萊鮑迪甙C高效轉(zhuǎn)化細菌Paenarthrobacter ilicis CR5301全基因組測序及關(guān)鍵糖苷酶分析

李洪飛，孫大慶，曹龍奎,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江 大慶 163319；2.東北石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 大慶 163318）

甜菊糖甙是從甜葉菊中提取的無熱量、高甜度的四環(huán)二萜類化合物，甜度是蔗糖的20～300 倍，熱量僅為蔗糖的1/300，安全無毒，具有預(yù)防動脈硬化、肥胖、齲齒癥等疾病，以及抗高血糖、抗炎癥、抗腫瘤、利尿和免疫調(diào)節(jié)等功效，是天然、綠色且健康的第3代甜味劑，目前已在食品、醫(yī)藥、日化用品等行業(yè)廣泛應(yīng)用。目前從甜葉菊中已檢測到的甜菊糖甙超過300 種。甜菊糖甙以甜菊醇為苷元，只是在C13和C19位連接的糖基數(shù)量和種類不同，其中萊鮑迪甙C（rebaudioside C，RC）含量位列第3，甜度低、后苦味重，因此嚴重影響了它在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

甜菊醇作為甜菊糖甙分解代謝的終產(chǎn)物，已被證明是甜菊糖甙發(fā)揮生理功能的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是許多藥物的重要原料或合成前體。然而，它在甜葉菊中含量很低，不足0.1%，因此通過直接提取法生產(chǎn)甜菊醇產(chǎn)量很低。目前甜菊醇的制備方法有化學(xué)合成法、酶催化法和微生物轉(zhuǎn)化法，其中微生物轉(zhuǎn)化法以產(chǎn)量高、反應(yīng)條件溫和、收率高和成本低等特點受到研究者的青睞。

目前報道以RC為底物制備甜菊醇的微生物有霉菌、和細菌，以及人體腸道中的某些微生物。馬迎迎報道顯示，固體培養(yǎng)浸提酶液在45 ℃轉(zhuǎn)化1%甜菊糖甙，50 h后底物中RC轉(zhuǎn)化率達到100%，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為甜菊醇，該研究者還利用液體培養(yǎng)菌絲將RC轉(zhuǎn)化為甜茶苷，4 d后RC轉(zhuǎn)化率為97.9%。Jiang Huiling等采用對甜菊糖甙中RC進行轉(zhuǎn)化，甜菊糖甙底物質(zhì)量分數(shù)1%，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)144 h后，RC全部轉(zhuǎn)化為甜菊醇。Koyama等利用人體腸道菌群孵育甜菊糖甙，觀察到甜菊糖甙中RC明顯減少，孵育24 h后RC剩余7%，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為甜菊醇。整體而言，完全轉(zhuǎn)化RC時間最短，轉(zhuǎn)化效率最高。盡管人體腸道菌群可以更快地轉(zhuǎn)化RC，但24 h后RC并沒有完全轉(zhuǎn)化，而且報道中沒有證明具體哪種微生物具有RC轉(zhuǎn)化能力。

本課題組前期從甜葉菊種植土壤中分離篩選到1 株可以高效轉(zhuǎn)化RC的細菌，該菌株可以將1 mg/mL高純度RC和1 mg/mL甜菊糖甙分別在8 h和10 h完全轉(zhuǎn)化為甜菊醇。經(jīng)16S rRNA（GenBank ID：MW926547）物種鑒定，該菌株命名為CR5301。以前稱為，Busse對菌屬進行了重新分類，增列了。目前菌株轉(zhuǎn)化RC的研究以往鮮見報道。NCBI數(shù)據(jù)庫顯示，截至2021年11月，全基因組測序菌株為31 株，其中6 個基因組為完成圖序列，物種收錄2 個基因組序列，但均為沒有組裝完整的草圖序列。為全面了解CR5301的遺傳背景，深入解析CR5301轉(zhuǎn)化RC的代謝途徑和關(guān)鍵酶，本研究采用二代Illumina HiSeq和三代Nanopore相結(jié)合的測序方式對CR5301進行基因組完成圖測序，以期得到物種第1個完成圖基因組序列，之后利用生物信息學(xué)軟件和公開數(shù)據(jù)庫對該基因組進行全面、深入的基因功能注釋、分類和預(yù)測分析，旨在為今后CR5301的RC轉(zhuǎn)化代謝機制研究提供清晰的遺傳背景和關(guān)鍵的候選酶基因信息。此外，CR5301完整基因組序列測定和解析將為今后物種的遺傳、進化、生理等廣泛生物學(xué)研究提供重要的遺傳信息基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CR5301由本實驗室從甜葉菊種植土壤中分離、篩選獲得，該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO：M2021851）。

