低溫脅迫對馬鈴薯幼苗抗寒相關(guān)生理指標的影響*

段景秀， 侯祿曉， 暴會會，汪雪梅， 鄭昊吉， 祝光濤， 郭磊

(云南師范大學 生命科學學院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬于茄科茄屬一年生草本植物，是世界第四大糧食作物，其營養(yǎng)價值高，適應(yīng)力強且產(chǎn)量大.馬鈴薯性喜冷涼不耐寒，低溫脅迫是影響馬鈴薯生長發(fā)育的重要因素，嚴重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展[1].在2016年鄱陽湖地區(qū)的霜凍天氣中，馬鈴薯幼苗凍死率達75%～95%，減產(chǎn)幅度為40%左右，造成嚴重損失[2]；2018年，由于受到寒潮影響，廣西玉林的馬鈴薯未能達到商品薯標準，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3].

野生種馬鈴薯要比普通栽培種馬鈴薯更耐寒，能夠進行冷馴化[4].馬鈴薯普通栽培種出苗后在小于7 ℃ 的低溫下植株停止生長，-0.8 ℃ 時遭受冷害，-1.5 ℃ 時遭受凍害，-3 ℃ 時死亡；野生種S.acaule一般在 -4 ℃ 處理12 h后才出現(xiàn)嚴重凍傷或死亡[5].大田生產(chǎn)馬鈴薯主要是利用秸稈、培土、熏煙和地膜覆蓋等措施來提高地溫預(yù)防凍害，這些措施雖然有一定的效果，但在面積大或低溫災(zāi)害頻繁的情況下，這些方法具有一定的局限性，難以使用，即使在小面積范圍內(nèi)實施這些措施，也會因投入大量的人力和物力而增加成本，嚴重影響馬鈴薯種植的經(jīng)濟效益和產(chǎn)業(yè)發(fā)展.鑒于馬鈴薯霜凍抗性等重要性狀一直難以得到改良，甚至成為世界性的難題[6]，進一步研究馬鈴薯的抗寒性及其作用機制尤為重要，而探究冷害和凍害脅迫下馬鈴薯生理指標的變化就是其中的一個研究內(nèi)容，對選育馬鈴薯抗寒種質(zhì)具有重要的意義.

Solanumcommersonii(CM)是已報道的馬鈴薯資源中較抗寒的野生種[7]，選取云南師范大學馬鈴薯科學研究院提供的5份抗寒野生種CM的材料和1份不抗寒栽培種DM進行抗寒鑒定以及4 ℃和 -4 ℃ 1 h、3 h、6 h和12 h的冷害和凍害處理，分析其中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及過氧化物酶(POD)活性等抗寒相關(guān)生理指標的變化.以期為解析馬鈴薯抗寒性提供研究基礎(chǔ)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上選育馬鈴薯抗寒品種提供指導.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯種質(zhì)為云南師范大學馬鈴薯科學研究院前期研究篩選的抗寒野生種CM中的559、801、538、674和803，以及不抗寒栽培種Solanumphureja(DM).

1.2 試驗設(shè)計

選取生長狀態(tài)良好，長勢整齊的苗期馬鈴薯材料559、801、538、674、803和DM進行低溫脅迫處理.試驗在光照培養(yǎng)箱與冷室中進行.試驗設(shè)置6組處理：25 ℃(對照組)，4 ℃，-4 ℃ 1 h、3 h、6 h和12 h(植株-4 ℃處理前進行為期6 d的4 ℃低溫馴化)，每組三株.試驗設(shè)置三次重復.低溫脅迫處理后，取第3和第4片功能葉混合后按需稱重，用錫紙包裹放進液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中備用[8].另取每種材料的馬鈴薯各9株在相同的處理條件下進行抗寒表型鑒定.

1.3 生理指標測定

采用考馬斯亮藍法[9]測定可溶性蛋白含量；采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒測定可溶性糖含量；參照李玲《植物生理學模塊實驗指導》進行游離脯氨酸含量測定；采用愈創(chuàng)木酚法[10]測定POD活性；采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒測定SOD活性.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，采用GraphPad Prism 9 制作柱狀圖和折線圖，并利用SPSS軟件進行差異顯著性分析.

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯抗寒性鑒定

不抗寒栽培種DM在-4 ℃處理12 h后，葉片萎蔫，莖稈癱軟[11]，全株死亡(圖1B)；野生種CM(以674為例)在-4 ℃處理12 h后，葉片稍卷，僅部分葉片有損傷(圖1D)，但還能恢復生長.CM中的其余4份材料與674表現(xiàn)一致.

