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    熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的影響

    2022-10-09 01:57:40張園園李苗云趙莉君朱瑤迪趙改名馬陽陽
    食品科學(xué) 2022年18期
    關(guān)鍵詞:莢膜產(chǎn)氣梭菌

    張園園,李苗云,趙莉君,朱瑤迪,趙改名,梁 棟,馬陽陽,劉 純

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

    產(chǎn)氣莢膜梭菌()是一種革蘭氏陽性厭氧致病菌,廣泛分布于空氣、水、土壤、食物、動物以及人類的胃腸道中,是引發(fā)食源性疾病,導(dǎo)致人類食物中毒的主要病原菌之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌在外界環(huán)境不利條件下(如低溫/干燥或營養(yǎng)缺乏等)極易形成芽孢休眠體,其芽孢具有含水量低、抗逆性強(qiáng)和休眠特性等特點,對各種惡劣環(huán)境(包括高溫、高壓、輻射、有毒有害化學(xué)物質(zhì)、酸或堿等)具有極強(qiáng)抵抗力,在食品工業(yè)滅菌后仍可存活。當(dāng)外界存在合適的萌發(fā)因子或適合萌發(fā)的條件,芽孢會迅速萌發(fā)生長,恢復(fù)繁殖,失去休眠特性和芽孢抗性,產(chǎn)生可以引起食物腐敗變質(zhì)或?qū)е率吃葱约膊〉亩舅鼗蛎?。芽孢休眠體向營養(yǎng)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵一步,因此芽孢萌發(fā)被認(rèn)為是產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢污染的第一階段。

    熱激可提高許多芽孢桿菌及其相關(guān)物種的芽孢萌發(fā)速率和萌發(fā)程度。在自然條件下,芽孢的萌發(fā)速率十分緩慢,但熱激可促進(jìn)90%以上的芽孢種群萌發(fā)。不同種屬的芽孢表現(xiàn)出不同熱激要求,對于產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢,最常用的熱激條件是75 ℃處理10~20 min。90 ℃以上熱激溫度處理的芽孢萌發(fā)效果低于60~80 ℃熱激處理。熱激對芽孢的作用過程與芽孢蛋白結(jié)構(gòu)的變化和各種芽孢分子的釋放密切相關(guān),該過程可能涉及一些芽孢蛋白中化學(xué)鍵(例如氫鍵)的斷裂。目前關(guān)于熱激的調(diào)控機(jī)制和熱激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的動態(tài)變化尚未得到系統(tǒng)研究。

    芽孢主要具有7 層結(jié)構(gòu),由外到內(nèi)依次是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和內(nèi)核。芽孢內(nèi)膜上存在超過300 種蛋白質(zhì),其中與芽孢萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)基本上都位于芽孢內(nèi)膜,如萌發(fā)受體蛋白和通道蛋白等,這些蛋白質(zhì)在芽孢萌發(fā)的不同階段起到信號傳導(dǎo)、門控機(jī)制等重要作用。芽孢內(nèi)膜與營養(yǎng)體細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)組成存在較大差異,主要體現(xiàn)在萌發(fā)受體蛋白GRs和吡啶-2,6-二羧酸鈣(Ca-dipicolinic acid,Ca-DPA)通道蛋白-spoVA家族蛋白,此類蛋白不存在于營養(yǎng)體細(xì)胞中。Luu等研究發(fā)現(xiàn)熱激是通過直接激活芽孢桿菌GRs蛋白引起芽孢萌發(fā);Wang Guiwen等發(fā)現(xiàn),濕熱處理主要影響產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的Ca-DPA釋放過程中的一些重要蛋白。有研究證明枯草芽孢桿菌中spoVA蛋白與GRs存在物理作用,該過程可能涉及芽孢萌發(fā)期間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然已經(jīng)確定了芽孢萌發(fā)時的一些物理變化以及參與這一過程的蛋白質(zhì),但關(guān)于芽孢萌發(fā)的生理途徑仍不清楚。分析熱誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)過程中芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的變化對于深入解析萌發(fā)蛋白作用機(jī)制具有重要意義。

    因此本實驗以產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白為研究對象,以25 ℃處理為空白對照,選擇37、75、95 ℃對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白進(jìn)行熱激處理,以研究不同溫度熱激對芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的影響(圖1)。旨在為進(jìn)一步揭示熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白功能的影響提供了理論基礎(chǔ),也為高效、定向控制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

