黃芩素通過抑制氧化應(yīng)激與凋亡改善小鼠心肌重構(gòu)的作用研究

宋 麗,王 躍,田 飛，錢 凱

宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院(江西 宜春 336000)

心血管疾病是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一，大多數(shù)病例是缺血性心臟病。當(dāng)血液中的膽固醇開始在動脈壁上積聚時(shí)，就會發(fā)展為缺血性心臟病，使動脈變窄并最終阻塞血流[1]。在病理性的刺激下，心臟早期可出現(xiàn)病理性心肌肥厚，是具有代償作用的保護(hù)機(jī)制；若未得到改善，加重心臟代償出現(xiàn)心肌纖維化，進(jìn)而出現(xiàn)心室重構(gòu)等嚴(yán)重癥狀[2]。心室重構(gòu)表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外膠原增生及心室腔形態(tài)的變化，并同時(shí)伴有心臟舒縮功能的影響[3]。研究發(fā)現(xiàn)免疫-炎癥反應(yīng)在心肌重構(gòu)過程中具有重要作用，也是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，阻斷炎癥反應(yīng)能有效改善心肌重構(gòu)[4]。

心肌組織中過量的自由基會導(dǎo)致能量失衡、線粒體功能紊亂、p53激活、脂質(zhì)過氧化引起細(xì)胞膜損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[5]。研究表明[6]阿霉素誘導(dǎo)的自由基觸發(fā)線粒體細(xì)胞色素c釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，從而減少心肌細(xì)胞數(shù)量，左室壁變薄，由于后負(fù)荷增加，對心臟的壓力增加，左室的整體功能下降，導(dǎo)致心肌病的發(fā)展。此外，由于線粒體膜完整性喪失和p53活性增高，心臟中活性氧(ROS)的產(chǎn)生促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和凋亡改變[7]。而機(jī)體的內(nèi)源性防御機(jī)制如抗氧化劑抑制自由基產(chǎn)生，防止細(xì)胞內(nèi)損傷，改善ROS的危害作用。因此，恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化劑可能是保護(hù)心臟氧化損傷的有效策略。

黃芩素(Baicalein,Bai)是來源于黃芩根的主要黃酮類化合物之一，有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、和抗過敏作用[8]。由于其抗氧化或抗炎活性，大多數(shù)研究集中于慢性退行性疾病中的保護(hù)作用。研究表明[9]Bai通過降低自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞中12-脂氧合酶的表達(dá)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase，MMP-9)及胞外信號介導(dǎo)激酶的活性，抑制左心室I型和III型前膠原mRNA和蛋白質(zhì)的合成，減輕心肌纖維化，從而降低高血壓大鼠的血壓。在對培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系統(tǒng)的研究中，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L Bai和黃芩苷可保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的損傷[10]。因此，本研究通過建立ISO導(dǎo)致小鼠心肌損傷模型，探討B(tài)ai對心肌損害的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1化學(xué)品、試劑盒和抗體Bai(純度≥98.0%、麥克林、B802463)、異丙腎上腺素(I129810、阿拉丁)、二甲亞砜(ST038、碧云天)、丙二醛(MDA、S0131S、碧云天)、乳酸脫氫酶(LDH、A020-2-2、南京建成研究所)、肌酸激酶同工酶(CK-MB、H197-1-1、南京建成研究所)；谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)檢測試劑盒(S0052、碧云天)、H&E染色試劑盒(G1120、Solarbio)、Masson染色試劑盒(G1340、Solarbio)；抗體P-AKT(AF5740)、AKT(AF1777)、SOD1(AF8028)、CAT(AF0084)、caspase-3 (AF0081)、caspase-9(AF1264)、核因子-κB(NF-κB)(p65)(AF0246)、I型膠原纖維(Collagen I)(AF2740)、BNP(AF6336)、辣根過氧化物酶(A0208)均購自碧云天公司；抗體Bax(2774)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)(3498)、alpha(2122)、腫瘤壞死因子(TNF-α)(3707)、白介素-6(IL-6)(12153)、p-Smad2(3108)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)(4255)均購自Cell Signaling公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法雄性SPF級小鼠，10～12周齡(體質(zhì)量35～40 g)，宜春學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)在醫(yī)學(xué)院動物中心，控制環(huán)境條件，光照/黑暗周期為12/12 h。給小鼠自由喂食鼠糧和水。實(shí)驗(yàn)開始前，動物馴化7 d。實(shí)驗(yàn)方案符合宜春學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的要求，所有程序均嚴(yán)格按照動物使用和護(hù)理的倫理原則進(jìn)行，倫理審查批準(zhǔn)號(2022012)。試驗(yàn)設(shè)小鼠供試品ISO(5.0 mg/mL)進(jìn)行造模，連續(xù)腹腔注射15 d，建立心肌肥厚模型(ISO)。小鼠隨機(jī)分成4組：空白對照組(Con組)、陽性對照組(Con+Bai組)、模型組(ISO組)、模型給藥Bai組(ISO+Bai組),造模過程中有2只老鼠死亡，死亡率不超過10%，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在造模成功次日開始給藥，Bai加入20%DMSO配成濃度15 mg/mL的液體，Con+Bai組、ISO+Bai組腹腔注射50 mg/kg，隔天給藥，共14 d。