25 ℃ -4 ℃ 12 h

2.2 低溫脅迫對馬鈴薯生理指標的影響

2.2.1 低溫脅迫對SOD活性的影響

SOD是一種自由基清除劑，可有效提高植物的抗寒能力.對低溫脅迫下的6份馬鈴薯材料SOD活性進行檢測，結(jié)果顯示，抗寒種CM中的5份材料在低溫脅迫下SOD活性呈現(xiàn)先降低后升高又降低的趨勢，在-4 ℃處理6 h下達到峰值且顯著高于其他時間點(圖2A-E)，其中559、801、538和674在4 ℃馴化后，SOD活性沒有顯著增強(圖2A-D).而803在低溫馴化后，SOD活性顯著增加(圖2E)，推測低溫馴化可能對803抗寒能力的提升有一定作用.不抗寒栽培種DM整體的SOD活性都低于其他材料，低溫馴化后SOD活性也沒有被誘導增加.說明SOD活性較高是CM具有較強抗寒能力的原因之一.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2.2 低溫脅迫對POD活性的影響

由圖3可知，低溫馴化后，抗寒種CM中的801、538和803以及不抗寒栽培種DM的POD活性都有不同程度的增加，559和674沒有顯著變化；在-4 ℃處理時，各材料POD活性總體呈上升趨勢，其中803的POD活性增加最為顯著，推測POD活性對803的低溫抗凍性發(fā)揮了重要作用.

圖3 低溫脅迫下馬鈴薯POD活性

2.2.3 低溫脅迫對可溶性糖含量的影響

可溶性糖作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗寒能力調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用.從圖4可看出，抗寒種CM559、801和538在低溫脅迫下，可溶性糖含量顯著增加；而674、803和 DM無顯著變化，但674和803的可溶性糖含量明顯高于栽培種DM，推測高濃度可溶性糖含量能夠提高馬鈴薯抗寒能力，也是抗寒材料的重要生理特征之一.

圖4 低溫脅迫下馬鈴薯可溶性糖含量

2.2.4 低溫脅迫對可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白有助于細胞維持滲透壓平衡，增強抗寒性.抗寒材料559在4 ℃馴化后蛋白含量顯著上升，-4 ℃脅迫后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(圖5A)，而其余材料在4 ℃馴化后可溶性蛋白含量顯著下降或無變化(圖5B-F).CM中除559外的材料大多在-4 ℃處理后的3 h、6 h或12 h時可溶性蛋白含量顯著升高，特別是803，含量增幅最大(圖5A-E).而不抗寒栽培種DM在低溫脅迫后，可溶性蛋白含量顯著降低(圖5F).綜上，抗寒種CM在低溫脅迫下可溶性蛋白含量均增加，而不抗寒品種DM在低溫脅迫下可溶性蛋白含量下降.

圖5 低溫脅迫下馬鈴薯可溶性蛋白含量

2.2.5 低溫脅迫對脯氨酸含量的影響

作為最重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，植物組織中脯氨酸含量的增加可以提高植物的抗寒性.由圖6可知，與室溫對照組相比，低溫馴化后各材料的游離脯氨酸均有一定程度的增加；總體上，游離脯氨酸含量呈現(xiàn)一個先增加后降低的趨勢，其中抗寒種CM559和801在-4 ℃處理1 h游離脯氨酸增加最為顯著，且低溫脅迫下，CM脯氨酸含量顯著高于DM.

圖6 低溫脅迫下馬鈴薯脯氨酸含量

2.3 馬鈴薯抗寒種質(zhì)綜合評價

在所有材料中只有803在4 ℃低溫馴化后，SOD活性顯著增加，其他材料在冷馴化后均無顯著變化.在低溫脅迫條件下，各材料SOD活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，并且在-4 ℃處理6 h時達到峰值.其中，抗寒種CM 中801在處理前后SOD活性都高于其他材料，推測高SOD活性是其具有較強抗寒能力的原因之一(圖7A).

在室溫下，DM的POD活性相當于抗寒材料中的平均水平，并在低溫誘導后呈現(xiàn)出與抗寒材料相似的變化趨勢，只有在-4 ℃下12 h時活性下降，推測POD活性高低不是CM比DM更耐寒的原因之一.在低溫脅迫下，抗寒種CM中803的POD活性最高(圖7B).

在室溫下674、803和559的可溶性糖含量較高，超過10 mg/g，在低溫脅迫后變化不顯著，而801、538和DM在未處理之前的可溶性糖含量較低，低于10 mg/g，其中抗寒材料801和538在低溫脅迫后可溶性糖含量顯著增加，而不抗寒材料DM可溶性糖含量在-4 ℃處理6 h時含量顯著下降.以上結(jié)果說明CM中既有通過自身的高可溶性糖含量來提高抗寒性的材料，又有低溫誘導可溶性糖含量增加來提高抗寒性的材料，且可溶性糖含量也是CM抗寒性強的原因之一(圖7C).

