無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

李保宏，李忠原，劉苗苗，倪雯婷，尹怡銘，趙方舒，田景振，張曉平,3*，崔清華

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355）（2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，山東濟(jì)南 250355）（3.山東中醫(yī)藥大學(xué)青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東青島 266112）

我國是糖尿病發(fā)病率較高的國家，糖尿病可造成組織炎癥、病理損傷和多種心血管疾病[1,2]，而高糖是糖尿病微血管病變的關(guān)鍵因素之一[3]。高濃度葡萄糖及其有毒的副產(chǎn)物，如晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）等，會導(dǎo)致糖尿病患者大血管和微血管的內(nèi)皮功能障礙，包括細(xì)胞通透性增加、細(xì)胞凋亡、糖萼破裂，造成機體氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子分泌異常等[4]，高血糖導(dǎo)致的異常生成的新血管通常是未成熟的，并在視網(wǎng)膜病變中起病理作用，導(dǎo)致玻璃體出血和纖維化，這也是引起糖尿病大血管并發(fā)癥的始動環(huán)節(jié)[5]。

無花果乳漿是?？崎艑偎幨硟捎弥参餆o花果（Ficus caricaL.）的鮮果和莖稈擠出的乳白色粘稠乳汁，是一種在植物特殊分泌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜分子混合物的水懸浮液，可以合成和儲存相當(dāng)數(shù)量的不同次生代謝物，如含有有機酸、脂肪酸、三萜類化合物、類固醇、蛋白質(zhì)和氨基酸等[6,7]。無花果乳漿部分來自于無花果，在化學(xué)成分和功能上具有一定相似性，無花果作為藥食兩用的植物果實，主要含有黃酮、香豆素、甾醇和三萜類等化合物[8]，其各部位在治療皮膚病、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等方面具有突出效果，中醫(yī)記載無花果可治療便秘，作為瀉藥，治療痢疾和腸炎[9]，現(xiàn)代研究[10]顯示可抑制結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等及腫瘤血管形成；無花果葉提取物可通過刺激胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素，降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂[11]，也可抑制VEGF-A的mRNA表達(dá)水平[12]；無花果乳漿在民間可治疣[13,14]。但截止目前，無花果乳漿對糖尿病微血管作用效果的基礎(chǔ)研究較少，本研究從微血管生理角度，探究無花果乳漿對于高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮采摘于廣西玉林的無花果乳漿（批號：20210901）；胰蛋白酶（不含EDTA）（貨號：25200056）、胎牛血清（FBS）（貨號：16140071）、磷酸緩沖液（PBS），美國Gibco公司；Transwell侵襲小室（批號：351157）、Martigel基質(zhì)膠（批號：256234），美國康寧公司；ECM培養(yǎng)基，美國Sciencell公司；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（批號：556547），美國BD公司；SOD（貨號：ml063052）、LDH（貨號：ml024518）、NO（貨號：ml022390）ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物；VEGF（貨號：C18013036）、ET-1（貨號：C19013037）、eNOs（貨號：C13013038）ELISA試劑盒，武漢華美生物；Huvec人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（ATCC CRL-1730）購自普諾賽，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%ECM完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物；safe-1200TE生物安全柜，上海力新儀器公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力新儀器公司；Spectra Max M5酶標(biāo)儀，美國分子儀器公司；CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.3 無花果乳漿的萃取分離

取廣西夏季（九月）新鮮采集的無花果擠出乳漿混懸液，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院崔清華副教授鑒定確認(rèn)，取新鮮收集的無花果乳漿，在磁力攪拌器作用下，緩慢多次地攪拌加入無水乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%，4 ℃靜置24 h，使用10層紗布過濾，抽濾，收集上清液和沉淀。所得上清液，按前述步驟攪拌加入無水乙醇至體系醇濃度達(dá)90%，4 ℃靜置24 h，抽濾，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，分別按1:1（V/V）比例加入石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇進(jìn)行系統(tǒng)溶劑萃取，充分振搖后靜置分層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無溶劑殘留，冷凍干燥得固體。

