柱前衍生化高效液相色譜法測定生物樣本中短鏈脂肪酸及乳酸含量

王國盼，黃偉健，霍金洪，顏毛毛，吳少輝，郝占西，魏遠安

（量子高科（廣東）生物有限公司，廣東 江門 529081）

腸道菌群與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括慢性胃腸疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及全身性疾病。在代謝綜合癥發(fā)生及發(fā)展過程中，腸道菌群組成發(fā)生特征性的改變，這可以通過益生元、膳食纖維等營養(yǎng)調(diào)節(jié)從而維持并改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能，以促進健康、減少發(fā)病率。腸道菌群影響宿主生理的途徑之一是由其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）介導的。SCFAs是指碳原子數(shù)為1～6的有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量之和占腸道SCFAs總量的90%～95%。SCFAs在調(diào)節(jié)宿主健康方面起重要作用。SCFAs可作為腸道上皮細胞的能源物質(zhì)，維護腸道形態(tài)及功能，并對結(jié)腸炎等腸道疾病具有一定的治療作用；部分SCFAs從腸腔轉(zhuǎn)移至遠端器官（如肝臟），作為底物或信號分子調(diào)節(jié)脂肪積累與食欲，參與糖異生代謝，維持宿主葡萄糖穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)顯示SCFAs與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

在腸道菌群以膳食纖維為來源合成乙酸、丙酸和丁酸的代謝途徑中，乳酸是生成丙酸的底物之一，也可經(jīng)糖酵解生成丙酮酸后，合成其他代謝產(chǎn)物。乳酸在有機體中參與生理功能的角色主要有3 個：能量來源、糖異生作用的前體、代謝信號分子。因此，對腸內(nèi)容物及血清樣本中乳酸和SCFAs同時進行定性和定量測定，可極大地增進我們對飲食、腸道菌群和宿主代謝穩(wěn)態(tài)之間復雜相互作用關(guān)系的理解。

目前，生物樣品中的SCFAs的定量方法包括氣相色譜（gas chromatography，GC）法、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法、液相色譜（liquid chromatography，LC）法、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用等方法，其中GC及GC-MS是最常用的測定方法。然而，目前很少有研究同時關(guān)注腸道及血清中乳酸及SCFAs含量的變化。本研究使用GC、高效LC（high performance LC，HPLC）、柱前衍生化HPLC（pre-column derivatization HPLC，PCD-HPLC）檢測小鼠糞便中SCFAs及乳酸含量并其進行對比，對建立的PCD-HPLC進行方法學驗證；本研究旨在建立一種適用于生物腸內(nèi)容物與血清樣品的，且能同時、精準測定其SCFAs及乳酸含量的方法，為更好地開展益生元與膳食纖維等新型營養(yǎng)素調(diào)節(jié)腸道菌群進而影響機體代謝生理的關(guān)聯(lián)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗小鼠為BALB/c雌性小鼠，SPF級，小鼠體質(zhì)量18～22 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

糞便、盲腸及血清樣本來源于實驗小鼠。

乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、乳酸標準品（均為色譜級）、EDC·HCl、NPH·HCl 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；濃鹽酸、乙醚、乙酸乙酯、氫氧化鈉、氫氧化鉀，濃硫酸（均為分析純） 廣州化學試劑廠；吡啶（分析純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；甲醇（色譜純） 美國Labscience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000 HPLC儀（紫外檢測器） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GC-2014C GC儀 日本島津公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；通風櫥 廣州市半宙實驗室設(shè)備有限公司；QIMO-DCY-24Y水浴氮吹儀 琪摩（上海）電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC分析糞便樣品

稱取約0.1 g糞便樣品，加入0.2 mL質(zhì)量分數(shù)50%的硫酸溶液酸化，再加入2 mL乙醚萃取20 min，12 000 r/min離心10 min后取上層有機相進樣分析。

GC條件：DB-FFAP毛細柱（30 m×0.25mm，0.25 μm）；進樣口、氫火焰離子化檢測器溫度為240 ℃；載氣為氮氣，載氣流速24 mL/min；柱流量2 mL/min；分流比10∶1；尾吹30 mL/min；氫氣流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min；升溫程序：100 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至150 ℃，隨后150 ℃保持5 min；進樣量2.0 μL。