低溫脅迫后，除了559和538外所有材料的可溶性蛋白含量均在-4 ℃處理6 h時達到峰值，其中以抗寒種CM803增加最為顯著.總體上，低溫脅迫下CM與DM的可溶性蛋白含量相比無顯著優(yōu)勢，推測可溶性蛋白對抗寒種CM的抗寒能力影響較小(如圖7D).

低溫脅迫下，6份馬鈴薯材料脯氨酸含量都呈現(xiàn)一個先增加后降低的趨勢.且每種材料脯氨酸含量達到峰值的時間不同，如559在-4 ℃處理1 h時脯氨酸含量達到峰值，超過3 000 μg/g，801在-4 ℃處理3 h達到峰值，說明不同材料的脯氨酸含量對低溫脅迫響應(yīng)的模式有所不同.并且抗寒種CM中脯氨酸含量顯著高于DM.推測高脯氨酸含量是影響抗寒種CM抗寒能力的重要因素之一(圖7E).

圖7 低溫脅迫下馬鈴薯各生理指標變化

3 結(jié)語與討論

低溫脅迫會對大多數(shù)作物產(chǎn)生傷害，影響產(chǎn)量，甚至造成死亡.然而，作物也會產(chǎn)生一系列反應(yīng)抵御低溫脅迫，在這個復雜的調(diào)控過程中，各個生理物質(zhì)之間相互作用，相互影響[12].

植物面臨低溫脅迫時可通過產(chǎn)生大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持滲透壓平衡，使其維持正常的形態(tài)和生理功能.研究結(jié)果顯示，在4 ℃低溫脅迫時，CM559可溶性蛋白含量升高最為明顯.在-4 ℃低溫脅迫時，隨著脅迫時間延長，大部分材料中可溶性蛋白含量整體呈先上升后下降趨勢，且在6 h或12 h時達到峰值，說明在該時間點可溶性蛋白響應(yīng)最為強烈.5份CM材料的可溶性糖含量隨低溫脅迫時間的延長均有不同程度的增加，脯氨酸含量呈先增加后減少的趨勢，說明5份馬鈴薯材料均會通過產(chǎn)生和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖和脯氨酸來抵御寒冷.4 ℃馴化時，801、538和DM中可溶性糖含量增加，而6份材料的脯氨酸含量也均增加，說明低溫馴化也能夠提高馬鈴薯的抗寒性.材料559、674和803室溫下就含有較高的可溶性糖含量，達到10 mg/g以上，材料801、674和803室溫下的脯氨酸含量也較高，說明CM中有通過自身的高可溶性糖含量和高脯氨酸含量來提高抗寒能力的材料.不同材料馬鈴薯對低溫脅迫的響應(yīng)有所不同，所以脯氨酸和可溶性糖積累量的峰值出現(xiàn)的時間不同[8].低溫脅迫后，馬鈴薯植株內(nèi)的脯氨酸含量和可溶性糖含量變化趨勢與白淼等[13]研究結(jié)果一致.

植物細胞內(nèi)具有抗氧化酶保護系統(tǒng)，其中SOD和POD等能有效清除細胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)，起到保護細胞的作用.實驗表明，在4 ℃低溫脅迫時，538中POD活性上升最為明顯.在-4 ℃低溫脅迫時，隨著脅迫時間的不斷延長，559、801、538和803中POD活性均呈上升趨勢，表明細胞中POD活性不斷增強以清除有毒物質(zhì)活性氧，與孫佳平[14]等對甜菜以及郭揚[15]對玉米的研究結(jié)果一致.但674和DM中POD活性呈先上升后下降的趨勢.低溫馴化后803的SOD活性有明顯的升高，推測低溫馴化對提高803材料的抗寒性有一定的作用.低溫脅迫6 h時，6份材料的SOD活性達到峰值，而且DM的SOD活性低于CM中的5份材料，說明SOD高活性是CM具有抗寒性的原因之一.

綜上，不同材料馬鈴薯幼苗的生理物質(zhì)對低溫脅迫的響應(yīng)模式不同，但多數(shù)材料在低溫處理6 h 和12 h 時響應(yīng)最強烈.CM既可通過自身的高可溶性糖含量和高脯氨酸含量來提高抗寒能力，又可通過誘導累積可溶性糖和脯氨酸及提高SOD活性來抵抗低溫脅迫，從而提高其抗寒能力.