大豆蛋白/蛋清蛋白復合凝膠性能的影響因素

楊娟，羅瑋倩，何曼源

1(嶺南師范學院 食品科學與工程學院，廣東 湛江，524048)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)聚集體結構無序，二硫鍵含量低[1]，其制備的凝膠類產品難以產生富有彈性和韌性的口感質構。蛋清蛋白(egg albumin，EA)二硫鍵含量豐富，可作為SPI熱致凝膠形成過程中游離巰基的供體[2]。本團隊前期已經通過機械性能、持水力、微觀形貌等指標對二者形成的復合凝膠進行了研究，分析了影響復合凝膠形成的幾個內部因素。但不同外部條件的加入，可使復合體系二硫鍵的形成產生新變化[3]，目前該類研究報道有限?；诙喾N手段可以影響蛋白質的物理化學特性和功能特性，因此探索不同的還原劑、離子強度、多糖、熱處理等方式對每種蛋白質在最終網絡中的貢獻，進而揭示誘導凝膠二硫鍵形成的因素并闡明其對復合凝膠網絡結構特性的影響具有一定意義。

本文基于以上思路，通過添加還原劑NaHSO3和Na2SO3、鹽離子NaCl、多糖刺槐豆膠和結冷膠以及進行不同的熱處理程序來摸索能夠從外部影響大豆蛋白/蛋清蛋白(SPI+EA)復合凝膠性能的因素，分析不同條件下單一SPI體系和SPI+EA復合體系凝膠的狀態(tài)，并用巰基含量的變化研究熱處理對EA的影響，以進一步闡明蛋白質在不同加工條件下的聚集機制[4-5]，從而為選擇性混合SPI與EA的進一步實驗提供思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EA，Sigma公司；低溫脫脂大豆粕，山東御馨生物科技公司；NaCl、Na2SO3、NaHSO3、刺槐豆膠，上海源葉生物科技有限公司；結冷膠，鄲城財鑫糖業(yè)有限責任公司；其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設備

CR22G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機，德國Christ公司；RW 20頂置式攪拌器，德國IKA公司；T25分散均質機，德國IKA公司；Zeiss EVO18臺式掃描電子顯微鏡，德國Carl Zeiss；Genesys 10 s分光光度計，美國Therom Fisher公司；5943萬能材料試驗機，美國INSTRON公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 還原劑濃度及種類

配制質量分數15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和1 mol/L的NaHSO3、Na2SO3溶液使其最終濃度分別為1、5、10、50、100、200 mmol/L，SPI+EA復合溶液濃度為10%(質量分數)。測定成膠性、持水性(water-holding capacity，WHC)并觀察微觀結構[2]。

1.3.2 離子強度

配制質量分數15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1] 10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和2 mol/L NaCl溶液使其最終濃度分別為10、20、50、100、200、500 mmol/L，SPI+EA復合溶液濃度為10%(質量分數)。測定成膠性、持水性并觀察微觀結構[2]。

1.3.3 熱處理程序

配制質量分數10%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]，移取8 mL于10 mL小燒杯并調pH 5.5，置于95 ℃水浴5、10、15、30、45 min，冷卻至室溫觀察和測定成膠性、持水性并觀察微觀結構[2]。

1.3.4 多糖種類

配制質量分數15%質量分數的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1] 10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和質量分數0.9%的刺槐豆膠、結冷膠溶液，使刺槐豆膠、結冷膠溶液最終質量分數分別為0.015%、0.03%、0.06%、0.15%、0.3%，SPI+EA復合溶液為10%(質量分數)。測定成膠性、持水性并觀察微觀結構[2]。

1.3.5 還原劑、鹽離子及多糖復合體系

將1 mol/L NaHSO3溶液、2 mol/L NaCl溶液、質量分數為0.9%的結冷膠溶液及適量去離子水加入了質量分數15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]中，使3種溶液體系中各自保持NaHSO3溶液1 mmol/L、NaCl溶液100 mmol/L和結冷膠溶液0.15%，考察復合影響。另設對照組質量分數質量分數10%純SPI溶液和質量分數10% SPI+EA復合溶液。測定成膠性、持水性并觀察微觀結構[2]。