    圖1 熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的探究流程圖Fig. 1 Experimental flow chart of this study

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實驗室從漲袋的鹽焗雞中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌C1,并由華大基因有限公司通過全基因組測序鑒定用于本研究。

    -環(huán)絲氨酸溶液、蛋白胨 青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司;胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(tryptone sulfite cycloserine,TSC)瓊脂基礎(chǔ)、皰肉牛肉粒、產(chǎn)芽孢肉湯、液體硫乙醇酸鹽(fluid thioglycollate,F(xiàn)TG)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫蘇糖醇(-dithiothreitol,DTT)、核糖核酸酶A(RNase A)、脫氧核糖核酸酶I(DNase I)、溶菌酶、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、尿素、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、蛋白上樣緩沖液、溶菌酶、Tris、彩虹Marker、1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)索萊寶生物科技有限公司;革蘭氏陽性菌膜蛋白提取試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司;10-壬基吖啶橙(nonyl acridine orange,NAO) 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;MgCl、HCl(均為分析純);碘海醇挪威Axis-shield公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;TU-1901型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HIRAYAMA-HVE50高壓滅菌器 華粵行儀器有限公司;Electrotek AW200SG厭氧工作站 英國Electrotek公司;熒光顯微鏡 日本Olympus公司;Zeta電位儀 英國Malvern公司;激光共聚焦拉曼光譜儀 日本Horiba公司;熒光光譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ECLIPSE 80i生物顯微鏡日本Nikon公司。

    1.3 方法

    1.3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢培養(yǎng)及菌懸液的制備

    參考Zhu Yaodi等方法制備芽孢,從TSC平板上挑取典型的黑色菌落接種到庖肉培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。取該菌液接種到新制備的FTG中,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,得到芽孢懸浮液。將芽孢7 000 r/min、4 ℃離心20 min,用0.1%無菌蛋白胨水重復(fù)洗滌芽孢懸浮液2 次,將離心洗滌的芽孢重新懸浮保存于無菌蛋白胨水中,使用生物顯微鏡進(jìn)行鏡檢,當(dāng)芽孢純度在95%以上時使用碘海醇進(jìn)行芽孢和菌體的進(jìn)一步分離純化,當(dāng)純度達(dá)到99.9%時收集芽孢,置于-20 ℃保存。

    1.3.2 芽孢內(nèi)膜級分及內(nèi)膜蛋白的提取

    將芽孢與配制的反應(yīng)液以1∶1比例混合(50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L 尿素、1% SDS、50 mmol/L DTT),37 ℃水浴90 min,13 200 r/min、4 ℃離心5 min,將沉淀用150 mmol/L NaCl溶液洗滌4 次,無菌水洗滌4 次后保留沉淀。將去除芽孢衣的芽孢以O(shè)D為50~70懸浮在TEP緩沖液中(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF),加入1 mg溶菌酶、1 μg RNase A、1 μg DNase I和20 μg MgCl。然后將芽孢懸浮液37 ℃孵育5 min,在冰上冷卻20 min后,將芽孢懸浮液用100 mg玻璃珠短暫超聲處理,在顯微鏡下檢查裂解情況,并在微離心機(jī)中以最大速度離心5 min,并保存上清液。后續(xù)使用革蘭氏陽性菌膜蛋白提取試劑盒進(jìn)行膜蛋白的提取。

    1.3.3 熒光染色劑NAO染色

    熒光染色劑NAO可標(biāo)記芽孢內(nèi)膜,通過染色程度可判斷芽孢外部各層結(jié)構(gòu)的去除情況,為確保實驗步驟1.3.2節(jié)方法可以去除芽孢外層結(jié)構(gòu),對處理后的芽孢進(jìn)行熒光染色。熒光染色過程如下:將芽孢液和去除芽孢各層結(jié)構(gòu)的芽孢懸浮液與熒光染色劑NAO(200 nmol/L)在室溫下避光共同孵育1 h后,10 000 r/min離心10 min,將沉淀用PBS洗滌至去掉染色劑。然后將處理后的樣品在激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長528 nm下進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

    1.3.4 SDS-PAGE分析

    采用蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的分子質(zhì)量分布。選用5%的濃縮膠和12%的分離膠,蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL。向內(nèi)膜蛋白樣品中加入上樣緩沖液,沸水浴5 min。初始電壓設(shè)定為90 V,進(jìn)入分離膠時設(shè)定為120 V。電泳結(jié)束后將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色,脫色后使用凝膠成像儀掃描成像。