察氏培養(yǎng)基和察氏不含蔗糖培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組抽提試劑盒WizardGenomic DNA Purification Kit 美國Promega公司；測序文庫構(gòu)建試劑盒NEXTflexRapid DNA-Seq Kit 美國Bioo Scientific公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-Q型全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；MLS-3751L-PC型高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫(yī)療株式會社；H1850R型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GeneAmp9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國ABI公司；NanoDrop ONE型微量紫外-可見分光光度計 美國Thermo公司；M220型Covaris超聲波破碎儀基因有限公司；TBS-380熒光儀、Illumina HiSeq測序儀美國Illumina公司；Nanopore測序儀 英國Oxford公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)條件

從-80 ℃冰箱取出凍存的CR5301菌株，在察氏固體培養(yǎng)基平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于察氏液體培養(yǎng)基中，28 ℃、135 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取2 次活化培養(yǎng)菌液，2%（/）接種于新鮮察氏液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)末期，取樣用于后續(xù)實驗。

1.3.2 菌株基因組DNA的提取

取活化后菌液2 mL，按照Wizard細菌基因組抽提試劑盒說明書進行基因組DNA的提取?；蚪MDNA樣品利用微量紫外-可見分光光度計和熒光儀進行純度和濃度測定。DNA滿足質(zhì)量濃度≥20 ng/μL和純度OD/OD＝1.8～2.0的樣品用于后續(xù)建庫測序。

1.3.3 測序文庫的構(gòu)建

Illumina測序文庫制備：取至少1 μg基因組DNA，利用超聲破碎儀Covaris進行基因組DNA片段化，將DNA樣本剪切成約400 bp的片段，按照NEXTflexRapid DNASeq試劑盒說明書進行Illumina測序文庫制備。Nanopore測序文庫制備：取至少15 μg基因組DNA，利用Covaris將基因組DNA處理成約10 kb的片段，然后進行片段純化，末端補平，兩端分別連接Nanopore測序接頭。

1.3.4 全基因組完成圖測序、組裝及數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

采用細菌基因組測序方法，利用二代Illumina HiSeq和三代Nanopore相結(jié)合的測序方式對CR5301基因組進行完成圖測序。制備的二代測序文庫在Illumina HiSeq×10測序儀上進行雙末端測序（2×150 bp）。制備的三代測序文庫在Nanopore測序儀上進行納米孔測序。二代測序數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)以fastq格式儲存，為了使后續(xù)的組裝更加準確，會對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量剪切，去除測序質(zhì)量較低、含N比例較高及質(zhì)量修剪后長度較小的reads，得到高質(zhì)量的clean data。利用Canu及HGAP軟件進行Nanopore數(shù)據(jù)組裝，將reads組裝成contigs，然后判斷是否成環(huán)，得到完整的染色體和質(zhì)?；蚪M。最后利用Illumina測序數(shù)據(jù)對組裝結(jié)果進行校正，并判斷環(huán)狀基因組的起始位點?；蚪M圈圖利用CGView軟件繪制。本次測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.5 基因預(yù)測及功能注釋

利用Glimmer對基因組中的基因進行預(yù)測，質(zhì)?；虿捎肎eneMarkS軟件預(yù)測，tRNAscan-SE進行tRNA預(yù)測，Barrnap進行rRNA預(yù)測，使用Tandem Repeats Finder軟件進行串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測。利用BLASTP、Diamond、HMMER等序列比對工具，從非冗余蛋白（Non-Redundant，NR）數(shù)據(jù)庫、歐洲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫Pfam、基因本體論（Gene Ontology，GO）、直系同源聚類群（Clusters of Orthologous Groups，COG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZy）數(shù)據(jù)庫中對預(yù)測到的基因進行功能注釋。所有數(shù)據(jù)庫中序列比對閾值設(shè)置-value≤10。

