少動(dòng)鞘氨醇單胞菌合成結(jié)冷膠研究進(jìn)展

鄭麗圓,李宛瑩,喻林兵,夏永軍,艾連中,熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海食品微生物工程研究中心,上海,200093)

結(jié)冷膠最初被稱為多糖S-60,是少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(舊名為Sphingomonaselodea和Pseudomonaselodea)發(fā)酵所產(chǎn)胞外多糖[1]。結(jié)冷膠是近年來在食品領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的凝膠劑之一,1992年美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)其作為凝膠劑、懸浮劑和穩(wěn)定劑應(yīng)用于食品和化妝品工業(yè),1996年我國批準(zhǔn)其作為食品添加劑[2]。結(jié)冷膠能在冷、熱條件下形成熱可逆水凝膠[3],在食品中使用量一般為0.1%～0.3%,只需0.25%的用量即可達(dá)到瓊脂1.5%的凝膠強(qiáng)度。在食品工業(yè)中,結(jié)冷膠作為穩(wěn)定劑用于乳液凝膠,在連續(xù)相和油水界面處形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4-5],結(jié)冷膠可應(yīng)用于多種類型的果凍、布丁等凝膠性食品的加工[6-8],在飲料中使用也能有效防止不溶物沉淀產(chǎn)生[9]。結(jié)冷膠在醫(yī)療領(lǐng)域可作為新型材料用于軟骨組織再生[10-12],也可作為藥物遞送載體用于鼻、眼、胃和結(jié)腸給藥[13-14]。在個(gè)人護(hù)理領(lǐng)域中應(yīng)用于面膜、沐浴露和噴霧等產(chǎn)品。在化工領(lǐng)域結(jié)冷膠作為抗溶脹黏土穩(wěn)定劑廣泛用于石油開采[15]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域結(jié)冷膠復(fù)合水凝膠顯示出高保水性,可控制肥料的釋放[16]。GAMAL等[17]學(xué)者率先對(duì)結(jié)冷膠生物合成途徑和代謝調(diào)控進(jìn)行研究,參與合成部分基因已克隆測序,為其代謝調(diào)控提供方向,但目前對(duì)結(jié)冷膠合成調(diào)控機(jī)制尚未完全解析[18-21]。本文主要從結(jié)冷膠生物合成途徑和代謝調(diào)控進(jìn)行綜述,以期加深對(duì)結(jié)冷膠生物合成的認(rèn)識(shí),為構(gòu)建產(chǎn)結(jié)冷膠工程菌株提供新思路。

1 結(jié)冷膠的組成和結(jié)構(gòu)

結(jié)冷膠分子骨架由β(1→3)-D-葡萄糖、β(1→4)-D-葡萄糖醛酸、β(1→4)-D-葡萄糖和α(1→4)-L-鼠李糖線性四糖重復(fù)單元組成,按摩爾比1∶1∶1∶1聚合,分子質(zhì)量約為5×105Da[22-23]。結(jié)冷膠存在兩種形式:高?；Y(jié)冷膠(也稱天然結(jié)冷膠)和低?；Y(jié)冷膠(也稱脫酰基結(jié)冷膠)。高?；Y(jié)冷膠在第一個(gè)葡萄糖基的C-3位置上為甘油酯基,在同一葡萄糖基的C-6位置上為乙酰基(圖1),每重復(fù)單元有1 mol甘油酯基和0.5 mol乙?；鵞24]。高?；Y(jié)冷膠因含有豐富的?；?形成的凝膠富有彈性且較柔軟,與黃原膠和刺槐豆膠性能相似,適合做增稠劑[25]。高?；Y(jié)冷膠通過熱堿處理,可除去甘油酯基和乙?；?獲得低?；Y(jié)冷膠。低?；Y(jié)冷膠在冷熱水中均溶解,加入陽離子可形成強(qiáng)度大、堅(jiān)硬但易脆裂并具有更高熱穩(wěn)定性的凝膠[26-27]。二價(jià)陽離子(Ca2+和Mg2+)比一價(jià)陽離子(Na+和K+)更有效地促進(jìn)膠凝,結(jié)冷膠在Ca2+存在下形成最穩(wěn)定的凝膠[28]。不同化學(xué)結(jié)構(gòu)決定高?；偷王；Y(jié)冷膠性能上的差異,結(jié)冷膠在溶液狀態(tài)下冷卻時(shí)形成的有序形式是雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)[29]。低酰基結(jié)冷膠多糖鏈之間平行排列成為半交錯(cuò)互相纏繞的雙螺旋結(jié)構(gòu),而高?；Y(jié)冷膠的分子則呈內(nèi)卷曲折疊結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)冷膠的生物合成途徑