    1.3.5 粒徑分布

    利用Zeta電位儀中動態(tài)光散射測定不同溫度熱激后內(nèi)膜蛋白的粒徑分布。蛋白質(zhì)樣品用PBS稀釋至0.1 mg/mL,比色皿的光程為1 cm,測定溫度為25 ℃。利用自帶軟件分析檢測測定結(jié)果,當(dāng)測定結(jié)果顯示為良好時檢測結(jié)果方可使用。

    1.3.6 紫外-可見光譜掃描

    將芽孢內(nèi)膜蛋白樣品用PBS稀釋至0.1 mg/mL。設(shè)置紫外分光光度計掃描范圍為200~400 nm,掃描速率為100 nm/min。

    1.3.7 熒光光譜掃描

    用PBS調(diào)節(jié)內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL,設(shè)置激發(fā)波長290 nm,發(fā)射波長范圍300~460 nm,狹縫均為5.0 nm進(jìn)行掃描。

    1.3.8 蛋白質(zhì)表面疏水性測定

    參考Chelh等方法并適當(dāng)修改。取1.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的芽孢內(nèi)膜蛋白溶液,加入12 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液,渦旋振蕩10 min,使樣品和溴酚藍(lán)溶液混勻,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,用相應(yīng)的PBS作空白對照,在595 nm波長處測定吸光度。表面疏水性計算公式如下:

    1.3.9 拉曼光譜

    參考Yu Dianyu等方法,將內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL,在進(jìn)行校正后開始光譜掃描。本研究使用拉曼分析儀在室溫下進(jìn)行,激發(fā)波長為532 nm,系統(tǒng)積分時間為30 s,光譜采集范圍400~2 000 cm。每個樣品至少隨機(jī)抽取5 個點進(jìn)行測量以保證數(shù)據(jù)可靠。所有拉曼光譜均使用HORIBA公司自帶軟件進(jìn)行處理。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    每組實驗均設(shè)置3 次重復(fù),采用Origin 2018軟件進(jìn)行圖形繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜級分的提取鑒定及內(nèi)膜蛋白的提取

    熒光染色劑NAO可以和芽孢內(nèi)膜磷脂分子結(jié)合,當(dāng)芽孢衣和皮層等外部各層結(jié)構(gòu)未被去除時,NAO染色劑無法到達(dá)芽孢內(nèi)膜,去除后可以在熒光顯微鏡下觀察到熒光,故可以通過染色效果判斷外層結(jié)構(gòu)的去除效果。如圖2所示,未經(jīng)處理的芽孢懸浮液,其染色效果較差,熒光顯微鏡視野暗淡;去除芽孢外部各層結(jié)構(gòu)后進(jìn)行染色的芽孢,其芽孢內(nèi)膜的磷脂暴露,染色效果好,熒光顯微鏡視野明亮。以上結(jié)果表明,實驗所用的芽孢均已有效去除芽孢外部各層結(jié)構(gòu),后續(xù)實驗均使用去除芽孢各層結(jié)構(gòu)后的內(nèi)膜級分進(jìn)行芽孢內(nèi)膜蛋白的提取,通過蛋白質(zhì)定量分析試劑盒測定提取出的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)量濃度為6 mg/mL,分子質(zhì)量范圍在35~75 kDa之間(圖3)。

    圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢熒光染色觀察圖Fig. 2 Fluorescence staining observation of C. perfringens spores

    圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE patterns of C. perfringens spore inner membrane proteins