1.3.2 HPLC分析糞便樣品

稱取約0.3 g糞便樣品，加入1 mL去離子水后振蕩混勻，12 000×離心10 min收集糞便上清液。加入100 μL 12.1 mol/L濃鹽酸酸化，混勻后加入5 mL乙醚萃取20 min，3 500 r/min離心10 min后取上層有機相轉(zhuǎn)移至另一管中。加入500 μL 1 mol/L NaOH溶液反萃取20 min，3 500 r/min離心10 min，收集下層水相。加入100 μL 12.1 mol/L濃鹽酸再酸化，所得樣品用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

HPLC色譜條件：YMC-Pack Pro C色譜柱（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；柱溫30 ℃；流動相：A為水，用質(zhì)量分數(shù)為8.5%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.8；B為乙腈；A∶B＝95∶5（/）；采用等度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.3 PCD-HPLC分析糞便及血清樣品

1.3.3.1 糞便樣品前處理

稱取不小于50 mg糞便樣品，加入4～5 倍體積的水振蕩混勻，12 000×離心10 min后收集上清液。

1.3.3.2 柱前衍生化

取100 μL糞便上清液或100 μL血清樣品，按順序加入200 μL 200 mmol/L NPH·HCl溶液，200 μL 120 mmol/L EDC·HCl溶液，200 μL 6%吡啶溶液（/）?；旌暇鶆蚝笥?0 ℃恒溫水浴鍋中衍生化反應20 min，加入100 μL 15% KOH溶液（g/mL）-甲醇溶液（80∶20，/），混合均勻后于60 ℃恒溫水浴鍋20 min終止衍生化反應。

衍生化反應結(jié)束后，加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為42.5%磷酸溶液酸化，再加入4 mL乙醚萃取兩次，每次10 min，收集上層有機相。合并兩次萃取的有機相，水洗一遍后氮吹干燥。最終固體殘留物用200 μL甲醇溶解，所得溶液用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

1.3.3.3 色譜條件

Hypersil GOLD HPLC C色譜柱（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；柱溫40 ℃；流動相：A為乙腈；B為超純水，用質(zhì)量分數(shù)為8.5%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為2.8～3.0；采用梯度洗脫程序洗脫5 種SCFAs組分及乳酸（表1）。在230 nm波長處進行紫外檢測，采用混合標準品溶液進行外標法定量。

表1 5 種SCFAs及乳酸衍生產(chǎn)物梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for separation of five SCFAs and lactate derivatives

1.3.4 PCD-HPLC的方法學評價

1.3.4.1 線性關(guān)系分析

根據(jù)小鼠糞便及血清樣品中乳酸及各SCFAs組分的濃度范圍，配制含各組分的不同混合標準溶液母液。按照2 倍梯度稀釋的方法分別得到7 個梯度標準溶液。各質(zhì)量濃度的梯度標準溶液經(jīng)過1.3.3.2節(jié)柱前衍生化和1.3.3.3節(jié)HPLC分析后，用目標化合物峰面積（）與相對應的質(zhì)量濃度（）繪制標準曲線。繼續(xù)稀釋低濃度的標準溶液，直到目標化合物的峰面積比不再呈線性降低（標準曲線的相關(guān)系數(shù)（）小于0.99），此時的質(zhì)量濃度為線性范圍的最小值。

1.3.4.2 準確度和精密度分析

通過計算在糞便上清液中目標化合物的加標回收率評價方法準確度。選用一個已測定SCFAs及乳酸含量的樣品，加入其質(zhì)量分數(shù)80%、100%的標準品，加標后樣品按照1.3.3.2節(jié)處理和1.3.3.3節(jié)HPLC檢測含量，重復6 次，計算回收率。

采用100%加標樣品，考察日內(nèi)、日間檢測的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）以評價方法的精密度。同一日內(nèi)不同時間檢測5 次，計算日內(nèi)CV，評價日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d對樣品進行檢測，計算日間CV，評價日間精密度。