少動(dòng)鞘氨醇單胞菌基因組大小約為4.12 Mb,GC含量為67.4%。結(jié)冷膠生物合成基因簇主要分布在基因組的3個(gè)區(qū)域(圖2-a),彼此互不相連。Ⅰ區(qū)從gelQ到orf302共19個(gè)基因,22 021 bp;Ⅲ區(qū)為gelA單個(gè)基因,2 391 bp;Ⅳ區(qū)從gelR到gelG共3個(gè)基因,5 009 bp。Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)間隔2 180 kbp,Ⅳ區(qū)和Ⅲ區(qū)間隔1 035 kbp。此外,參與糖前體合成的基因pgmG、ugpG和ugdG位于基因組上其他位置。結(jié)冷膠生物合成途徑共分為3步(圖2-b):a)核苷酸糖前體合成;b)四糖重復(fù)單元組裝;c)重復(fù)單元的聚合和輸出[20]。

圖1 結(jié)冷膠的重復(fù)單元Fig.1 Repeated units of gellan gum

a-結(jié)冷膠組裝模型;b-結(jié)冷膠生物合成和裝配的模式圖2 結(jié)冷膠生物合成途徑Fig.2 The biosynthetic pathway of gellan gum

2.1 核苷酸-糖前體的生物合成

結(jié)冷膠生物合成途徑從糖核苷酸前體開始,該前體包括UDP-D-葡萄糖、UDP-D-葡糖醛酸和dTDP-L-鼠李糖(圖3)。葡萄糖-1-磷酸是UDP-D-葡萄糖醛酸和dTDP-L-鼠李糖合成的底物,由磷酸甘露糖變位酶/磷酸葡萄糖變位酶(phosphomannomutase/phosphoglucomutase,PMM/PgmG)催化形成,PgmG催化葡萄糖-1-磷酸比甘露糖-1-磷酸的效率(Kcat/Km)高約15倍[30]。合成葡萄糖-1-磷酸后,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UgpG)催化葡萄糖-1-磷酸可逆轉(zhuǎn)化為UDP-D-葡萄糖[31];UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase,UgdG)將UDP-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-D-葡萄糖醛酸[32]。TDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-D-glucose pyrophosphorylase,RmlA)將葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸轉(zhuǎn)化為TDP-D-葡萄糖,再經(jīng)過dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶(dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase,RmlB)、dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖異構(gòu)酶(dTDP-4 dehydrorhamnose 3,5 epimerase,RmlC)和dTDP-6-脫氧鼠李糖脫氫酶(dTDP-4 dehydrorhamnose reductase,RmlD)催化形成dTDP-L-鼠李糖。

PgmG:磷酸葡萄糖變位酶圖3 結(jié)冷膠的核苷酸-糖前體生物合成Fig.3 Biosynthesis of nucleotide-sugar precursors of gellan gum

2.2 四糖重復(fù)單元的合成

在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖核苷酸前體轉(zhuǎn)移至活化的C55-異戊二烯磷酸酯脂質(zhì)載體,參與此過程的基因主要包括gelQ、gelK、gelL和gelB[33](圖2-a)。GelB與少動(dòng)鞘氨醇單胞菌ATCC 31554的糖基轉(zhuǎn)移酶SpsB同源,推測可將葡萄糖-1-磷酸從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)載體上。GelK具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性,能催化葡萄糖醛酸連接到脂質(zhì)載體相連的第一個(gè)葡萄糖上[34]。四糖單元組裝所需的另外兩種糖基轉(zhuǎn)移酶可能為GelL和GelQ,推測分別參與UDP-葡萄糖和dTDP-L-鼠李糖的添加。

2.3 結(jié)冷膠重復(fù)單元的聚合和輸出

多糖生物合成下一步是重復(fù)單元的聚合并形成長鏈,GelS、GelG、GelC、GelE和GelD參與結(jié)冷膠的聚合和輸出。結(jié)冷膠聚合反應(yīng)機(jī)制推測是Wzy依賴途徑(Wzy-dependent pathway),每個(gè)四糖重復(fù)單元通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Wzx從內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至周質(zhì)空間,然后通過聚合酶Wzy聚合形成一個(gè)長鏈聚合物。GelS與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Wzx同源,預(yù)測含10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,可能與多糖鏈轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[35]。GelG與聚合酶Wzy具有同源性,是一種位于質(zhì)膜上的整合蛋白,有假定聚合酶特征,推測GelG參與多糖聚合[21]。多糖共聚酶(polysaccharide co-polymerase,PCP)蛋白家族控制合成多糖鏈長,GelC和GelE預(yù)測為PCP,與野生型菌株相比,缺失GelC和GelE的突變體顯示出非黏液表型,表明兩者控制多糖鏈長。多糖轉(zhuǎn)運(yùn)至膜外需要外膜輔助家族蛋白(outer membrane auxiliary,OMA)介導(dǎo)形成的蛋白質(zhì)通道,多糖經(jīng)此通道輸出至細(xì)胞膜外。GelD與OMA外膜蛋白同源,GelD缺失顯著降低結(jié)冷膠產(chǎn)量,因此推測GelD起結(jié)冷膠轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。第Ⅲ區(qū)由雙組分調(diào)節(jié)蛋白GelA組成,含組氨酸蛋白激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白同源區(qū)域,是結(jié)冷膠生物合成的正調(diào)節(jié)因子。GelA突變體在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量多糖,推測該蛋白可感知環(huán)境變化,在碳源豐富的條件下啟動(dòng)結(jié)冷膠生產(chǎn)[20]。