1.4 MTT法測定供試品對Huvec細(xì)胞高糖模型的增殖影響

取烘干的無水葡萄糖溶于PBS中，配制成75 mmol/L的葡萄糖溶液，超濾除菌，加入ECM培養(yǎng)基中配制成高糖培養(yǎng)基（葡萄糖含量為35 mmol/L），將不同極性萃取部位固體使用DMSO溶解，再稀釋于高糖（35 mmol/L）低血清培養(yǎng)基中（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% DMSO），供試品起始濃度為3 mg/mL，2倍比連續(xù)稀釋8次，終濃度為23.44 mg/L，共得8個濃度梯度。

取10代以內(nèi)的Huvec細(xì)胞，胰酶消化后鋪于96孔板內(nèi)（每孔1×105個細(xì)胞），孵育過夜。每孔加入100 μL含供試品高糖（35 mmol/L）低血清培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)置高糖模型組（35 mmol/L）和正常對照組（5.5 mmol/L），均含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%DMSO。37 ℃，5% CO2孵育48 h，每孔加入MTT溶液120 μL，37 ℃孵育4 h，加入DMSO溶液100 μL，570 nm處觀察吸光度值（OD），計算細(xì)胞存活率（實驗組OD值與正常對照組OD值的比值）。

1.5 “劃痕試驗”考察供試品對Huvec高糖模型的遷移影響

將Huvec接種在6孔板中（每孔3×105個細(xì)胞），使用槍頭尖劃痕，PBS清洗，每孔加入含供試品高糖低血清培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，設(shè)置高糖模型組和正常對照組，在0、24、48 h用倒置顯微鏡在事先標(biāo)記的固定位置拍照，以0 h劃痕面積作為參照，使用ImageJ軟件計算遷移率（觀察時刻與0時的面積差與0時面積的比值）。

1.6 Transwell侵襲試驗考察供試品對Huvec高糖模型的侵襲影響

采用24孔、8 μm孔徑的Transwell板，每孔加入100 μL基質(zhì)膠，37 ℃孵育1 h后，胰酶消化Huvec，用低血清高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至每毫升1.5×105個細(xì)胞，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入含供試品高糖培養(yǎng)基溶液750 μL，高糖模型組下室加入不含供試品的高糖完全培養(yǎng)基，正常對照組下室加入低糖完全培養(yǎng)基。孵育48 h后，4%甲醛、甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，倒放在顯微鏡下拍攝，使用ImageJ軟件計算侵襲率（結(jié)晶紫染色面積與小室面積比值）。

1.7 血管形成試驗

將槍頭和96孔板4 ℃預(yù)冷，每孔加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃孵育1 h。每孔接種Huvec（4×105個），加入100 μL含供試品高糖低血清培養(yǎng)基，設(shè)置高糖模型組和正常對照組，孵育6 h后，用倒置顯微鏡觀察成管情況。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

胰酶消化Huvec，接種在六孔板內(nèi)（每孔3×105個細(xì)胞），每孔加入含供試品高糖培養(yǎng)基，設(shè)置高糖模型組和正常對照組，孵育48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化，按照說明書加入Annexin V-FITC、PI染液，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀中檢測。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定供試品對Huvec高糖模型中VEGF、ET-1、SOD、LDH、NO、eNOs因子的影響

胰酶消化Huvec，接種在6孔板內(nèi)（每孔3×105個細(xì)胞），每孔加入含供試品高糖培養(yǎng)基，設(shè)置高糖模型組和正常對照組。孵育48 h后，取超濾后細(xì)胞上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8進(jìn)行處理，每次結(jié)果至少包含3次樣本，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，組間兩兩比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用多因素方差分析和LSD-t檢驗，p＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品對Huvec高糖模型的增殖影響

與正常對照組相比，高糖環(huán)境可使Huvec細(xì)胞存活率顯著下降至76.04%（p＜0.001）。在各萃取產(chǎn)物中，只有石油醚可以對高糖環(huán)境下的Huvec細(xì)胞起到較顯著的保護(hù)作用。石油醚萃取產(chǎn)物在750 mg/L及以下濃度時均可顯著提高細(xì)胞活力至約100%（p＜0.05），維持高糖環(huán)境下的細(xì)胞活性，結(jié)果見圖1。此外，石油醚萃取產(chǎn)物在750 mg/L濃度時細(xì)胞存活率為93.85%，此濃度以下無明顯的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖2。故以下試驗采用無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物（質(zhì)量濃度分別為400、200、100 mg/L）作為供試品。

圖1 不同濃度無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型增殖的影響Fig.1 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the proliferation of Huvec cells with high glucose

