馬鈴薯塊莖不同發(fā)育時期淀粉合成相關基因表達與淀粉顆粒大小分析*

劉婕， 艾菊， 高冬麗

(云南師范大學 云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是一年生茄科茄屬作物，是繼水稻和小麥之后的第四大主糧作物，也是世界上最重要的塊莖類糧食作物.馬鈴薯塊莖富含淀粉，其含量達到薯塊干物質的80%左右.葉片合成的蔗糖被運輸?shù)今R鈴薯塊莖內，蔗糖透過塊莖細胞的細胞壁進入細胞內，然后在蔗糖合酶(SuSy)等一系列酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(G6P).G6P由葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉運蛋白(GPT)轉運進入質體，開始淀粉的合成[1].腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)焦磷酸化酶是淀粉合成的限速酶，ADPG作為淀粉合成前體通過可溶性淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(SBE)、顆粒結合性淀粉合酶(GBSS)等酶的相互協(xié)同作用催化形成淀粉[2].Van Harsselaar等利用擬南芥的淀粉合成酶在馬鈴薯基因組中進行了同源基因搜索，系統(tǒng)鑒定了馬鈴薯淀粉代謝相關的基因[3]，但這些基因在塊莖發(fā)育過程中的表達變化還沒有詳細的研究.

淀粉以顆粒的形式貯存于細胞中，淀粉顆粒的大小、性狀和組成等因植物種類和器官而異.李芬芬等采用聚焦光束發(fā)射儀法，測得馬鈴薯淀粉的粒徑大小為31.3 μm[4].詹錦玲等采用酶解動力學等方法，發(fā)現(xiàn)結構無破損的馬鈴薯淀粉顆粒的粒度大小與其酶解特性相關聯(lián)，淀粉顆粒越小，其比表面積越大，酶解效率越高[5].以上研究針對的是成熟塊莖的淀粉顆粒粒徑，塊莖在早期發(fā)育過程中淀粉顆粒大小如何變化尚未可知.此次研究利用塊莖7個發(fā)育時期的樣品，檢測了8個淀粉合成相關基因的表達，分析了顆粒粒徑的變化，以期為進一步解析淀粉合成代謝和淀粉顆粒大小的遺傳機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 RT-qPCR

取二倍體馬鈴薯CIP149塊莖發(fā)育早期的7個時期的塊莖(最小直徑約為0.3 cm，最大直徑約為4 cm).同一時期的數(shù)個新鮮馬鈴薯洗凈削皮，各取3～4片于液氮中研磨成粉，獲得同一時期的混樣，每個樣品三個生物學重復.稱取約0.2 g用于提取RNA，并反轉錄為cDNA.RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Plus Kit為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；cDNA反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser以及RT-qPCR所用 2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ和50×ROX Reference Dye Ⅱ均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.RT-qPCR按照以下體積添加各組分：2×TB GreenPremixExTaqTMⅡ 10 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，正向引物(F)0.8 μL，反向引物(R)0.8 μL，稀釋5倍的cDNA 2μL，ddH20 6 μL.RT-qPCR的反應程序為95 ℃ 30 s；40個循環(huán)：95 °C 5 s，60 ℃ 30 s.內參基因為Actin，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量[6].

表1 RT-qPCR所用引物

1.2 淀粉顆粒粒徑分析

稱取步驟1.1中得到的各時期馬鈴薯粉末0.1 g，加入800 μL ddH2O進行溶解，制得樣液.稱取2.0 g碘化鉀及0.2 g碘溶于ddH2O中，100 mL容量瓶定容，制得碘-碘化鉀染液.取樣液-染液(體積比 3∶1)滴于載玻片上，染色后顯微鏡觀察.根據(jù)放大倍數(shù)校正標尺后，測量所拍區(qū)域內淀粉顆粒的粒徑.

2 結果

2.1 淀粉合成酶基因的組織表達特異性

Van Harsselaar等對馬鈴薯淀粉代謝相關基因進行了全基因組分析[3]，我們根據(jù)文獻中提供的基因，結合其他文獻報道的淀粉合成相關基因的功能，篩選了8個基因進行后續(xù)分析.利用Spud DB Potato Genomics Resource (http://spuddb.uga.edu/) 網(wǎng)站提供的Solanum tuberosum Group Phureja double-monoploid (DM) 轉錄組數(shù)據(jù)，分析了8個基因在塊莖、匍匐莖及花等組織中的表達量(表2).結果表明，8個基因在塊莖的表達遠高于在其他組織的表達，說明所選的淀粉合成基因具有組織偏好性表達的特點.