結(jié)冷膠生物合成基因簇部分基因得到表征,但仍有一些基因未證實(shí)功能。研究發(fā)現(xiàn),GelF中的突變可能是致命的,推測形成脂質(zhì)連接中間體的第一步如果被阻斷,會(huì)損害細(xì)胞壁合成,或者是突變對(duì)下游基因產(chǎn)生極性效應(yīng),影響細(xì)胞存活。GelI突變會(huì)影響結(jié)冷膠的產(chǎn)量,但不會(huì)影響其組成。GelI與參與周質(zhì)或外膜蛋白質(zhì)折疊的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶有弱同源性,推測GelI可能參與蛋白質(zhì)加工和結(jié)冷膠的分泌。GelM和GelN的缺失導(dǎo)致結(jié)冷膠產(chǎn)量減少和黏度降低,但不影響其組成,表明這些蛋白質(zhì)可能影響結(jié)冷膠的鏈長和分泌。AtrD和AtrB與I型分泌系統(tǒng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯示出同源性,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過內(nèi)膜輸出胞外多糖,也可能決定胞外多糖鏈長[36]。但AtrD和AtrB的突變沒有影響結(jié)冷膠的合成,其在結(jié)冷膠生產(chǎn)中的作用未知[37]。

3 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的代謝調(diào)控

3.1 敲除旁支途徑相關(guān)基因

糖核苷酸前體合成是結(jié)冷膠生物合成的重要步驟,葡萄糖-6-磷酸不僅在PGM催化下生成葡萄糖-1-磷酸,繼而合成結(jié)冷膠糖核苷酸前體,還在磷酸葡萄糖脫氫酶(Zwf)催化下生成6-磷酸葡萄糖酸酯,參與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP途徑)。VARTAK等[38]無效突變Zwf,期望使碳通量轉(zhuǎn)移到結(jié)冷膠合成中,但結(jié)冷膠產(chǎn)量并無改變,可能是在zwf突變株中,葡萄糖通過涉及葡萄糖酸激酶的途徑被利用,轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸酯進(jìn)入PPP途徑。

結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)中會(huì)積累大量代謝副產(chǎn)物類胡蘿卜素和聚β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB),類胡蘿卜素使發(fā)酵液呈黃色,影響產(chǎn)品的透明度,PHB使發(fā)酵液濁度增加。葡萄糖-6-磷酸經(jīng)糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸后,催化生成乙酰輔酶A,PHB生物合成途徑始于乙酰輔酶A,類胡蘿卜素生物合成始于3-磷酸-甘油醛。為使葡萄糖-6-磷酸更集中流向合成葡萄糖-1-磷酸,LI等[39]和ZHU等[40]敲除類胡蘿卜素生物合成途徑中的八氫番茄紅素去飽和酶基因crtl和編碼PHB合酶的phaC基因,以期結(jié)冷膠產(chǎn)量增加,減少副產(chǎn)物合成降低生產(chǎn)成本;結(jié)果顯示,crtI突變體盡管菌落形態(tài)與野生型菌株接近,但菌落呈白色,而野生型菌落呈黃色。ΔphaCΔcrtI雙敲除突變體的多糖產(chǎn)量顯著下降,推測雙敲除突變體中PHB合成途徑的阻斷可能會(huì)影響整個(gè)葡萄糖代謝網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致代謝中間體包括丙酮酸等有機(jī)酸的積累,對(duì)結(jié)冷膠生產(chǎn)造成不利影響[28]。此外,類胡蘿卜素和PHB合成過程部分途徑如乙酰輔酶A在酶催化下生成3-羥基丁酰輔酶A是NADP(H)依賴性反應(yīng),阻斷PHB合成可能會(huì)破壞整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中NADPH和NADP+平衡,導(dǎo)致結(jié)冷膠產(chǎn)量降低。

3.2 增加合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)

