陜西佛坪國家級自然保護區(qū)大熊貓主食竹葉提取物成分分析*

曹淯， 王樂， 代藝， 何歡柳， 袁施彬

(西華師范大學 生命科學學院，教育部西南野生動植物資源保護重點實驗室，四川 南充 637009)

植物次生代謝產(chǎn)物(plant secondary metabolites，PSMs)是由植物初生代謝產(chǎn)物通過次生代謝過程產(chǎn)生，對食草性動物具有廣泛生理效應的一類物質(zhì)[1].雖然PSMs的組成和含量在很大程度上由遺傳決定，但一些非生物的環(huán)境因素，如海拔、溫度、光照、濕度、土壤鹽分和養(yǎng)分等，會對植物體內(nèi)PSMs的代謝造成較強的影響[2-4].海拔是對陸生植物代謝影響較大的非生物因素之一，因為隨著海拔的變化，其他非生物因素幾乎都會發(fā)生相應改變[5].

竹子是一種禾本科植物，被廣泛用于治療感冒、胃痛、腹瀉、嘔吐、胸腔感染和解毒等.研究發(fā)現(xiàn)，竹葉具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗微生物功能，這些功能主要與竹葉含有的黃酮苷、酚酸、香豆素和蒽醌類等PSMs有關(guān)[6-8]，且這些PSMs的組成和含量主要受竹子種類、生長環(huán)境條件、竹齡和竹器官部位的影響[9-12].

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)為我國特有珍稀動物，其食性高度特化為以竹為主(99%以上)[13].野外大熊貓主要分布于我國秦嶺、邛崍、岷山、大相嶺、小相嶺和涼山山系，不同山系大熊貓的分布海拔、主食竹種及喜食竹部位存在極大差異，這也就意味著不同山系的大熊貓在攝入滿足自身生長、發(fā)育和繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)的同時，會不同程度的攝入組成和含量不同的PSMs[14-18].

陜西佛坪國家級自然保護區(qū)(Foping National Natural Reserve,FNNR)是我國大熊貓密度最高的保護區(qū)，巴山木竹(Bashaniafargesii)是該地分布面積最廣的竹種，常分布于海拔1 900 m以下，是該地大熊貓主要的食物資源[15].研究發(fā)現(xiàn)，從9月到次年4月，該保護區(qū)大熊貓幾乎都在巴山木竹林中(冬居地)活動，巴山木竹葉在其食物組成中的比例高達98.3%[14].

本課題組對5只佩戴了GPS項圈的大熊貓在冬居地的活動位點統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，雖然每只大熊貓都有各自特定的活動位點，但是80%的活動位點都集中在海拔1 500 m以上.大熊貓在此階段所需要的維持基礎代謝、越冬、繁殖及抵抗疾病所需的物質(zhì)均來自該區(qū)域的巴山木竹.由此推測，在越冬季節(jié)，分布于大熊貓活動區(qū)域和非活動區(qū)域的不同竹齡的巴山木竹葉中PSMs的成分和含量可能存在差異，優(yōu)勢化合物也應不同.研究為更精準地確定大熊貓活動區(qū)域和非活動區(qū)域不同竹齡的大熊貓主食竹中PSMs的差異、進一步探討竹葉組分對大熊貓覓食策略和棲息地選擇的影響以及大熊貓的保護提供理論基礎.

1 材料和方法

1.1 樣品采集地概況

佛坪國家級自然保護區(qū)為全國建立較早的大熊貓保護區(qū)之一，位于東經(jīng)107°41′～107°56′，北緯32°32′～33°43′，總面積293 km2.保護區(qū)海拔980～2 904 m，年平均氣溫11.5 ℃，平均年降水量924 mm，從下到上分別為山地中溫帶和山地寒溫帶.森林覆蓋率90%以上，大部分為天然次生林，植被垂直帶譜分布明顯.據(jù)全國第四次大熊貓調(diào)查顯示，佛坪保護區(qū)的大熊貓種群密度在全國所有大熊貓保護區(qū)中最高.保護區(qū)內(nèi)的竹子分布以巴山木竹與秦嶺箭竹(Fargesiaqinlingensis)為主，零星間雜有金竹(Phyllostachyssulphurea)和龍頭竹(Bambusavulgaris)等.巴山木竹主要分布在海拔1 900 m以下區(qū)域，為大熊貓冬、春季的主食竹類；秦嶺箭竹分布在海拔1 900 m以上的亞高山，為大熊貓夏季的主食竹類[14].