最后1次給藥24 h后記錄所有實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量，通過眼球采集血樣，解剖收集心臟組織，稱重，液氮冷凍以停止代謝活動，并保存在-80℃，待進(jìn)一步分析。計(jì)算心肌組織相對質(zhì)量，評估Bai對ISO所致心肌組織質(zhì)量變化的影響。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1 心臟質(zhì)量比、超聲心動圖的檢測 給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，收集心臟大體圖，記錄所有實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量、心臟質(zhì)量，計(jì)算心肌組織相對質(zhì)量。采用小動物超聲檢測小鼠心功能水平。小鼠異氟烷麻醉后，脫毛膏將頸部至胸部皮毛脫掉后涂抹耦合劑后采用相應(yīng)探頭進(jìn)行超聲觀察，并計(jì)算小鼠左心室內(nèi)徑(Left ventricular diameter，LVIDd)、左室間隔直徑(left ventricular septal diameter，LVSd)、左心室后壁直徑(Left ventricular posterior wall diameter，LVPWd)水平變化。

1.3.2 心臟損傷的血清標(biāo)志物評估 通過眼球采集血樣，4 000 r/min離心15 min，收集上清液，液氮冷凍以停止代謝活動，并保存在-80℃，待進(jìn)一步分析。測定血清特異性損傷生物標(biāo)志物，如乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、丙二醛(MDA)。按照其試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀于450 nm或405 nm波長處測各孔吸光度(D)值。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查 心臟組織樣本在10%中性緩沖福爾馬林中室溫固定48 h，增加乙醇濃度脫水，二甲苯清除，石蠟包埋，制備約5 μm厚的切片，進(jìn)行HE染色(脫蠟至水，蘇木素染4 min，洗去浮色，分化液15 min，水洗；置伊紅5 min，水洗；梯度脫水，透明，樹膠封片)和Masson染色(脫蠟至水，Weigert氏鐵蘇木素染5 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗3 min返藍(lán)；麗春紅酸性品紅液染5 min，蒸餾水漂洗；磷鉬酸水溶液3 min后苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸分化1 min；梯度脫水，透明，樹膠封片)。光鏡下(Zeiss顯微鏡、Axioplan 2 Imaging、Axiovision軟件)評估切片的結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4 蛋白提取和蛋白印跡分析 制備心臟組織的蛋白組分，并進(jìn)行Western blot分析，將心臟組織樣本使用勻漿器在冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(50 mM,pH 7.4)中均質(zhì)，獲得10%的心臟組織勻漿。勻漿在4℃，12 000 r/min離心30 min，得到清晰的上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按照蛋白上樣緩沖液比例制備上樣液，Loading buffer變性后進(jìn)行電泳，每泳道上樣蛋白20 μg，SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌3次，10 min/次，加入一抗NF-κB(p65)、Bax、Bcl-2、caspase-3、SOD1、PI3K、P-AKT、p-Smad2等蛋白(稀釋比例1∶1 000)，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，1 h后，TBST洗滌3次，10min/次，按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用3 min后，使用ECL Western印跡試劑進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 Bai對ISO所致小鼠心臟損傷的影響與Con組比較，ISO組心臟質(zhì)量、體積、收縮期與舒張期LVPWd與IVSd明顯增加、心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH水平均升高、MDA含量增加(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+Bai組心臟質(zhì)量、體積、收縮期與舒張期LVPWd與IVSd有所下降、心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH活性下降、MDA含量降低(P<0.05)。HE染色顯示，Con組和Bai單獨(dú)處理的小鼠形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙正常，未見水腫。與Con組比較，ISO組小鼠心肌細(xì)胞多灶性變性和壞死，表現(xiàn)為心肌纖維丟失，伴有廣泛的胞漿空泡化和肌纖維變性；ISO+Bai組心肌損傷較輕，心臟形態(tài)幾乎完整，無空泡化和退行性改變，見圖1，表1。