1.3.5 小鼠實驗

將BALB/c雌性小鼠隨機分為5 組，每組10 只，體質(zhì)量為（20±2） g。纖維素及各益生元均按30%添加量（/）預加入低纖飼料中。對照組小鼠攝食含纖維素的飼料，4 組實驗組小鼠分別含攝食菊粉、低聚果糖（fructooligosaccharide ，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）、低聚甘露糖（mannooligosaccharides，MOS）的飼料。小鼠自由采食、飲水，每周計算其攝食量。連續(xù)喂養(yǎng)6 周后，收集兩份每只小鼠的糞便樣品，處死小鼠后收集兩份盲腸內(nèi)容物，這些樣品用于檢測腸道菌群、腸菌代謝產(chǎn)物SCFAs及乳酸；同時以斷尾取血方式采集血液，靜置后3 000 r/min離心10 min收集上清液，用于檢測血清中SCFAs及乳酸含量。

1.3.6 PCD-HPLC測定糞便、盲腸內(nèi)容物、血清中SCFAs及乳酸含量

按照1.3.3節(jié)處理對應樣品并檢測待測樣品中SCFAs及乳酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用檢驗比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種檢測方法的比較

圖1 GC（A）、HPLC（B）、PCD-HPLC（C）得到的標準品與糞便樣品色譜圖比較Fig. 1 Chromatograms of standards and fecal sample in GC (A) ,HPLC (B) and PCD-HPLC (C)

如圖1所示，GC和PCD-HPLC能很好地分離樣品中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸。HPLC雖能較好分離標準樣品中乙酸、丙酸、丁酸，但不能較好分離丁酸與異丁酸（圖中未顯示）；且樣品雜峰多、目標峰值響應度低。在糞便樣品SCFAs含量的檢測中，空白樣品（水）經(jīng)1.3.2節(jié)HPLC法檢測后在乙酸出峰處仍有吸收峰（圖中未顯示），所以HPLC法檢測乙酸含量誤差大、準確度低。此外，GC法雖能快速分析幾種SCFAs的含量，但不能同時測定乳酸含量。乳酸揮發(fā)性低，直接進樣GC分析無目標峰出現(xiàn)，須經(jīng)柱前衍生化生成乳酸甲酯后進行檢測。由于羧基極性強，在GC柱中容易產(chǎn)生吸附作用會導致峰形拖尾，酸在柱上的保留會降低連續(xù)進樣分析過程中填充柱的精確度和準確度。相反地，PCD-HPLC法同時可很好分離檢測樣品中乳酸、戊酸、異丁酸的含量。因此，PCD-HPLC法更適用于檢測腸內(nèi)容物及血清中乳酸及SCFAs含量，后續(xù)研究集中在PCD-HPLC的方法學評價及其應用。

2.2 PCD-HPLC的方法學評價

2.2.1 乳酸及SCFAs各組分的線性范圍

如表2、圖2所示，在SCFAs各組分及乳酸標準品濃度的線性范圍內(nèi)，標準曲線的高，均在0.999 4以上。

表2 5 種SCFAs及乳酸的線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges of and correlation coefficients for five SCFAs and lactic acid

圖2 乳酸、乙酸、丙酸標準品線性擬合曲線Fig. 2 Linear fitting curves for lactic acid, acetic acid and propionic acid

2.2.2 準確度與精密度評價

由表3可知，采用PCD-HPLC測定糞便樣品中5 種SCFAs及乳酸含量，各組分的加標回收率均在80%～120%范圍內(nèi)，方法準確度較高。在該方法下，SCFAs各組分及乳酸含量測定的日內(nèi)CV不高于5.21%，日間CV不高于8.87%，表明該方法重復性及重復性良好。

表3 乳酸及SCFAs檢測穩(wěn)定性及回收率Table 3 Stability and recoveries of PCD-HPLC for determination of lactatic and SCFAs%