    2.2 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的粒徑分布情況

    粒徑可以表征蛋白質(zhì)的聚集程度,同時也能反映蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化,蛋白粒徑的變化也會對蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響。不同溫度熱激處理20 min后芽孢內(nèi)膜蛋白粒徑分布如圖4所示??瞻捉M芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)粒徑主要分布在70~170 nm之間,不同溫度熱激對芽孢內(nèi)膜蛋白溶液體系的影響不同。37 ℃處理后的內(nèi)膜蛋白粒徑分布與對照組無明顯差異。在75 ℃熱激后,內(nèi)膜蛋白粒徑分布均勻穩(wěn)定,主峰位置向大粒徑方向偏移,粒徑分布在85~205 nm之間。該結(jié)果表明75 ℃熱激提高了內(nèi)膜蛋白粒徑分布均勻性。粒徑的變化主要是由蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的交聯(lián)和聚集造成,熱激增加了蛋白質(zhì)之間的碰撞和聚集速度,從而形成蛋白質(zhì)的聚集。蛋白質(zhì)的聚集可能是由于非共價相互作用,如疏水相互作用,75 ℃熱激處理后內(nèi)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化,親水基團(tuán)埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部,疏水基團(tuán)暴露并重新聚集成具有較大粒徑的蛋白質(zhì)聚合物,這與陳振家等的研究結(jié)果一致。95 ℃熱活化后,內(nèi)膜蛋白粒徑分布變寬,粒徑分布向大粒徑方向顯著偏移,蛋白質(zhì)發(fā)生明顯聚集或變性現(xiàn)象,此時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能被破壞。

    圖4 不同溫度熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白粒徑分布的影響Fig. 4 Effect of heat stress at different temperatures on the particle size distribution of C. perfringens spore inner membrane proteins

    2.3 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的紫外-可見光譜分析

    通過蛋白質(zhì)的紫外-可見吸收光譜強(qiáng)度測定,可以由氨基酸微環(huán)境的變化推斷蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變。芽孢內(nèi)膜蛋白樣品在280 nm波長附近會出現(xiàn)色氨酸與酪氨酸特征吸收峰。蛋白質(zhì)中氨基酸微環(huán)境的變化會引起蛋白質(zhì)最大吸收波長發(fā)生紅移或者藍(lán)移,從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。如圖5所示,37 ℃熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白紫外光譜相對25 ℃空白組無明顯差別。75 ℃熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白紫外光譜熒光強(qiáng)度增加,表明熱激后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氨基酸殘基暴露,芽孢內(nèi)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。95 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的吸收峰降低,這可能是高溫導(dǎo)致蛋白發(fā)生自聚集反應(yīng)。

    圖5 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的紫外光譜圖Fig. 5 UV absorption spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

    2.4 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的熒光光譜圖

    表1 不同最大發(fā)射波長處Trp殘基所在的狀態(tài)Table 1 Status of Trp residues at different maximum emission wavelengths

    圖6 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

    內(nèi)源熒光光譜是推測蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)變化的一種重要方法,蛋白質(zhì)熒光主要取決于自身芳香族氨基酸殘基所處環(huán)境的極性,熒光基團(tuán)的猝滅和熒光發(fā)射峰位的減少是分析蛋白質(zhì)結(jié)合的有用指標(biāo)。在295 nm處只有Trp被激發(fā),而Tyr不會被激發(fā)。參考表1,如圖6A所示,當(dāng)激發(fā)波長為295 nm時,不同溫度熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白的最大發(fā)射波長()均在310~330 nm范圍內(nèi),表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部部分疏水環(huán)境中。75 ℃熱激引起產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng),且伴隨輕微藍(lán)移,這表明75 ℃熱激可能破壞了蛋白質(zhì)分子間的疏水鍵,使內(nèi)膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致分子內(nèi)的Trp殘基暴露,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在280 nm激發(fā)波長下熒光強(qiáng)度是Tyr和Trp兩種氨基酸產(chǎn)生的熒光之和。75 ℃熱激活后,內(nèi)膜蛋白Tyr的熒光強(qiáng)度明顯低于空白組(圖6B),表明芽孢內(nèi)膜蛋白之間可能發(fā)生相互作用,將Tyr殘基帶到極性環(huán)境中,導(dǎo)致熒光猝滅。

    2.5 不同熱激溫度對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的表面疏水性的影響

    表面疏水性主要利用蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸與8-苯氨-1-萘磺酸探針的特異性結(jié)合進(jìn)行測定,表面疏水作用力在維持蛋白三級結(jié)構(gòu)及功能特性等方面起著非常重要的作用,可用于反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化情況。如圖7所示,37 ℃熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白表面疏水性與對照組相比無明顯差異,75 ℃熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)展開,埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,表面疏水性增強(qiáng)。許英一等在研究熱處理后改性燕麥蛋白的影響時也發(fā)現(xiàn),熱處理能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)的表面疏水性,增加有利于蛋白質(zhì)無定形或纖維狀聚集體的形成。當(dāng)95 ℃熱激處理時,芽孢內(nèi)膜蛋白表面疏水性下降(<0.05),可能是由于95 ℃熱激后,芽孢內(nèi)膜蛋白通過疏水相互作用聚集形成蛋白質(zhì)聚集物-簇,將暴露的少量疏水性殘基重新包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部,從而使表面疏水性下降。