注：A：小鼠心臟大體圖；B：超聲心動圖；C：HE染色的變化(×100)。圖1 Bai對心肌損傷的影響變化

表1 4組小鼠CK-MB、LDH、MDA和HW/BW水平以及小鼠的血液動力學(xué)參數(shù)的比較

2.2 Bai對心肌纖維化的影響Masson染色顯示Con組和Con+Bai處理組心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管外未出現(xiàn)膠原纖維化，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組細(xì)胞間質(zhì)和血管外周纖維化(藍(lán)色)顯著增多；與ISO組比較，ISO+Bai組顯示心肌纖維化明顯增多(淺紅色)，見圖2。Western blot檢測顯示，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組BNP、alpha、p-Smad2、Collage I蛋白表達(dá)上調(diào)；與ISO組比較，ISO+Bai組p-Smad2、Collagen I蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，顯示Bai能夠抑制ISO導(dǎo)致的心肌損傷，并降低心肌纖維化程度，見圖3。

注：A:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測的蛋白表達(dá);B:根據(jù)Western blot條帶繪制的BNP蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;C:根據(jù)Western blot條帶繪制的alpha蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;D:根據(jù)Western blot條帶繪制的p-Smad2蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;E:根據(jù)Western blot條帶繪制的Collagen I蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;與Con組比較，*:P<0.05，與ISO組比較，**:P<0.05。

2.3 Bai對心肌細(xì)胞凋亡的影響Western blotting結(jié)果顯示，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組caspase-3、caspase-9、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+Bai組caspase-3、caspase-9、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，結(jié)果顯示Bai可能通過抗凋亡作用，對心臟進(jìn)行保護(hù)，見圖4。

注：A:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測的蛋白表達(dá);B:根據(jù)Western blot條帶繪制的Bax蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;C:根據(jù)Western blot條帶繪制的Bcl-2蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;D:根據(jù)Western blot條帶繪制的caspase-3蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;E:根據(jù)Western blot條帶繪制的caspase-9蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖；與Con組比較，*:P<0.05，與ISO組比較，**:P<0.05。

2.4 Bai對心肌NF-κB及炎癥因子的影響Western blotting結(jié)果顯示，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組小鼠心肌中的NF-κB(p65)、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)上升(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+Bai組NF-κB(p65)、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，結(jié)果顯示Bai用藥后可抑制ISO導(dǎo)致的心肌肥厚小鼠心肌組織中的炎癥蛋白的表達(dá)，減輕心臟損傷，見圖5。

注：A:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測的蛋白表達(dá);B:根據(jù)Western blot條帶繪制的IL-6蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;C:根據(jù)Western blot條帶繪制的TNF-α蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;D:根據(jù)Western blot條帶繪制的NF-κB蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;與Con組比較，*:P<0.05，與ISO組比較，**:P<0.05。

2.5 Bai對ISO所致小鼠心臟損傷抗氧化作用及PI3K/AKT1通路的影響根據(jù)GSH-Px試劑盒結(jié)果顯示，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組活性下降；與ISO組比較，ISO+Bai組活性上升(P<0.05)，見圖6。Western blotting分析，與Con組比較，ISO組、ISO+Bai組SOD1、CAT、P-AKT1、PI3K蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+Bai組SOD1、CAT、P-AKT1、PI3K蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。ISO能抑制AKT1向磷酸化轉(zhuǎn)變，表明PI3K的激活能夠使AKT1磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而保護(hù)心肌組織，見圖7。

圖6 各組小鼠心臟組織中GSH-Px活性水平的變化

注：A:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測的蛋白表達(dá);B:根據(jù)Western blot條帶繪制的CAT蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;C:根據(jù)Western blot條帶繪制的SOD1蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;D:根據(jù)Western blot條帶繪制的P-AKT1蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖;E:根據(jù)Western blot條帶繪制的PI3K蛋白相對表達(dá)量的柱狀圖；與Con組比較，*:P<0.05，與ISO組比較，**:P<0.05。