1.3.6 基因組共線性和進化分析

檢索并下載NCBI下Genome數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）中所有物種公布的完整基因組序列數(shù)據(jù)。利用Mauve 2.4軟件，將CR5301和所有已知基因組序列進行共線性比對分析。種子序列為默認值15 bp。Mauve計算獲得的基因組系統(tǒng)進化樹采用MEGA 7.0軟件進行可視化。

檢索并下載NCBI下RefSeq數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）中所有物種全長16S rRNA基因序列。利用MEGA 7.0軟件進行多序列比對，比對結(jié)果利用鄰接法構(gòu)建CR5301和所有已知物種16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹。同為革蘭氏陽性菌且基因組高GC含量的長雙歧桿菌模式菌株ATCC 15707的16S rRNA基因（NR_044691.2）作為進化樹的外群對照。

1.3.7 關(guān)鍵糖苷酶預(yù)測、基本性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

分 別 利 用 ProtParam、 SignalP 5.0、TMHMM 2.0、SOPMA軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、信號肽序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2019進行整理、篩選和統(tǒng)計分析。利用Prism 8軟件繪制柱狀圖。使用CGView（Version 2）繪制基因組圈圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. ilicis CR5301基因組組裝結(jié)果和基本特征

經(jīng)二代和三代測序數(shù)據(jù)聯(lián)合組裝，CR5301基因組獲得1 個完整閉合的染色體基因組序列，沒有獲得質(zhì)粒序列。CR5301基因組序列全長4 748 281 bp，GC含量62.92%，共含有4 458 個編碼基因，包括54 個tRNA和18 個rRNA編碼基因，測序深度310.36 倍。CR5301基因組測序和基因預(yù)測詳細結(jié)果如表1所示。為了全面和直觀地展示CR5301全基因組的基本特征，通過CGView軟件繪制基因組圈圖，如圖1所示。

目前，GenBank數(shù)據(jù)庫中物種只有2 個菌株DSM 20138（3.97 Mb，Accession No. NZ_JAFBCD010000001.1）和CECT 4207（4.09 Mb，Accession No. NZ_JAAOZD010000001.1）基因組序列公布，但它們都沒有組裝完整，從基因組大小看，它們?nèi)匀蝗笔л^多的遺傳信息。因此CR5301基因組完成圖的測定，不僅為CR5301的RC轉(zhuǎn)化功能研究提供了清晰、完整的遺傳信息，并且為物種的遺傳、進化、生理、代謝研究首次提供了完整、可靠的參考基因組序列，這對今后廣泛的生物學(xué)研究具有重要參考價值和普遍借鑒意義。

表1 P. ilicis CR5301基因組基本特征Table 1 General characteristics of P. ilicis CR5301’s genome

圖1 P. ilicis CR5301基因組圈圖Fig. 1 Graphical representation of P. ilicis CR5301’s genome

2.2 P. ilicis CR5301基因注釋和功能分類

2.2.1 COG注釋分析

COG是進行蛋白質(zhì)直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。將測序基因的氨基酸序列與eggNOG數(shù)據(jù)庫進行比對，從而預(yù)測這些蛋白質(zhì)的功能并進行功能分類統(tǒng)計。經(jīng)COG注釋分析，CR5301共有21 類3 749 個基因得到了COG注釋，占基因總數(shù)84.1%，結(jié)果如圖2所示。未知功能的基因數(shù)量最多，共1 120 個，占注釋基因總數(shù)的29.87%。其次為碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，分別為379、372 個和355 個，分別占注釋基因總數(shù)的10.11%、9.92%和9.47%。與無機離子轉(zhuǎn)運和代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化功能相關(guān)的基因也得到較多的注釋，分別為208 個和204 個。