1.2 樣品采集和預處理

2015年10月從海拔1 200 m開始，海拔每升高100 m設置一個采樣點，共8個采樣點，采集不同竹齡(1年生、2年生和多年生)的巴山木竹葉.在1 600～1 900 m的海拔梯度范圍內(nèi)，通過GPS發(fā)現(xiàn)有覓食斑塊和活動痕跡的區(qū)域被確定為覓食區(qū)域/活動區(qū)域(Foraging site，F(xiàn)S)；在1 200～1 500 m的海拔梯度范圍內(nèi)，無大熊貓活動痕跡的區(qū)域被確定為對照區(qū)域(Control site，CS).每個采樣點設置3個10 m×10 m的樣方，準確區(qū)分1年生、2年生和多年生竹葉，每種竹葉采集50 g(新鮮樣品).所有樣品采集后立即置于塑料袋中封存送實驗室檢測.

竹葉樣品經(jīng)55 ℃烘箱干燥、粉碎和過篩后，精密稱取竹葉粉末(0.1±0.005)mg于1.5 mL EP管中，加入1 000 μL甲醇-乙腈-水(體積比4∶4∶2)混合溶液，渦旋60 s，于冰水浴下超聲60 min，再在4 ℃下13 000 r·min-1離心15 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾得到竹葉提取物(bamboo leaf extract，BLE)供上機分析.

1.3 儀器、試劑及操作條件

EkspertUlraLC 110超高效液相色譜儀(美國AB Sciex公司)；AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(美國Waters公司)；乙腈、甲醇和超純水(德國Merck公司)；甲酸(上海安譜實驗科技有限公司).

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；采用正負離子模式檢測分析，流動相正離子模式為含0.1%(體積比)甲酸的超純水(A)和乙腈(B)，負離子模式為含10 mmol·L-1甲酸銨的超純水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫條件見表1.柱溫35 ℃，進樣量10 μL.

表1 流動相梯度洗脫條件

質(zhì)譜儀在軟件Analyst TF 1.7(AB Sciex)控制下，基于IDA功能進行一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，一級掃范圍50～1 000 m/z，二級掃范圍25～1 000 m/z，一級轟擊能量10 eV，二級轟擊能量30 eV.ESI離子源參數(shù)設置如下：霧化氣壓(GS1) 55 Pa，輔助氣壓55 Pa，氣簾氣壓40 Pa，溫度：550 ℃(正離子模式)，450 ℃(負離子模式)；噴霧電壓：5 500 V(正離子模式)，4 500 V(負離子模式).

1.4 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MSDIAL軟件進行峰尋找、峰提取和峰識別等處理，同時基于一級和二級圖譜搜索MassBank、MONA、Respect和GNPS數(shù)據(jù)庫，再結(jié)合HMDB、Pubchem、ChEBI和KEGG數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)鑒定和歸類.最后運用Excel 2010軟件和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行誤差方差等同性的levene檢驗和方差分析.

2 結(jié)果

2.1 竹葉提取物成分種類劃分

通過檢測得到的巴山木竹葉中各化學成分的準分子離子峰精確質(zhì)量和特征碎片離子信息，結(jié)合各數(shù)據(jù)庫的對比，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)的不同，鑒定出陜西佛坪國家級自然保護區(qū)大熊貓活動區(qū)域1年生(FS-1)、2年生(FS-2)和多年生(FS-3)與對照區(qū)域1年生(CS-1)、2年生(CS-2)和多年生(CS-3)竹葉提取物的化合物數(shù)分別是1 235、1 234、1 166和1 074、1 047、1 022，活動區(qū)域不同竹齡竹葉提取物中的化合物數(shù)均高于對照區(qū)域；此外，隨著竹齡的增加，活動區(qū)域和對照區(qū)域BLE中化合物數(shù)均有減少的趨勢.

