41±0.02** 60.58 23.08±0.21 LZBZ組 2.00 0.45±0.03** 56.73 21.27±0.17 CTX組 0.075 0.38±0.04** 63.46 18.34±0.16

體外抗腫瘤活性實驗表明靈芝孢子油番茄紅素復合物具有和靈芝孢子油本身類似或更好的抗腫瘤活性。體內(nèi)移植瘤實驗也證明，靈芝孢子油番茄紅素復合物與靈芝孢子油本身一樣也能夠抑制體內(nèi)移植瘤的生長。這可能和靈芝孢子油與番茄紅素發(fā)揮協(xié)同作用有關。

3 結論

本研究表明靈芝孢子油番茄紅素復合物（LZFQ）在體內(nèi)外均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，LZFQ對A549細胞抑制活性最佳（IC50=0.49 mg/mL），優(yōu)于環(huán)磷酰胺（IC50=0.51 mg/mL）。LZFQ可以通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞，并且濃度依賴性地降低抑凋亡蛋白Bcl-2的水平并提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的水平。體內(nèi)移植瘤實驗表明，LZFQ能夠抑制體內(nèi)移植瘤的生長。在后續(xù)研究中，將從靈芝孢子油和番茄紅素的協(xié)同作用入手，進一步深入探究二者相互作用?？偟膩碚f，本研究成果可為靈芝孢子油類復合物產(chǎn)品的研發(fā)提供實驗依據(jù)。