由于CR5301的RC轉(zhuǎn)化功能與碳水化合物代謝功能相關(guān)，因此對注釋為碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝的COG基因進行了分析?？偣灿?79 個基因被注釋到該功能相關(guān)的169 個COG分類中，其中基因最多的是COG0395（依賴內(nèi)膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的結(jié)合蛋白，22 個）和ENOG410XP7I（轉(zhuǎn)運蛋白，21 個），基因不少于10的有COG1653（轉(zhuǎn)運蛋白活性，15 個）、COG1082（TIM桶結(jié)構(gòu)域木糖異構(gòu)酶，12 個）、COG1472（水解酶家族3，11 個）、COG1940（ROK家族蛋白，11 個）、COG0477（主要激活劑超家族蛋白，10 個）、COG0524（pfkb結(jié)構(gòu)域蛋白，10 個）、COG1621（水解酶，10 個），唯一基因的COG有101 個。碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝功能高度多樣性表明，CR5301具有強大的碳水化合物代謝能力。

圖2 P. ilicis CR5301基因的COG注釋和分類Fig. 2 COG annotation and classification of P. ilicis CR5301’s genes

2.2.2 GO注釋分析

CR5301在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到2 439 個基因，占基因總數(shù)54.71%。三大分類中，注釋到分子功能相關(guān)的基因最多，有1 987 個，注釋到細胞組成和生物過程相關(guān)的基因數(shù)相近，分別為1 051 個和1 044 個，GO注釋分析詳細結(jié)果見圖3。在生物學(xué)過程分類中，跨膜轉(zhuǎn)運（GO：0022857，125 個）、DNA模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（GO：0006355，77 個）、碳水化合物代謝（GO：0005975，60 個）和翻譯（GO：0006412，58 個）基因數(shù)最多。在細胞成分分類中，膜成分（GO：0016021，692 個）、細胞質(zhì)（GO：0005737，204 個）和（細胞膜GO：0005886，156 個）基因數(shù)明顯高于其他GO分類。在分子功能分類中，DNA結(jié)合（GO：0003677，272 個）和ATP結(jié)合（GO：0005524，257 個）基因數(shù)也明顯高于其他分類。此外，重點分析了可能參與RC生物轉(zhuǎn)化過程的基因，這些基因主要涉及水解酶活性（GO：0016787，99 個）、碳水化合物代謝（GO：0005975，60 個）、水解酶活性、水解-糖基化合物（GO：0004553，20 個）、碳水化合物結(jié)合（GO：0030246，11 個）等，去掉重疊，共發(fā)現(xiàn)163 個基因。

2.2.3 KEGG注釋分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞網(wǎng)絡(luò)代謝通路以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫，利用KEGG 可以進一步解析基因產(chǎn)物在生物學(xué)上的復(fù)雜行為。經(jīng)KEGG注釋分析，CR5301共有1 975 個基因得到了KEGG注釋，注釋基因占基因總數(shù)44.30%，如圖4所示。代謝通路第一層級共有6 個分類，獲得注釋基因由多到少的順序為：代謝（834 個，占注釋基因總數(shù)42.23%）、遺傳信息處理（165 個，8.35%）、環(huán)境信息處理（138 個，6.99%）、細胞過程（102 個，5.16%）、人類疾病（7 個，0.35%）和生物體系統(tǒng)（5 個，0.25%）。在第二層級中，除了全局和概覽圖，與碳水化合物代謝通路相關(guān)的注釋基因最多，注釋基因301 個，占注釋基因總數(shù)15.24%，明顯高于其他代謝通路。這一結(jié)果進一步表明，CR5301具有碳水化合物代謝高度多樣性的功能基因和代謝通路，從而對外界復(fù)雜碳水化合物的降解、轉(zhuǎn)化和利用提供了巨大潛力和可能性。

圖3 P. ilicis CR5301基因的GO注釋和分類Fig. 3 GO annotation and classification of P. ilicis CR5301’s genes

圖4 P. ilicis CR5301基因的Pathway注釋和分類Fig. 4 Pathway annotation and classification of P. ilicis CR5301’s genes