2.3 PCD-HPLC測定飼養(yǎng)小鼠的糞便、盲腸內(nèi)容物、血清中SCFAs各組分及乳酸含量分析

2.3.1 SCFAs各組分及乳酸在小鼠不同部位的含量變化

如圖3所示，在糞便及盲腸內(nèi)容物SCFAs中，乙酸含量最高，約占總SCFAs的70%～85.5%；其次是丁酸和丙酸；這3 種SCFAs含量占總SCFAs比例超過90%，與眾多研究結(jié)果一致。糞便和盲腸內(nèi)容物中乳酸的含量約為10 μmol/g。對比糞便和盲腸內(nèi)容物（分別對應于遠端結(jié)腸和近端結(jié)腸）發(fā)現(xiàn)，盲腸內(nèi)容物中的乙酸、丙酸、丁酸含量均比糞便中含量高，結(jié)果與Cummings和Hernández等的報道一致。此外，觀察到小鼠血清樣品中乳酸含量最高，SCFAs中乙酸含量最高，其余SCFAs組分含量較少。值得注意的是，血清中丁酸含量極低。

圖3 飼養(yǎng)小鼠的糞便、盲腸內(nèi)容物、血清中5 種SCFAs及乳酸含量比較Fig. 3 Comparison of contents of five SCFAs and lactic acid in feces,cecum contents and serum of mice

2.3.2 小鼠腸道中乳酸與丙酸的含量變化

圖4 飼養(yǎng)小鼠糞便（A）、盲腸內(nèi)容物（B）中乳酸與丙酸的含量變化Fig. 4 Changes in lactic acid and propionic acid contents in feces (A) and cecum contents (B) of mice

由圖4可知，在糞便、盲腸內(nèi)容物中，乳酸含量與丙酸含量變化趨勢相反，乳酸含量相對較高的益生元組的丙酸含量相對較低。然而有趣的是，在血清中乳酸含量相對于SCFAs含量更高（圖3），未見乳酸與丙酸之間的含量變化相反趨勢。此外，圖4也顯示不同益生元對腸道代謝產(chǎn)物的影響存在差異，F(xiàn)OS、GOS對乳酸及丙酸含量的影響相似，兩組小鼠腸道中的乳酸、丙酸含量沒有顯著差異（＞0.05）。與FOS和GOS組相比，MOS和菊粉明顯增加了小鼠腸道（糞便、盲腸內(nèi)容物）中乳酸含量，降低了丙酸含量；其中MOS組的差異更大，小鼠攝入MOS后，腸道（糞便、盲腸內(nèi)容物）中丙酸含量極顯著低于其他3 個實驗組（＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

腸道菌群利用膳食纖維合成SCFAs分為多種途徑（圖5）。然而當腸道中可發(fā)酵膳食纖維供應不足時，菌群轉(zhuǎn)向利用其他能源物質(zhì)，如膳食來源氨基酸、內(nèi)源蛋白質(zhì)或膳食脂肪，進而代謝生成支鏈脂肪酸如異丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸。乳酸在腸道中的合成代謝途徑研究較少，更多關(guān)注在血液中的代謝。圖5顯示，乳酸是腸道菌群利用膳食纖維或益生元合成SCFAs的重要中間代謝產(chǎn)物，可以作為底物經(jīng)丙烯酸鹽途徑直接生成丙酸，這可能是本研究發(fā)現(xiàn)腸道中乳酸與丙酸含量變化趨勢相反的原因之一，機體隨著腸道環(huán)境的變化或功能需求產(chǎn)生不同含量的乳酸及丙酸。目前的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)腸道中乳酸與其他SCFAs含量之間存在顯著關(guān)聯(lián)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)血清中乳酸含量與丙酸或其他SCFAs之間存在相互聯(lián)系；血清中乳酸含量最高，分析可能乳酸的代謝途徑在血液中與腸道中存在差異，在血液中乳酸的來源主要為葡萄糖和丙氨酸，通過乳酸脫氫酶催化氧化還原反應生成或消除乳酸。

圖5 腸道菌群以膳食纖維為來源合成乙酸、丙酸、丁酸的途徑Fig. 5 The synthesis pathway of acetic acid, propionic acid and butyric acid by intestinal bacteria from dietary fiber