    圖7 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的表面疏水性Fig. 7 Surface hydrophobicity of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

    2.6 不同熱激溫度對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

    拉曼光譜強(qiáng)度與散射中心(化學(xué)鍵和基團(tuán))的數(shù)量正相關(guān),因此樣品的拉曼光譜強(qiáng)度變化可以作為確定蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵或基團(tuán)變化程度的依據(jù),推測分析蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的變化,以及獲取如蛋白質(zhì)主鏈、側(cè)鏈和二硫鍵的信息。圖8為不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白在400~2 000 cm范圍內(nèi)的拉曼光譜。拉曼光譜中的酰胺I帶(1 630~1 700 cm)和酰胺III帶(1 230~1 248、1 242~1 250、1 264~1 310 cm)的特征峰決定了蛋白質(zhì)的構(gòu)象,可用于研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定量分析。酰胺I主要涉及C=O和C—N的拉伸,酰胺III主要涉及C—N的拉伸和NH的平面躍遷。然而,由于酰胺III所涉及的信息比較復(fù)雜,通過酰胺I帶分析熱激后芽孢內(nèi)膜蛋白二級結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn),在拉曼光譜中,蛋白質(zhì)酰胺I帶中-螺旋結(jié)構(gòu)歸屬于1 600~1 611 cm,-折疊結(jié)構(gòu)歸屬于1 614~1 625 cm,-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)歸屬于1 625~1 632 cm,無規(guī)卷曲特征振動頻率為1 604~1 619 cm。

    圖8 不同溫度熱激后產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的拉曼光譜圖Fig. 8 Raman spectra of C. perfringens spore inner membrane proteins after heat stress at different temperatures

    如圖9所示,空白組中芽孢內(nèi)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)為-螺旋27.43%、-折疊22.49%、-轉(zhuǎn)角15.48%和無規(guī)卷曲34.60%,其中-螺旋、-折疊和無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)。拉曼光譜結(jié)果表明,熱激可顯著影響產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)(<0.05)。與空白組相比,37 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)無明顯變化。75 ℃熱激后的蛋白質(zhì)-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降3.17%、-折疊結(jié)構(gòu)含量降低3.94%、無規(guī)卷曲比例上升8.31%。-螺旋主要靠肽鏈內(nèi)部的氫鍵維持,75 ℃熱激破壞了維持-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵,導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)加強(qiáng);研究表明,-折疊依賴于肽鏈之間的氫鍵,-折疊結(jié)構(gòu)含量下降表明蛋白質(zhì)的疏水位點的暴露,75 ℃熱激后蛋白質(zhì)肽鏈展開,表面疏水性增加;75 ℃熱激后內(nèi)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)由有序狀態(tài)逐漸向無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)化。這與許晶等的報道一致,-螺旋含量降低,無規(guī)卷曲含量升高,即二級結(jié)構(gòu)由-螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時,分子結(jié)構(gòu)更為松散,包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露出來,導(dǎo)致表面疏水性的增加。95 ℃熱激后的蛋白中-螺旋和-折疊結(jié)構(gòu)含量增加,無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例降低。

    圖9 不同溫度熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 9 Effect of heat stress at different temperatures on the secondary structure content of C. perfringens spore inner membrane proteins

    3 結(jié) 論

    不同熱激溫度(37、75、95 ℃)對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白理化特性的影響存在差異。37 ℃熱激處理對芽孢內(nèi)膜蛋白的理化特性無明顯影響。75 ℃熱激破壞了維持-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵,導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)加強(qiáng),氨基酸微環(huán)境改變,疏水位點暴露,蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。95 ℃熱激處理導(dǎo)致芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)被破環(huán),并發(fā)生明顯聚集或變性。綜上所述,75 ℃熱激可使產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)更為豐富,該過程可能涉及多種蛋白質(zhì)的相互作用,深入研究芽孢內(nèi)膜蛋白質(zhì)的相互作用過程對于解析芽孢萌發(fā)機(jī)制具有重要意義。該結(jié)論為揭示熱激對產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢內(nèi)膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響提供了一定科學(xué)依據(jù),也為了解產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)相關(guān)蛋白的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

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