3 討論

心肌重構(gòu)是由一系列復(fù)雜的分子機(jī)制導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)功能和表型的變化，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的多基因疾病[11]。在長期的病理應(yīng)激下，心肌肥厚伴有間質(zhì)纖維化、收縮功能障礙、基因表達(dá)模式改變、能量代謝改變和異常電生理特性，最終導(dǎo)致明顯的失代償性心力衰竭[12]。Bai具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、抗癌等作用，通過對細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬等生物學(xué)途徑發(fā)揮作用。在缺氧、缺血、藥物處理時(shí)，會引起氧自由基上升，導(dǎo)致心肌損傷，包括心肌壞死、心肌肥大等[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]黃芩的黃酮類化合物具有清除體內(nèi)過量的氧自由基，防止體內(nèi)產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)的作用。Bai可以控制小鼠模型中的鐵超載，減輕鐵超載引起的小鼠心臟損傷。Liu等[15]研究表明，Bai可以通過抑制血管平滑肌內(nèi)皮細(xì)胞增殖和有絲分裂起到保護(hù)心血管的作用，Bai的這些保護(hù)心血管的作用預(yù)示著其具有成為治療冠心病和高血壓等心血管疾病的潛在藥物。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過建立體內(nèi)ISO小鼠心肌模型中發(fā)現(xiàn)，Bai處理后，與ISO組比較，ISO+Bai組血清中CK-MB、LDH活性降低、MDA含量降低，心肌組織中GSH-Px活性水平升高(P<0.05)；心臟超聲波顯示，與ISO組比較，ISO+Bai組收縮期與舒張期LVPWd與IVSd有所下降，說明Bai可抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。MDA是心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的穩(wěn)定產(chǎn)物，具有一定的生物毒性，其含量的多少直接反映心肌組織氧化損傷的程度[16]。在正常機(jī)體中，CAT、SOD1和GSH-Px在細(xì)胞內(nèi)建立了強(qiáng)有力的抗氧化防御系統(tǒng)，其蛋白水平的多少反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)中ISO+Bai組心肌組織中MDA含量降低，CAT、SOD1、GSH-Px水平升高(P<0.05)，說明Bai可通過提高CAT、SOD1和GSH-Px的含量，以清除過量的氧化自由基，從而增強(qiáng)Bai的抗氧化作用，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Bai可預(yù)防心肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。

ROS過量產(chǎn)生會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。研究表明[17]心肌細(xì)胞凋亡或壞死是異丙腎上腺素導(dǎo)致心功能損傷的重要機(jī)制。ISO誘導(dǎo)的ROS激活促凋亡的Bcl-2家族成員Bax，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細(xì)胞色素c、caspase-3的釋放激活，最后凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡的Bcl-2家族成員蛋白，阻止線粒體通透性的發(fā)生，最終在抑制凋亡中起著關(guān)鍵的保護(hù)作用。NF-κB被證明可以促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡，這取決于細(xì)胞類型和氧化刺激的性質(zhì)[18]。在氧化劑或其他細(xì)胞外刺激下，IκB激酶的激活導(dǎo)致IκB磷酸化，IκB磷酸化導(dǎo)致其蛋白酶體降解，NF-κB復(fù)合物在核內(nèi)的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB通過激活促凋亡蛋白p53促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，通過基因缺失或化學(xué)抑制降低p53活性可減輕有毒制劑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心功能障礙[19]。在本研究中，Western blotting結(jié)果表明，ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和壞死，Bai處理減弱了ISO誘導(dǎo)的致Bcl-2/Bax比值的增加(P<0.05)，介導(dǎo)的下游基因caspase-3、caspase-9，NF-κB的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。因此，Bai可以改善ISO對小鼠ROS造成的損傷且具有一定的保護(hù)作用。

PI3K/Akt信號通路是心肌細(xì)胞內(nèi)存在的自我保護(hù)機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要活動，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子可以抑制促凋亡基因(Bax、caspase-3、caspase-9)表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡基因(Bcl-2)表達(dá)，從而提高心肌細(xì)胞的存活率。在本研究中，Western blotting結(jié)果表明，ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，Bai能抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)磷酸化Akt蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)P-AKT的水平，研究結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PI3K/Akt的活化有關(guān)，Bai具有較強(qiáng)的抗氧化和抗凋亡機(jī)制，起到保護(hù)心臟的作用。

綜上所述，Bai治療可改善ISO所致的小鼠心肌重構(gòu)。Bai對心肌非酶抗氧化劑和酶促抗氧化劑的恢復(fù)，以及上調(diào)ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的抗氧化酶和激活PI3K/AKT調(diào)控的凋亡通路，這些與Bai的心臟保護(hù)作用相關(guān)，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。