2.3 P. ilicis CR5301的可移動元件

在漫長的進化過程中，為適應(yīng)環(huán)境的變化或提高自身的生存競爭力，細菌基因組往往會攝入一些外源基因片段，并將其整合進自己的基因組中，這些片段上一般都含有某些特定功能的編碼基因，比如毒力基因、耐藥基因、代謝基因等，從而改變細菌的表型，協(xié)助細菌度過“困境”或占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位，這些可在基因組內(nèi)或基因組之間轉(zhuǎn)移遺傳信息的DNA片段統(tǒng)稱為可移動遺傳元件。細菌中可移動遺傳元件主要包括質(zhì)粒、基因島、前噬菌體、CRISPR-Cas等。經(jīng)分析，CR5301不含有質(zhì)粒，含有4 個基因島、1 個前噬菌體和14 個CRISPR-Cas編碼序列，詳細信息見表2。

基因功能分析顯示，基因島GI01和GI03分別含有1 個和4 個噬菌體同源基因，推測它們由噬菌體整合而來?；驆uGI04僅含有1 個重組酶基因，無噬菌體和質(zhì)粒特有基因，無法確定其來源。3 個基因島均不含有碳水化合物代謝酶基因。但分析發(fā)現(xiàn)，最大基因島GI02不僅含有多個碳水化合物代謝酶基因，而且含有4 個-葡萄糖苷酶基因（gene1874、gene1875、gene1884、gene1887），它們是CR5301水解RC葡萄糖基側(cè)鏈的候選基因，也可能是CR5301將RC轉(zhuǎn)化為甜菊醇的關(guān)鍵酶基因。同時，基因島GI02編碼1 個釋放酶基因（gene1870），而該基因是接合質(zhì)粒特有基因，因此推測GI02由1 個接合質(zhì)粒整合而來。前噬菌體Ph01不含有碳水化合物代謝酶基因，與分枝桿菌噬菌體D29含有多個高度同源蛋白，因此推測Ph01可能來自分枝桿菌噬菌體D29。從基因組中定位看，前噬菌體Ph01與基因島GI03大部分區(qū)域重疊，這表明基因島GI03很可能也來自分枝桿菌噬菌體D29。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，用來抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，如噬菌體、病毒和外源質(zhì)粒。它可以識別出外源DNA，并且沉默外源基因的表達。注釋分析發(fā)現(xiàn)，CR5301基因組含有14 個CRISPR-Cas編碼序列，重復(fù)序列、間隔序列和重復(fù)次數(shù)具有豐富的多性樣，這表明它在演化過程中經(jīng)受過復(fù)雜的外源質(zhì)粒和噬菌體入侵，已經(jīng)進化出比較健全的先天免疫機制。

表2 P. ilicis CR5301基因組中可移動元件Table 2 Mobile genetic elements in P. ilicis CR530’s genome

2.4 P. ilicis CR5301的基因組共線性和系統(tǒng)進化關(guān)系

經(jīng)檢索目前NCBI下Genome數(shù)據(jù)庫中共收錄31 個菌株基因組序列，分屬于6 個已知物種和未知物種，其中6 個菌株為完整基因組序列。雖然收錄2 個基因組序列，但2 個基因組測序均沒有組裝成完成圖，因此沒有用于基因組共線性分析。CR5301和6 個菌株基因組共線性分析結(jié)果如圖5A所示。基于基因組共線性，7 個菌株全基因組系統(tǒng)進化樹如圖5B所示。

圖5 P. ilicis CR5301基因組共線性和系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Genome collinearity and phylogenetic tree of P. ilicis CR5301

由圖5A可知，CR5301基因組是所有完整測序的中基因組最大的菌株，CR5301基因組94%以上區(qū)域與其他基因組顯示高度同源性和良好共線性。在7 個基因組中，CR5301和TC1基因組之間只在中間發(fā)生局部的缺失和插入突變，沒有發(fā)生倒位突變，顯示最高的同源性和最好的共線性。CR5301和CZY1基因組大小差異最大，表明它們之間發(fā)生最大范圍的缺失和插入突變，同時兩個基因組之間還發(fā)生1 個145 kb大片段（1 217 961～1 363 587 bp）和3 個小片段的倒位突變，因此這兩個基因組具有最低的同源性和共線性。此外，全基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，CR5301的基因島GI01與其他6 個菌株共有，而基因島GI02、GI03、GI04和前噬菌體Ph01均為菌株CR5301獨有，這些獨有的可移動元件，尤其是基因島GI02攜帶的碳水化合物活性酶很可能賦予CR5301獨特的碳水化合物代謝能力。圖5B可以更加直觀、清晰顯示7 個菌株基因組的系統(tǒng)進化關(guān)系，CR5301和TCI、YJN-D明顯聚類為一個分支，3 個菌株和YJN-5聚類為另一個分支，這表明在全基因組水平上CR5301與具有更近的親緣關(guān)系，而與的親緣關(guān)系較遠。