這些化合物主要分為12超類(表2)，分別是苯丙素及聚酮類化合物(phenylpropanoids and polyketides，PPs)、脂肪及類脂分子(lipids and lipid-like molecules，LLMs)、有機雜環(huán)類化合物(organoheterocyclic compounds，OHCs)、苯環(huán)型化合物(benzenoids，BZs)、有機酸及其衍生物(organic acids and derivatives，OADs)、有機氧化合物(organic oxygen compounds，OOCs)、生物堿及其衍生物(alkaloids and derivatives，ADs)、核苷酸及類似物(nucleosides，nucleotidesand analogues,NNAs)、木脂素類及相關(guān)化合物(lignans,neolignans and related compounds，LNRCs)、有機氮化合物(organic nitrogen compounds，ONCs)、有機硫化合物(organosulfur compounds，OSCs)和碳氫衍生物(hydrocarbon derivatives，HDs).活動區(qū)域和對照區(qū)域內(nèi)不同竹齡巴山木竹葉中每一超類化合物的含量具體見表2.

表2 佛坪國家級自然保護區(qū)大熊貓活動區(qū)域和對照區(qū)域不同竹齡BLE中化合物的分類、分類數(shù)及各分類數(shù)占比

對BLE中12超類物質(zhì)所含的化合物分類數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，前7超類即PPs、LLMs、OHCs、BZs、OADs、OOCs和ADs占其化合物總數(shù)的95%左右，平均分別達到化合物總數(shù)的23.1%、22.6%、17.8%、11.5%、9.55%、8.37%和1.98%；除了活動區(qū)域中LLMs的化合物數(shù)量少于對照區(qū)域外，其余6超類均是活動區(qū)域化合物數(shù)量大于對照區(qū)域.

2.2 來源不同的BLE中共有成分及相對含量分析

分別對來自不同區(qū)域同一竹齡的BLE中的共有成分進行分析發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域1年生、2年生和多年生BLE中共有化合物分別為596、471種和525種；對來自同一區(qū)域不同竹齡BLE中共有化合物進行分析發(fā)現(xiàn)，活動區(qū)域的不同竹齡BLE中共有化合物為512種，對照區(qū)域的不同竹齡BLE中共有化合物為323種.(圖1)

(a)來源于不同區(qū)域的相同竹齡BLE中共有化合物數(shù)量 (b)來源于相同區(qū)域不同竹齡BLE中共有化合物數(shù)量

2.2.1 來源于不同區(qū)域的相同竹齡BLE中共有優(yōu)勢化合物超類及相對含量

將竹葉干物質(zhì)中相對含量>0.10%的化合物判斷為共有優(yōu)勢化合物.對活動區(qū)域和對照區(qū)域中共有優(yōu)勢化合物及其相對含量進行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NNR大熊貓活動區(qū)域和非活動區(qū)域共有優(yōu)勢化合物24種(表3)，分屬于PPs、LLMs、OADs、ADs和ONCs這5個超類，其中PPs類優(yōu)勢化合物10種，LLMs類7種，OADs類和ADs類各2種，ONCs類3種.

表3 FS和CS中共有優(yōu)勢化合物超類及相對含量

在這24種化合物中，F(xiàn)S和CS不同竹齡共有化合物僅異葒草苷和長春西汀兩種，其中異葒草苷和長春西汀的含量除FS-3和CS-1中的長春西汀沒有差異外，其余各組均存在顯著差異(F=4.817，P=0.01 &F=5.771，P=0.000).FS中異葒草苷的平均相對含量高達11.29%，為CS的2.15倍；FS-2中異葒草苷的相對含量為CS-2的34.86倍.FS中長春西汀的平均相對含量高達0.85%，為CS的1.23倍；其中以FS-1中長春西汀的相對含量最高.

除異葒草苷和長春西汀外，F(xiàn)S和CS中1年生和2年生BLE中共有優(yōu)勢化合物還有3種，其中麥黃酮和十八碳烯酸含量存在顯著差異(F=4.559，P=0.009 &F=4.694，P=0.001)，9-羥十八碳二烯醇含量差異不顯著(F=2.812，P=0.055)；但同竹齡BLE中這三種物質(zhì)的相對含量均表現(xiàn)為FS高于CS，且都以FS-1中的相對含量最高.1年生和多年生BLE中共有優(yōu)勢化合物有牡荊素鼠李糖苷和昂丹司瓊2種，各組牡荊素鼠李糖苷之間不存在顯著差異(F=2.705，P=0.062)，但昂丹司瓊差異顯著(F=9.483，P=0.000)；其中CS-3組昂丹司瓊相對含量極顯著高于其余各組.