表2 淀粉合成基因的FPKM值

2.2 塊莖發(fā)育過程中淀粉合成相關基因的表達

利用RT-qPCR檢測了淀粉合成相關基因的表達，結果如圖1所示.淀粉合成相關基因在塊莖7個發(fā)育時期的表達有3類模式：第一類是基因的表達在塊莖發(fā)育時期變化較小，包括SS5、SS2和SBE3；第二類是基因的表達基本上隨發(fā)育進程升高，但表達有波動，包括GPT2.1和SS3；第三類是隨著塊莖的發(fā)育，基因的表達逐漸增高，包括APL3、SuSy2和SuSy4.

Y1 到Y7表示塊莖發(fā)育的7個時期.

2.3 塊莖發(fā)育過程中淀粉顆粒粒徑變化

通過碘-碘化鉀染色和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著馬鈴薯塊莖發(fā)育，視野中大顆粒淀粉數(shù)量增多(圖2).分別統(tǒng)計了塊莖發(fā)育7個時期的206、109、257、166、87、144個和76個淀粉顆粒.對淀粉顆粒粒徑< 20 μm、20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm淀粉顆粒在顆粒總數(shù)中的占比進行分析，發(fā)現(xiàn)< 20 μm的淀粉顆粒占比逐漸降低，而20～30 μm、30～40 μm和40～50 μm的淀粉顆粒占比呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，但< 20 μm的淀粉顆粒的比例始終是最大的(圖3).

圖2 塊莖發(fā)育4個時期的淀粉顆粒粒徑圖片展示

圖3 塊莖發(fā)育7個時期的淀粉顆粒粒徑統(tǒng)計

3 結語與討論

淀粉生物合成是多種酶共同作用的結果.從DM的組織表達數(shù)據(jù)來看，淀粉合成相關基因具有塊莖高表達的特征(表2).在塊莖發(fā)育時期，雖然合成基因的表達模式不盡一致，但總體上具有發(fā)育后期表達高于發(fā)育前期表達的特點(圖1).淀粉的合成不僅需要多種酶的參與，而且也受到轉錄因子的調控.在小麥、玉米和水稻等作物中已經(jīng)報道了多種轉錄因子調控淀粉的合成[7].將合成基因作為指示基因，篩選出和指示基因具有共同表達模式的分析方法稱為共表達分析.共表達分析是鑒定多基因代謝通路調控因子的有效方法.研究篩選的8個淀粉合成相關基因具有一致的組織偏好性表達模式，同時在塊莖發(fā)育時期也具有后期表達高于前期表達的特征，將它們作為指示基因有利于進行組織或者發(fā)育時期共表達分析，從而篩選出轉錄調控因子.

小麥淀粉顆粒粒徑的研究已較為深入，小麥淀粉顆粒以10 μm作為分界線，較小的圓形顆粒為B型，較大的盤狀顆粒為A型，A淀粉粒與B淀粉粒在小麥中的比例約為1∶5[8].研究發(fā)現(xiàn)，A淀粉粒與B淀粉粒形成時期不同.A淀粉粒在開花后3～4 d開始形成，在生長過程中，胚乳中A淀粉粒數(shù)目保持不變，而體積逐漸增大；B淀粉粒直到開花后約15 d才形成，在生長過程中，顆粒大小基本不發(fā)生變化，但其數(shù)目一直增加[9-11].由于形成時期不同，A淀粉粒與B淀粉粒在很多淀粉理化性質方面也有所不同.例如，A淀粉粒比B淀粉粒具有更高的峰值黏度、最低黏度以及支鏈淀粉含量[8].Guo等詳細研究了紅薯塊根中的淀粉顆粒，發(fā)現(xiàn)A、B和C三種淀粉顆粒在塊根中共存[12].在馬鈴薯中尚未有詳細的淀粉顆粒粒徑研究[13].從發(fā)育時期來看，雖然隨著塊莖發(fā)育，大顆粒淀粉占比逐漸增加，但小顆粒淀粉仍占絕大部分(圖2).后續(xù)還需要更詳細地劃分顆粒粒徑大小，并對不同大小的淀粉顆粒進行深入研究.淀粉顆粒粒徑受到遺傳因素的影響，F(xiàn)eng等利用重組自交系定位了三個決定淀粉顆粒大小的數(shù)量性狀位點[14].我們測定了部分二倍體馬鈴薯材料的淀粉顆粒大小，發(fā)現(xiàn)在淀粉顆粒粒徑方面有較大的變異，因此后續(xù)有必要開展馬鈴薯淀粉顆粒粒徑的遺傳分析.

綜上所述，淀粉合成相關基因在塊莖中高表達，在塊莖發(fā)育時期，后期表達要高于前期表達.在發(fā)育過程中，以小顆粒淀粉為主，大顆粒淀粉占比呈現(xiàn)出逐漸增加趨勢.研究為進一步鑒定淀粉合成調控因子和淀粉顆粒粒徑研究奠定了基礎.