另一方面，CR5301和所有已知物種16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹（圖5C）分析顯示，所有物種形成3 個明顯聚類的進化分支，分支1由和聚類形成，分支2由單獨形成，分支3由、和聚類而成，CR5301明顯與的2 個菌株聚類。這些結(jié)果表明，在中，CR5301與親緣關(guān)系較近，與親緣關(guān)系較遠，這與全基因組系統(tǒng)進化樹（圖5B）分析結(jié)果一致，與Busse對菌屬分類定義時的研究結(jié)果一致。這進一步證明了基因組共線性分析結(jié)果的有效性和準確性，為CR5301的系統(tǒng)進化、分類鑒定和比較基因組學(xué)研究提供了可靠的佐證和依據(jù)。

2.5 P. ilicis CR5301碳水化合物活性酶

CAZy數(shù)據(jù)庫是碳水化合物活性酶類專業(yè)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，可將不同來源的碳水化合物活性酶分成6大類。經(jīng)CAZy注釋分析，CR5301共編碼174 個碳水化合物活性酶基因，這些基因的功能分類信息見圖6。綜合COG、GO、KEGG和CAZy數(shù)據(jù)庫注釋分析，分別找到379、163、301 個和174 個碳水化合物活性酶基因，去冗余分析后，CR5301基因組共含有523 個碳水化合物活性酶基因。

圖6 P. ilicis CR5301基因的CAZy注釋和分類Fig. 6 CAZy annotation and classification of P. ilicis CR5301’s genes

2.6 P. ilicis CR5301轉(zhuǎn)化RC關(guān)鍵糖苷酶分析

為進一步篩選和挖掘CR5301轉(zhuǎn)化RC功能的關(guān)鍵酶基因，對底物RC和終產(chǎn)物甜菊醇的分子結(jié)構(gòu)進行比較分析。由圖7可知，RC轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物甜菊醇涉及4 個化學(xué)鍵的水解，包括C19位的-葡萄糖基酯鍵、C13位與槐糖基連接的糖苷鍵、-1,3-葡萄糖苷鍵和-1,2-鼠李糖苷鍵，因此可以水解這些化學(xué)鍵的糖苷酶很可能是CR5301轉(zhuǎn)化RC的關(guān)鍵酶。以往研究表明，少數(shù)-半乳糖苷酶具有水解甜菊糖甙C19位和C13位糖基側(cè)鏈的功能，因此，除了-葡萄糖苷酶和-鼠李糖苷酶，-半乳糖苷酶也可能是RC轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。經(jīng)功能注釋檢索分析，綜合COG、GO、KEGG和CAZy數(shù)據(jù)庫注釋并去冗余獲得的523 個碳水化合物活性酶中，發(fā)現(xiàn)11 個-葡萄糖苷酶基因、5 個-半乳糖苷酶基因、1 個-鼠李糖苷酶基因和1 個同時注釋兩種糖苷酶活性基因（注釋信息見表3）。同時利用這3 個酶關(guān)鍵詞在NR、Swiss-Prot和Pfam數(shù)據(jù)庫注釋基因中進行檢索，沒有發(fā)現(xiàn)新的基因。因此，通過上述7 個數(shù)據(jù)庫綜合分析，發(fā)現(xiàn)CR5301含有18 個轉(zhuǎn)化RC關(guān)鍵糖苷酶候選基因。

圖7 RC和甜菊醇化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 7 Chemical structures of rebaudioside C and steviol

表3 P. ilicis CR5301轉(zhuǎn)化RC的關(guān)鍵酶候選基因Table 3 Candidate genes for key enzymes of strain CR5301 for transforming RC