2 結果與分析

2.1 還原劑濃度及種類

加入不同濃度和種類還原劑加熱后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖1。試驗條件下，加入NaHSO3溶液的凝膠硬度隨著其加入濃度的增加，呈短暫升高后下降趨勢，但加入了Na2SO3溶液的凝膠硬度隨著其加入濃度的增加而逐漸下降，趨勢明顯，在同種濃度下，加入NaHSO3溶液的凝膠硬度比加入了Na2SO3溶液的凝膠硬度更高。同濃度的Na2SO3比NaHSO3對凝膠結構的破壞程度更大。該作用推斷為還原劑具有能夠減弱蛋白質分子內二硫鍵的形成、降低蛋白質凝膠性的作用, 進而降低蛋白質分子形成穩(wěn)定的膠體網絡結構, 使產品更易于分散有關[6]。加入NaHSO3或者Na2SO3的復合凝膠的持水性較高但無特定的趨勢。在濃度相同時，加入NaHSO3比加入Na2SO3對體系持水性影響更具優(yōu)勢。試驗條件范圍內，凝膠的硬度與持水性無明顯關系。加入不同濃度和種類還原劑的SPI+EA凝膠微觀結構如圖2所示。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-1 mmol/L NaHSO3；b-1 mmol/L Na2SO3；c-5 mmol/L NaHSO3；d-5 mmol/L Na2SO3；e-10 mmol/L NaHSO3；f-10 mmol/L Na2SO3；g-50 mmol/L NaHSO3；h-50 mmol/L Na2SO3；i-100 mmol/L NaHSO3；j-100 mmol/L Na2SO3

隨著還原劑濃度的增加，凝膠微觀結構未聯結的粒子數增多，導致凝膠結構松散，硬度低以及易變形(200 mmol/L還原劑形成的凝膠結構太過松軟，無法切片固定)。加入Na2SO3后樣品網絡結構更不清晰，因而其機械強度降低、硬度下降，微結構呈疏松狀。低濃度的NaHSO3的加入會使得凝膠硬度增強，然后隨著其濃度的升高凝膠硬度逐漸下降，微結構漸呈疏松狀。

2.2 離子強度

10%～15%的SPI+EA加入不同濃度鹽溶液后加熱后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖3。鹽濃度10～100 mmol/L內，復合凝膠的結構和質地表現為緊致，形態(tài)無差別，鹽離子濃度≥200 mmol/L后凝膠逐漸松軟、硬度明顯降低。500 mmol/L NaCl溶液的凝膠體系無法形成直立圓柱體。數據揭示，試驗條件下鹽濃度提高，對凝膠的質構產生先正后負的影響[7-9]。鹽濃度10～100 mmol/L內，凝膠硬度隨濃度增加，表明鹽溶液中和了蛋白質表面的電荷，蛋白質分子間相互吸引作用增強，分子迅速聚集形成硬的凝膠。鹽離子濃度500 mmol/L后，蛋白質出現鹽溶現象，凝膠強度也出現下降[7-9]。數據表明，凝膠的持水性整體改變不明顯。加入不同濃度鹽溶液的SPI+EA凝膠微觀結構見圖4。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-10 mmol/L；b-20 mmol/L；c- 50 mmol/L；d-100 mmol/L；e-200 mmol/L；f-500 mmol/L

凝膠微觀結構隨鹽濃度增加從疏松過渡為致密，未聯結的粒子數減少，凝膠微觀結構有很大改善。其他樣品顆粒聚集形成網絡，鹽濃度為500 mmol/L的凝膠結構柱網絡結構消失，蛋白形成一片狀，導致其凝膠強度下降，持水性提高。因此，低濃度的鹽離子的加入可以增加凝膠的硬度，一定程度提高凝膠持水性，但濃度較高時將又降低凝膠硬度且提高持水性[7-9]。

2.3 熱處理程序

10%～15%的SPI+EA經過不同熱處理程序后加熱所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖如圖5所示。試驗條件下，蛋白有更多機會及充足時間打開原有二硫鍵并生成更多的二硫鍵，隨加熱時間延長凝膠硬度和持水性逐漸升高，凝膠微觀結構未聯結的顆粒趨于減少，緊致性稍有增加。持水性和微觀結構都組間差別不明顯。加熱時間對凝膠持水性和微觀結構的影響并非主要因素[10-12]。經過不同熱處理程序后加熱所形成的凝膠微觀結構見圖6。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-加熱5 min；b-加熱10 min；c-加熱15 min；d-加熱30 min；e-加熱45 min