在這24種化合物中，僅在1年生BLE中檢測到的優(yōu)勢化合物有3種，分別是苯基丙氨酸、防己菲堿和噻苯咪唑；其中苯基丙氨酸和噻苯咪唑在FS-1中的相對含量較高，而防己菲堿在CS-1中的相對含量較高.僅在2年生BLE中檢測到的優(yōu)勢化合物有3種，分別是芥子酸酰胺、13-HOTrE和異雄酮，其中僅芥子酸酰胺的相對含量較高，且CS-2高于FS-2，13-HOTrE和異雄酮則表現(xiàn)為FS-2高于CS-2.僅在多年生BLE中檢測到的優(yōu)勢化合物有12種，其中除3′,7-雙氧葡萄糖苷木犀草素和y-亞麻酸相對含量較高外，其余10種化合物的相對含量均介于0.10%～0.62%.

2.2.2 分布于同一區(qū)域的不同竹齡竹葉BLE共有優(yōu)勢化合物分析

對分布于同一區(qū)域不同竹齡的巴山木竹葉中的共有優(yōu)勢化合物種類及相對含量分析結(jié)果見表4.分布于活動區(qū)域的不同竹齡的巴山木竹葉BLE共有優(yōu)勢化合物有10種，其中5種屬于PPs超類，分別是麥黃酮、3′,7-雙氧葡萄糖苷木犀草素、牡荊素鼠李糖苷、三葉豆紫檀苷和圣草酚.對這5超類化合物的相對含量進行比較分析發(fā)現(xiàn)，除FS-1和FS-3中三葉豆紫檀苷差異不顯著外，其余各組各指標之間均存在極顯著差異(P=0.000)，且都以FS-3中含量最高；此外有2種屬于LLMs超類，ADs超類和ONCs超類分別有1種，不同組別中這4種化合物的相對含量都存在顯著差異(P=0.000)，且都以FS-1中相對含量最高.對照區(qū)域中不同竹齡的巴山木竹BLE中共有優(yōu)勢化合物僅有1種，為苯基丙氨酸，屬于OADs超類，該化合物在不同竹齡的竹葉中的相對含量存在極顯著差異(P=0.000)，以CS-3中相對含量最高，為0.3%.

表4 分布于同一區(qū)域的不同竹齡BLE共有優(yōu)勢化合物及其相對含量

3 討論

色譜和質(zhì)譜是當代分離和鑒定常用的分析技術(shù).色譜的優(yōu)勢在于為混合物的分離提供最有效的選擇，但難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，需要依靠與標準品的對比來判斷未知物的信息[19].質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，但其分析的樣品需要進行純化，具有一定的純度后才能進行分析[20].研究采用UPLC-MS法在正負離子模式下掃描采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，運用MSDIAL軟件進行峰識別，結(jié)合多個數(shù)據(jù)庫對色譜峰進行歸屬，通過不同化合物的精確分子量及特征碎片信息來鑒定未知化合物，該方法將色譜對復雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來[21]，可以完成巴山木竹葉中PSMs成分較為全面的分析和鑒定.

分布于活動區(qū)域和對照區(qū)域的巴山木竹BLE的化合物數(shù)存在較大差異，活動區(qū)域的不同竹齡BLE的化合物數(shù)均大于對照區(qū)域.活動區(qū)域的海拔為1 600～1 900 m，而對照區(qū)域海拔為1 200～1 500 m,說明在本研究范圍內(nèi)，分布于高海拔地區(qū)的竹葉PSMs種類數(shù)高于低海拔. Mahzoonikachapi等在分布于1 600 m、2 400 m和3 200 m三個海拔上的薰衣草水蘇(StachyslavandulifoliaVahl)中分別鑒定出47、58種和64種化合物[22]，對祁連圓柏葉中化合物的研究也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果[23].海拔是一個綜合的生態(tài)因素，海拔升高，相應的光照強度、光照量、有效積溫、晝夜溫差和空氣濕度等生態(tài)因子相應發(fā)生改變，進而植物PSMs的組成和量發(fā)生改變[5].

無論是分布于活動區(qū)域的竹葉，還是分布于對照區(qū)域的竹葉，隨著竹齡的增加BLE中化合物總數(shù)均降低，呈現(xiàn)出1年生>2年生>多年生的趨勢.薛英等發(fā)現(xiàn)生長年限對植物部分初級和次級代謝物的積累與消耗均有一定程度的影響[24].相對于老齡植物，幼嫩植物代謝旺盛且營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，需要更多的PSMs來進行防御活動[24].