為了進一步了解關(guān)鍵糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)，通過ProtParam等軟件對這些糖苷酶的物化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測分析，結(jié)果如表4所示。分析發(fā)現(xiàn)，4 個糖苷酶基因（gene0496、gene0759、gene3111、gene4409）具有信號肽序列，其中2 個基因（gene3111、gene4409）產(chǎn)物具有跨膜結(jié)構(gòu)域，同時親水系數(shù)預(yù)測顯示只有這2 個基因產(chǎn)物為非水溶性蛋白，這表明gene0496和gene0759產(chǎn)物可能是分泌蛋白，gene3111和gene4409產(chǎn)物可能是膜蛋白，因此，這4 個基因?qū)τ谘芯緾R5301胞外RC轉(zhuǎn)化能力更有針對性，而其他不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域基因，很可能負責(zé)CR5301細胞質(zhì)中RC轉(zhuǎn)化功能。另一方面，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)預(yù)測顯示，大多數(shù)基因產(chǎn)物不穩(wěn)定系數(shù)小于40閾值，只有4 個基因產(chǎn)物稍大于40，這表明這些糖苷酶大多數(shù)穩(wěn)定性較好，只有4 個蛋白穩(wěn)定性較差，有利于今后的工業(yè)化應(yīng)用。由表4可知，這些糖苷酶二級結(jié)構(gòu)中主要以無規(guī)卷曲和-螺旋為主。酶的功能部位常常位于無規(guī)卷曲構(gòu)象區(qū)域，因為無規(guī)卷曲可使空間結(jié)構(gòu)中的自由能達到最大而促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。18 個糖苷酶中，gene0759的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲含量最高55.10%，此外不穩(wěn)定系數(shù)最低23.38，表明gene0759產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和耐熱穩(wěn)定性可能最佳。

表4 關(guān)鍵酶基本物化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)Table 4 General physicochemical properties and secondary structure composition of key enzymes

3 結(jié) 論

基因組裝和預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，CR5301基因組為一個閉合環(huán)狀染色體DNA分子，不含有質(zhì)粒，染色體基因組序列全長4 748 281 bp，GC含量62.92%，共含有4 458 個編碼基因，包括18 個rRNA操縱子和54 個tRNA。同時，該基因組含有4 個基因島、1 個前噬菌體和14 個CRISPR-Cas編碼序列，基因島GI01可能來源于噬菌體，基因島GI02可能來源于接合性質(zhì)粒，前噬菌體Ph01和基因島GI03可能起源于分枝桿菌噬菌體D29。

CR5301是物種第1個測定基因組完成圖的菌株，基因組共線性分析發(fā)現(xiàn)，也是屬已知基因組最大的菌株。全基因組系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，CR5301與具有更近的親緣關(guān)系，而與的親緣關(guān)系較遠。16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果同樣支持這個結(jié)論。

基因注釋和功能分類分析發(fā)現(xiàn)，CR5301基因組在NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別注釋到4 458、3 095、3 600、3 749、2 439 個和1 975 個功能基因。通過基因功能統(tǒng)計分類，在COG、GO、KEGG和CAZy數(shù)據(jù)庫中，分別找到379、163、301 個和174 個碳水化合物活性酶基因，去冗余分析后，CR5301基因組共含有523 個碳水化合物活性酶基因。之后通過底物RC和終產(chǎn)物甜菊醇分子結(jié)構(gòu)比較，精準定位了RC轉(zhuǎn)化需要水解的化學(xué)鍵和對應(yīng)的糖基水解酶，最終在7 個數(shù)據(jù)庫注釋基因中發(fā)現(xiàn)18 個轉(zhuǎn)化RC關(guān)鍵糖苷酶候選基因。最后，通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測了18 個糖苷酶的物化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，為今后進一步縮小CR5301轉(zhuǎn)化RC的關(guān)鍵酶基因提供了非常重要的參考和基礎(chǔ)。

總之，CR5301基因組完成圖的測定，不僅為CR5301的RC轉(zhuǎn)化機制研究提供清晰、完整的遺傳信息，并且為物種的遺傳、進化、生理、代謝研究首次提供了完整、可靠的參考基因組序列，這對今后的生物學(xué)研究具有重要的參考價值和普遍的借鑒意義。