嬰兒在出生0～6 個月期間，食物來源主要是母乳。母乳中第3大營養(yǎng)物質(zhì)——母乳低聚糖，為嬰兒腸道菌群提供生長所需的營養(yǎng)。腸菌代謝產(chǎn)生的SCFAs及乳酸使腸道環(huán)境酸化，進一步產(chǎn)生對嬰兒生長發(fā)育有益的功能。在本課題組的另一項探究母乳低聚糖與嬰幼兒腸道菌群之間聯(lián)系的研究中發(fā)現(xiàn)，在0～6 個月齡的嬰幼兒腸道中，乳酸及乙酸的含量最高，腸菌組成多為雙歧桿菌及乳酸桿菌。結(jié)果顯示了腸道產(chǎn)生乳酸對機體健康的有益影響，可能是作為能源物質(zhì)為機體細胞提供能量，也可能是與SCFAs類似，作為信號分子參與一系列代謝反應。

此外，小鼠攝入同樣劑量不同益生元或不同劑量同一益生元后，腸道中乳酸與SCFAs含量變化程度不同。例如：圖4B顯示，攝入MOS后，盲腸內(nèi)容物中乳酸含量在所有益生元組中最高，對應丙酸含量最低；圖4顯示，攝入FOS與GOS的兩組小鼠腸道中的乳酸、丙酸含量沒有顯著差異（＞0.05）。此結(jié)果表明不同結(jié)構(gòu)、不同鏈長的益生元對腸道菌群組成及其代謝產(chǎn)物的影響存在差異。腸腔中丁酸濃度在盲腸中最大，由于被腸黏膜吸收，可發(fā)酵底物的減少，使越到遠端腸道丁酸濃度越低。丁酸作為結(jié)腸上皮細胞的能量來源，且結(jié)腸上皮細胞代謝丁酸速率快，因此在門靜脈及外周血中丁酸含量極低，門靜脈丁酸濃度比結(jié)腸腸腔中濃度低1 000 倍，外周循環(huán)血中丁酸濃度為幾μmol/mL。這些研究結(jié)果與本實驗結(jié)果相似。腸道炎癥性疾病更大概率發(fā)生在遠端結(jié)腸，原因可能是遠端結(jié)腸可發(fā)酵碳水化合物含量少，產(chǎn)生的SCFAs含量少，不能很好地保護腸道上皮。

綜上，在研究微生態(tài)營養(yǎng)干預對機體健康調(diào)節(jié)作用時，除了監(jiān)測腸道菌群組成變化外，建立準確、有效的方法同時檢測腸道及外周血中乳酸及SCFAs含量很有必要。在同一個樣本中同時快速、準確地分析乳酸及SCFAs含量變化，可作為觀察腸道菌群組成與機體健康生理變化之間聯(lián)系的紐帶和有效指標，用于評估腸道炎癥性疾病發(fā)展的可能，此外也可指導飲食精準營養(yǎng)干預方案，例如，增加攝入不易被消化的可發(fā)酵碳水化物提高遠端結(jié)腸SCFAs含量，尤其是丁酸。

本研究使用GC、HPLC、PCD-HPLC這3 種方法檢測糞便中乳酸及SCFAs含量并對其進行對比。結(jié)果顯示：GC可快速分析具有揮發(fā)特性的SCFAs含量，但不能同時分析無揮發(fā)特性的乳酸；由于脂肪酸分子結(jié)構(gòu)中缺乏具有紫外吸收的熒光的基團，HPLC檢測的準確度低；PCD-HPLC填補了前兩種檢測方法的不足，可同時精確測定糞便中乳酸及5 種SCFAs含量，且此方法同樣適用于盲腸內(nèi)容物及血清樣本的檢測。目前已報道的SCFAs測定方法中，稱取糞便質(zhì)量均不小于100 mg，然而在實際小鼠實驗中，收集不小于100 mg的糞便用于測定乳酸及SCFAs較困難（兩粒小鼠糞便質(zhì)量約為60 mg）。本研究建立的PCD-HPLC所需樣本量小，其中腸內(nèi)容物樣品不小于50 mg，血清樣品量不小于100 μL。因此，為更好地開展益生元與膳食纖維等新型營養(yǎng)素調(diào)節(jié)腸道菌群進而影響機體代謝生理的關(guān)聯(lián)研究，PCD-HPLC測定方法是一個很好的選擇，具有適用范圍廣、重復性良好、準確度高等特點。