13種新型1,8-萘酰亞胺衍生物對(duì)晚疫病菌的室內(nèi)毒力檢測(cè)*

姜云婷， 王波， 王薈潔， 付艷鴻， 王洪洋， 吳相華

(1.云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

馬鈴薯晚疫病是由卵菌綱致病疫霉菌(Phytophorainfestans)引起的一種具有毀滅性的病害.全球每年因晚疫病造成的損失多達(dá)幾十億美元，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1].目前，在世界范圍內(nèi)馬鈴薯晚疫病的防治主要是使用化學(xué)藥劑.但由于化學(xué)藥劑選擇不夠科學(xué)，長(zhǎng)期使用一種或同類藥劑，導(dǎo)致晚疫病菌產(chǎn)生了一定抗藥性[2].因此，篩選與現(xiàn)有馬鈴薯晚疫病防治藥劑無交互抗性的新型殺菌劑，合理交替使用具有不同靶標(biāo)位點(diǎn)的高效、低毒殺菌劑，對(duì)防控馬鈴薯晚疫病具有重要意義.

1,8-萘酰亞胺衍生物具有光化學(xué)穩(wěn)定和強(qiáng)熒光量子效率等特點(diǎn)，在光電敏感材料、液晶材料、太陽(yáng)能收集材料、激光染料、光誘導(dǎo)DNA切斷劑、DNA嵌入劑以及化學(xué)熒光探針等高技術(shù)領(lǐng)域均有應(yīng)用[3-5].近幾年，研究表明1,8-萘酰亞胺類衍生物存在抗腫瘤和抗菌等特性，具有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[6-7].2015年，田廣軒等[8]利用活性結(jié)構(gòu)拼接和生物電子等排原理，將1,8-萘酰亞胺與二硫代氨基甲酸酯拼接合成新型1,8-萘酰亞胺類衍生物，通過篩選部分衍生物表現(xiàn)出高效抗菌和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特性.為了探究此類物質(zhì)是否對(duì)晚疫病菌有抑制作用，研究利用離體葉片接種鑒定法，對(duì)1,8-萘酰亞胺類衍生物進(jìn)行晚疫病菌毒力測(cè)定.以期為馬鈴薯晚疫病的化學(xué)防控提供新型藥劑，同時(shí)為綜合防治晚疫病理論研究提供一定的數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

致病疫霉菌菌株88069，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯課題組饋贈(zèng).

1.1.2 供試培養(yǎng)基

黑麥固體培養(yǎng)基(1 L為例)：取60 g黑麥加300 mL水，50 ℃浸泡過夜后收集浸出液體，依次加入100 mL V8蔬菜汁、20 g蔗糖、0.2 g CaCO3和15 g瓊脂，調(diào)整pH至6.8，121 ℃滅菌20 min.用于馬鈴薯晚疫病菌的培養(yǎng)、常規(guī)保存以及室內(nèi)毒力測(cè)定.

1.1.3 供試馬鈴薯品種

離體葉片接種材料為感病馬鈴薯品種Désirée，由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院保存.

1.1.4 供試藥劑

陽(yáng)性對(duì)照(+ck)為克露(72%霜脲·錳鋅)：含8%霜脲氰和64%代森錳鋅，購(gòu)自上海杜邦農(nóng)化有限公司.陰性對(duì)照(-ck)為0.1%的二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.13種供試1,8-萘酰亞胺類衍生物由云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供，詳情如表1.

表1 13種供試1,8-萘酰亞胺類衍生物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力鑒定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定13種1,8-萘酰亞胺類衍生物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)毒力.首先進(jìn)行初篩，統(tǒng)一將13種衍生物按40 μg/mL濃度配置黑麥固體培養(yǎng)基，每種衍生物倒6個(gè)培養(yǎng)皿.用滅菌后的打孔器(直徑5 mm)在預(yù)培養(yǎng)8 d的晚疫病菌落邊緣均勻取菌餅，正面朝下接種到不同處理的黑麥固體培養(yǎng)基上.20 ℃恒溫培養(yǎng)8 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取其平均數(shù)作為各處理組的菌落直徑.計(jì)算菌落的凈生長(zhǎng)量和抑制率.根據(jù)供試藥劑濃度與菌絲生長(zhǎng)抑制率的關(guān)系，計(jì)算供試藥劑濃度對(duì)數(shù)與抑制率概率值間的毒力回歸方程(y=bx+a)，通過其回歸方程計(jì)算殺菌劑的抑制中濃度值(EC50)[9].菌落的凈生長(zhǎng)量=菌落測(cè)量直徑-接種菌餅直徑(5 mm).生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%.