圖2 不同濃度無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of petroleum ether extract of Ficus carica latex to Huvec cells

2.2 供試品對Huvec高糖模型的遷移影響

細(xì)胞劃痕實驗可以反應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移生長能力，通過顯微圖像和Image J量化分析，在24 h內(nèi)，正常對照組Huvec細(xì)胞遷移率為40.26%，高糖模型組的細(xì)胞遷移率明顯下降至28.36%（p＜0.01），在48 h內(nèi)，正常對照組Huvec細(xì)胞遷移率為55.47%，高糖模型組的細(xì)胞遷移率顯著下降至32.39%（p＜0.001）；與高糖模型組相比，在24 h和48 h內(nèi)無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物具有較好的保護(hù)作用（p＜0.001），24 h時，100、200、400 mg/L濃度時遷移率分別為44.73%、51.08%、42.12%，48 h時，100、200、400 mg/L濃度時遷移率分別為61.01%、66.30%、46.40%。隨著無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物濃度增高，促遷移效果略有下降，推測可能與輕微的細(xì)胞毒性有關(guān)，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 顯微鏡觀察無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的遷移影響（×40）Fig.3 Micrographs of the migration effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose(×40)

圖4 無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的遷移率Fig.4 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the migration rate of Huvec cells with high glucose

2.3 供試品對Huvec高糖模型的侵襲影響

圖5 顯微鏡觀察無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的侵襲影響（×200）Fig.5 Micrographs of the invasion effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose(×200)

圖6 無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的侵襲率Fig.6 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the invasion rate of Huvec cells with high glucose

細(xì)胞侵襲試驗可以反應(yīng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，通過顯微圖像和Image J量化分析發(fā)現(xiàn)，相較于正常對照組，高糖模型組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少至22.09%（p＜0.001），100、200、400 mg/L無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物可分別顯著提高細(xì)胞侵襲率至36.63%、38.42%、38.75%（p＜0.001），結(jié)果見圖5、圖6。

2.4 供試品對Huvec高糖模型血管形成能力的影響

將Huvec細(xì)胞接種在基質(zhì)膠上，可在體外模擬血管的體內(nèi)形成。相比于正常對照組，高糖模型組顯著降低了Huvec細(xì)胞的血管形成能力，血管形成不連貫，變細(xì)，管狀數(shù)目變少。而無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物可以呈劑量依賴性的提高血管形成的能力，保護(hù)因高糖受損的模擬血管，防止其形成中斷，形成表觀形狀規(guī)則的管狀集合體，數(shù)量增多，結(jié)果見圖7。

圖7 顯微鏡觀察無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型血管形成能力的影響（×100）Fig.7 Micrographs of the effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the angiogenesis of Huvec cells with high glucose (×100)

圖8 無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型凋亡影響Fig.8 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on apoptosis of Huvec cells with high glucose

2.5 供試品對Huvec高糖模型凋亡的影響

圖9 無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的凋亡率Fig.9 Apoptosis rate of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose

細(xì)胞凋亡異常可能導(dǎo)致病理狀態(tài)，細(xì)胞凋亡是內(nèi)皮保護(hù)的重要因素，它的發(fā)展直接關(guān)系到內(nèi)皮損傷的程度[15]。高糖環(huán)境下導(dǎo)致ROS的增加，可以觸發(fā)JNK的激活，最終介導(dǎo)Caspase-3誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[16]，此外，內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過ET-1途徑增加線粒體ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17,18]。與正常對照組相比，高糖模型組凋亡的細(xì)胞數(shù)顯著性提升，達(dá)到24.23%（p＜0.001），說明高糖環(huán)境促使了Huvec細(xì)胞凋亡。100、200、400 mg/L無花果石油醚萃取產(chǎn)物均可顯著性抑制Huvec細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為15.37%、12.96%、14.96%（p＜0.001），其中200 mg/L的保護(hù)效果最佳，不同濃度之間差異較小，結(jié)果見圖8、圖9。

2.6 供試品對Huvec高糖模型中相關(guān)因子的影響

圖10 無花果乳漿石油醚萃取產(chǎn)物對Huvec高糖模型的因子影響Fig.10 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the factors of Huvec cells with high glucose