活動區(qū)域和對照區(qū)域的巴山木竹BLE中含共有優(yōu)勢化合物24種，這些化合物主要分屬于PPs、LLMs、OADs、ONCs和ADs五大超類.PPs超類所含的化合物種類最為豐富，以黃酮類化合物最多.王樂采用紫外分光光度計法對該研究區(qū)域內(nèi)竹葉總黃酮的含量進行測定發(fā)現(xiàn)，竹葉總黃酮的含量有隨季節(jié)和海拔變化而變化，最高可達3.17%(12月，海拔1 800 m)[7].采用HPLC-MS分析鑒定發(fā)現(xiàn)，在FNNR分布的巴山木竹葉中，共含有異葒草苷、麥黃酮、木犀草素、牡荊苷、三葉豆紫檀苷和圣草酚六類黃酮類化合物，其中異葒草苷為活動區(qū)域和對照區(qū)域內(nèi)各竹齡的巴山木竹葉所共有，且活動區(qū)域內(nèi)竹葉中的平均含量更高；其余五種黃酮類化合物是活動區(qū)域中各竹齡BLE的優(yōu)勢化合物.研究發(fā)現(xiàn)，這些黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌和止痙攣等作用[25-31].還有研究表明佛坪大熊貓從竹類食物中攝入的黃酮類化合物越高，其腸道微生物中毒力因子的豐度越低[7].

此外，活動區(qū)域中的兩種LLMs優(yōu)勢化合物為13-HOTrE和9-HODE，他們具有調(diào)節(jié)機體溫度感受器、活化抗炎性物質(zhì)和抗炎性反應等作用[25-26,32]；從BLE中檢測到長春西汀和防己菲堿兩種優(yōu)勢生物堿[33]，其中長春西汀是活動區(qū)域和對照區(qū)域各竹齡竹葉的優(yōu)勢化合物，而防己菲堿僅是活動區(qū)域各竹齡竹葉的優(yōu)勢化合物.研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口攝入或腹腔注射長春西汀均可緩解由酒精誘導的小鼠腸道損傷[34-35]；防己菲堿對心血管損傷引起的相關(guān)疾病具有治療效果[36]；有報道指出，胃腸道疾病是導致圈養(yǎng)大熊貓死亡最主要的原因，對野生大熊貓種群可能也是如此，大熊貓經(jīng)常發(fā)生的不能解釋的胃腸道疼痛可能與寄生蟲或者是腸道梗阻有關(guān)[37].此次研究發(fā)現(xiàn)，3種ONCs(昂丹司瓊，噻苯咪唑和氨甲基哌啶)為BLE中的優(yōu)勢化合物，但僅昂丹司瓊是棲息地不同竹齡竹葉中的優(yōu)勢化合物.昂丹司瓊是血清中5-HT3受體的競爭性抑制劑，可以延遲或促進胃排空，預防或延緩由應激或乙醇誘發(fā)的胃黏膜損傷，抑制腸梗阻中消化液的流失和炎性反應等[38].

4 結(jié)語和保護管理建議

對保護動物而言，全面了解其主要食物化學成分組成及其影響因素對動物覓食策略的影響有助于確定影響種群發(fā)展的主要因素，優(yōu)化種群管理策略，實現(xiàn)種群的可持續(xù)性發(fā)展[14-15，18].研究發(fā)現(xiàn)，陜西佛坪大熊貓可食竹，包括分布于活動區(qū)域和對照區(qū)域內(nèi)的，其竹葉BLE均含有具有特殊藥效作用的異葒草苷和長春西?。幌鄬τ趯φ諈^(qū)域而言，大熊貓活動區(qū)域內(nèi)的竹葉中的PSMs種類更豐富；幼嫩竹葉中含有的PSMs的種類和量均高于老齡竹葉；活動區(qū)域內(nèi)不同竹齡的竹葉中均含有一些具有特殊生物學功能的PSMs.大熊貓以竹為生，竹類不僅要滿足其生長、發(fā)育和繁殖等對營養(yǎng)的需求，還要滿足其抵抗內(nèi)源性和外源性疾病因子侵襲的需求.綜合研究結(jié)果，考慮大熊貓放歸地竹類食物的適宜性和海拔因素等有利于提高放歸成效.分析檢測圈養(yǎng)大熊貓投飼竹中必需養(yǎng)分和PSMs的成分和含量，并根據(jù)野外大熊貓的覓食策略選擇適宜的投飼竹，可在一定程度上提高遷地保護成效.