1.2.2 接種鑒定

參照王洪洋等[10]的研究方法.將晚疫病菌的孢子囊濃度調(diào)至約5×104個(gè)/mL，4 ℃下放置 2～3 h 后，用于接種.采用離體葉片接種方式接種馬鈴薯栽培種Désirée.選取自頂葉以下第 3～5復(fù)葉上的單葉用于接種鑒定，每個(gè)單葉兩邊各接種 10 μL 孢子懸浮液，塑料薄膜封口接種盤，保持空氣濕度 95%左右，溫度 20 ℃左右.接種后 5 d，分別在自然光和紫外光下拍照.

1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 16.0版數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行處理分析.利用Duncan's新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 13種供試1,8-萘酰亞胺類衍生物對(duì)晚疫病菌抑菌效果

從圖1可以看出，在40 μg/mL濃度條件下，3a、3b、3c和3d這4種1,8-萘酰亞胺類衍生物對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生了不同程度抑制，其余1,8-萘酰亞胺類衍生物均不能有效抑制晚疫病菌菌絲生長(zhǎng).

2.2 4種衍生物對(duì)晚疫病菌的抑制中濃度

從圖2和表2可看出，不同濃度下3a、3b、3c和3d 4種衍生物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的毒力有明顯差異，特別是3c，在40 μg/mL濃度條件下的抑菌效果比陽(yáng)性對(duì)照克露好.從表3可以看出3c的EC50為16.55 μg/mL，毒力最強(qiáng)且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照；毒力強(qiáng)度隨后依次是3b、3a和3d，其EC50分別是26.71、27.06 μg/mL 和29.25 μg/mL.

表2 不同濃度下4種衍生物對(duì)晚疫病菌的抑制作用

表3 4種衍生物的毒力比較

2.3 衍生物3c對(duì)晚疫病菌的防控效果

為了鑒定衍生物3c能否有效防控馬鈴薯晚疫病，采用20 μg/mL濃度的3c噴施處理盆栽馬鈴薯品種Désirée葉片，24 h后進(jìn)行離體葉片接種晚疫病菌菌株88069，接種5 d后觀察發(fā)病情況.如圖3所示，陰性對(duì)照(噴施含0.1% DMSO)葉片形成明顯晚疫病斑(黃色圈)，但是陽(yáng)性對(duì)照(20 μg/mL克露)和噴施衍生物3c的葉片沒有明顯病斑產(chǎn)生.說明衍生物3c可以對(duì)葉片晚疫病發(fā)生起到較好的防控效果.

3 討論

目前，生產(chǎn)上對(duì)馬鈴薯晚疫病的防控仍以化學(xué)防控為主要手段.然而現(xiàn)有的化學(xué)防治藥劑大多具有高度選擇性和作用靶點(diǎn)單一等問題，快速變異的晚疫病菌易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性.另外，不合理的農(nóng)藥使用，如長(zhǎng)期連續(xù)使用一種或者一類農(nóng)藥，不僅會(huì)造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)或藥害的出現(xiàn)，還對(duì)環(huán)境造成了污染[11-13].因此，研發(fā)多位點(diǎn)作用的綠色安全、毒性低且不易產(chǎn)生抗藥性的藥劑是未來防治馬鈴薯晚疫病急需解決的關(guān)鍵問題.

研究對(duì)人工合成的13種1,8-萘酰亞胺衍生物殺菌劑的馬鈴薯晚疫病菌室內(nèi)毒力進(jìn)行測(cè)定，篩選出1,8-萘酰亞胺4-位嗎啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c具有良好的抑菌效果，其EC50值比商用化學(xué)藥劑克露還要小，說明其對(duì)晚疫病菌的毒力很強(qiáng).在馬鈴薯晚疫病菌室內(nèi)毒力試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過離體葉片接種鑒定，發(fā)現(xiàn)衍生物3c可以有效抑制晚疫病菌在葉片上的生長(zhǎng)，這與室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果一致.

馬鈴薯在生長(zhǎng)過程中，會(huì)遭遇各種各樣病害.已有研究表明1,8-萘酰亞胺4-位嗎啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯的抗菌效果，顯示出該衍生物具有深入研究的價(jià)值和潛在的應(yīng)用前景[8].建議下一步驗(yàn)證衍生物3c是否對(duì)馬鈴薯早疫病、青枯病和黑痣病等病原菌具有抗菌活性，擴(kuò)大其作用范圍.同時(shí)，合理規(guī)劃衍生物3c與其他晚疫病防控藥劑交替使用，以降低產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn).

綜上所述，1,8-萘酰亞胺4-位嗎啉取代三氮唑二硫代氨基甲酸酯衍生物3c對(duì)馬鈴薯晚疫病菌有較強(qiáng)的毒力，能有效防控晚疫病菌侵染.