高糖環(huán)境所致細(xì)胞損傷是血管內(nèi)皮功能障礙的重要原因，LDH是一種穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，細(xì)胞受到損傷后，膜內(nèi)LDH會不可逆地滲漏到周圍介質(zhì)中，是細(xì)胞膜完整性和活力遭到破壞的重要標(biāo)志之一[19]，可反映細(xì)胞膜的損傷程度。SOD作為重要的抗氧化酶，被認(rèn)為是抵抗ROS的第一線防御系統(tǒng)，能通過清除ROS來保護(hù)細(xì)胞免受損傷，2001年，Brownlee提出了“糖尿病并發(fā)癥的共同機制”理論[20]，認(rèn)為過量產(chǎn)生超氧化物和活性氧（ROS）會導(dǎo)致高血糖的血管內(nèi)皮損傷，在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生機制中起著關(guān)鍵作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞合成多種蛋白因子參與微血管的生理功能調(diào)控，ET-1是目前發(fā)現(xiàn)最強的縮血管活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)人體血管微循環(huán)[21]，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO是重要的保護(hù)性因子，具有舒張血管，抑制平滑肌增生，避免血管管腔狹窄的作用，正常情況下ET-1/NO處于一種動態(tài)的平衡狀態(tài)[22]。在糖尿病模型中，胰島素和生長因子受體酪氨酸激酶結(jié)合后，激活PI3K通路，進(jìn)而激活eNOs，生成NO[23,24]。然而，高糖環(huán)境減少人內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO[25]，AGEs減少eNOS表達(dá)并使NO失活，由于氧化應(yīng)激和AGEs的產(chǎn)生降低了NO的生物利用度[26,27]，有研究表明，eNOs的缺乏增加了小鼠足細(xì)胞的損傷，加速了糖尿病腎病的進(jìn)展[28]。VEGF是一種強效的促血管生成因子，與受體結(jié)合后，可增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，糖尿病患者和嚙齒動物腎臟中VEGF表達(dá)上調(diào)和下調(diào)均有報道。通常，高血糖和AGEs通過減少血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR2受體的表達(dá)影響VEGF生成，造成VEGF過度積累，并導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞對血管內(nèi)皮生長因子的反應(yīng)性降低，造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，在體內(nèi)VEGF的上調(diào)可能是有害的，但也可能是代償性的[29-31]。

與正常對照組相比，高糖模型組的乳酸脫氫酶（LDH）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮素-1（ET-1）因子水平分別顯著性提高至20.96 μg/L、90.03 ng/L、839.41 ng/L（p＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOs）含量分別顯著性下降至3.52 μg/L、184.75 μmol/L、0.59 IU/mL（p＜0.01）。100、200、400 mg/L石油醚萃取產(chǎn)物均可分別顯著性降低LDH至19.73、19.29、15.80 μg/L、分別降低ET-1至465.05、343.74、146.58 ng/L、分別提高NO水平至200.89、226.25、232.55 μmol/L（p＜0.05），200、400 mg/L濃度時可以分別顯著降低VEGF含量至28.19、31.66 ng/L（p＜0.01），400 mg/L濃度時可明顯提高eNOs含量至1.12 IU/mL（p＜0.001）和SOD水平至15.80 μg/L（p＜0.01），結(jié)果見圖10。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高糖模型在體外可以顯著性阻礙Huvec人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能，如增殖、遷移、侵襲和血管形成，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，無花果乳漿的石油醚萃取產(chǎn)物可明顯改善上述功能，抑制細(xì)胞凋亡。高糖環(huán)境下可導(dǎo)致細(xì)胞受損和生理因子分泌紊亂，具體表現(xiàn)為上清液中LDH顯著增高，SOD顯著降低，VEGF和ET-1顯著增高，NO和eNOs顯著降低。無花果乳漿的石油醚萃取產(chǎn)物可以減輕細(xì)胞損傷，可能通過恢復(fù)正常的血管相關(guān)因子水平，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞正常生理功能，防止微血管發(fā)生病變。然而，無花果乳漿物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確，本研究也只考察了高糖和無花果乳漿對Huvec細(xì)胞的體外作用，在體內(nèi)經(jīng)過復(fù)雜的代謝和生化反應(yīng)則可能得到不同的結(jié)果，所以下一步將進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證本研究所得結(jié)論，進(jìn)一步支持其作為藥食兩用植物的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用。