2.4 不同的多糖

10%～15%的SPI+EA加入不同濃度和種類多糖后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖7。在多糖濃度0.015%～0.3%(質量分數)內，隨著刺槐豆膠濃度升高，凝膠硬度增加且結構趨于完善緊致；隨結冷膠的濃度的上升，凝膠形成的孔隙增加且影響凝膠的硬度，形態(tài)不再良好完整。這與文獻報道的濃度對結冷膠形成的凝膠的質構影響較大相一致[13]。加結冷膠溶液的體系相比于加入刺槐豆膠溶液的體系的持水性能更具優(yōu)勢，0.3%時結冷膠體系的持水性達到了74.8%。當刺槐豆膠和結冷膠量少的時候，蛋白部分空間被擠，但在整個體系占主導地位，使蛋白網絡的密度反而增加，導致了復合凝膠的強度和持水性增加[14-15]。但是當結冷膠濃度較高時，蛋白和多糖的關系相反，多糖占主導地位，使蛋白的網絡不連續(xù)，凝膠強度變弱，體系水分含量上升[14-15]。加入不同濃度和種類多糖后所形成的凝膠微觀結構見圖8。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-0.015%刺槐豆膠；b-0.015%結冷膠；c-0.03%刺槐豆膠；d-0.03%結冷膠；e-0.06刺槐豆膠；f-0.06%刺槐豆膠；g-0.15%結冷膠；h-0.15%刺槐豆膠；i-0.3%結冷膠；j-0.3%刺槐豆膠

隨著多糖濃度的增加，微觀結構從疏松過渡為致密，未聯結的粒子數減少，形成片狀[9]。相同濃度下，加入結冷膠比加入刺槐豆膠形成的凝膠結構更致密、硬度相對較高，但高濃度結冷膠會導致形成的凝膠內部孔隙較多并降低其硬度。

2.5 還原劑、鹽離子及多糖復合體系

10%～15%的SPI+EA單獨/復合加入了1 mmol/L NaHSO3、 100 mmol/L NaCl、 0.15%結冷膠的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖9。純10%(質量分數)SPI 形成的凝膠結構最疏松、硬度最低，SPI+EA復合凝膠結構明顯變得完整緊致、硬度明顯提高，100 mmol/L NaCl提升復合體系的硬度優(yōu)于1 mmol/L NaHSO3，質量分數0.15%結冷膠能夠顯著提升復合體系的硬度。在同時加入了1 mmol/L NaHSO3、100 mmol/L NaCl和0.15%結冷膠的混合組中，SPI+EA復合凝膠體系的硬度提高效果最好，其持水性相比于未添加的原體系改變良好[9]。單獨/復合加入了不同濃度的還原劑、鹽和多糖的凝膠微觀結構見圖10。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-10% SPI；b-10% SPI+EA；c-1 mmol/L NaHSO3；d-100 mmol/L NaCl；e-0.15%結冷膠；f-NaHSO3+NaCl+結冷膠

單獨/混合加入NaHSO3、NaCl、結冷膠的復合體系的微觀結構相比與純SPI或SPI+EA復合體系更加致密，未聯結的顆粒數減少，因素的作用疊加使多條件復合凝膠的硬度達到最高，顯著增加凝膠的持水性。

二硫鍵的形成對復合體系成膠性能的影響，如表1所示。

表1 游離巰基、總巰基及二硫鍵含量[14-16]

從二硫鍵含量可知，SPI溶液中的二硫鍵含量較少，EA的加入可以提高復合體系中二硫鍵的含量，在還原劑低濃度時復合凝膠內二硫鍵的含量增加甚微。加入NaCl和結冷膠會顯著增加復合體系中二硫鍵的含量，從而導致隨著加入溶液濃度的增加，凝膠強度逐漸增強的現象。在同時添加了NaHSO3、NaCl和結冷膠的體系中，二硫鍵的含量顯著增加。

3 結論與討論

低還原劑濃度利于復合凝膠蛋白網絡增加，低濃度還原劑與游離巰基形成氧化還原對，或是打開了一些原有分子內的二硫鍵，最終形成了更強的網絡。而還原劑濃度較高時，新形成的二硫鍵被打斷，網絡得不到增強，反而減弱了凝膠強度，但持水性得到了增加[5]。蛋白分子表面有親水、帶電基團，提供分子間的斥力，提高體系的離子強度將該作用屏蔽或削弱，聚集程度提高，最終凝膠強度增加。當鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質出現鹽溶現象，凝膠強度也出現下降，但鹽溶時持水性會顯著提高[7-9]。熱處理時間短時，諸多促使凝膠形成的相互作用都沒生成，隨時間延長，蛋白有更多機會及充足時間打開原有二硫鍵并生成更多的二硫鍵，凝膠強度和持水性也隨之提高。添加多糖目的為通過微觀相分離的辦法增加凝膠的強度[17]。加入鹽離子和結冷膠都會增加復合凝膠中二硫鍵的含量，還原劑的影響并不明顯，在多條件復合的條件下可以明顯獲得最佳硬度和持水性的凝膠[14-15]。