PgmG催化葡萄糖-6-磷酸形成葡萄糖-1-磷酸,UgpG直接參與催化生成UDP-葡萄糖,并間接參與另一結(jié)冷膠糖核苷酸前體UDP-葡萄糖醛酸的形成(圖3)。研究表明,ugpG、pgmG和gelK基因單獨(dú)過表達(dá)盡管導(dǎo)致其編碼的酶活性增加,但對(duì)結(jié)冷膠合成并無顯著影響,而共表達(dá)gelK和pgmG使結(jié)冷膠合成提升20%,黏度增加[41],推測單獨(dú)過表達(dá)PgmG雖然能提高糖核苷酸前體供給,但多糖重復(fù)單元組裝成為限制步驟,而共表達(dá)GelK和PgmG使糖核苷酸前體更高效的轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)載體進(jìn)而合成結(jié)冷膠。在鞘氨醇單胞菌S7中單獨(dú)過表達(dá)pgmG,共表達(dá)pgmG和S7c6(spsGQIKLFDCEBrhsACB)也有類似的結(jié)果,單獨(dú)過表達(dá)pgmG對(duì)S-7多糖合成沒有顯著影響,但共表達(dá)pgmG和S7c6使發(fā)酵液黏度增加40%(30 000 Pa·s),產(chǎn)量提高10%[42]。spsGQIKLFDCEB編碼S-7多糖合成基因簇中4種糖基轉(zhuǎn)移酶和分泌蛋白,rhsACB負(fù)責(zé)鼠李糖合成。黏度增加40%可能是由于S7c6片段缺少編碼連接兩個(gè)側(cè)鏈葡萄糖殘基的糖基轉(zhuǎn)移酶,缺乏側(cè)鏈的聚合物積累使發(fā)酵液黏度大幅增加,導(dǎo)致工程菌氧氣利用率降低,S-7多糖產(chǎn)量僅提升10%。

參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)少動(dòng)鞘氨醇單胞菌合成結(jié)冷膠的代謝調(diào)控進(jìn)行歸納總結(jié),如表2所示。GelD負(fù)責(zé)將結(jié)冷膠轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,過表達(dá)gelD工程菌結(jié)冷膠產(chǎn)量約為野生型的兩倍,高達(dá)12.46 g/L[43],推測GelD是影響結(jié)冷膠分泌到胞外的關(guān)鍵酶。分別使用載體pBBR122克隆少動(dòng)鞘氨醇結(jié)冷膠生物合成基因gelQ、gelB、gelL和gelK,其中g(shù)elQ工程菌結(jié)冷膠產(chǎn)量是野生型兩倍[44]。GelQ是結(jié)冷膠四糖重復(fù)單元組裝的最后環(huán)節(jié),參與dTDP-L-鼠李糖的添加,推測其為限制結(jié)冷膠四糖重復(fù)單元組裝的關(guān)鍵步驟。LEE等[45]分別過表達(dá)結(jié)冷膠合成途徑中的gelN和gelA基因,工程菌表型更黏稠,結(jié)冷膠產(chǎn)量分別增加48.3%和21.2%。GelA為雙組分調(diào)節(jié)蛋白,GelA過表達(dá)導(dǎo)致胞外多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖結(jié)合輸出蛋白和雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)分別上調(diào)3.61、2.57和2.11倍,而糖差向異構(gòu)酶下調(diào)2.1倍,糖單元差向異構(gòu)化可能改變多糖的理化性質(zhì),該蛋白下調(diào)可能使工程菌環(huán)境適應(yīng)能力增強(qiáng)。過表達(dá)GelN導(dǎo)致甘露糖-1-磷酸鳥苷基轉(zhuǎn)移酶/甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶和總分泌蛋白L表達(dá)分別上調(diào)2.7和3.23倍,推測GelN與甘露糖向三磷酸鳥苷的轉(zhuǎn)移和促進(jìn)結(jié)冷膠分泌有關(guān);共表達(dá)GelA和GelN可能影響結(jié)冷膠合成與輸出的相關(guān)步驟,保障結(jié)冷膠的生物合成和分泌。

表2 少動(dòng)鞘氨醇單胞菌合成結(jié)冷膠的代謝調(diào)控Table 2 Metabolic regulation of gellan gum biosynthesis

4 結(jié)論與展望

目前對(duì)結(jié)冷膠生物合成基因簇的研究僅能推測核苷酸糖前體的組成和重復(fù)單元的組裝模式,但四糖重復(fù)單元組裝的生化等實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少。參與結(jié)冷膠生物合成的基因多達(dá)26個(gè),但結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株的代謝調(diào)控目前僅限于少數(shù)基因的過表達(dá)或敲除。因此,結(jié)冷膠生物合成機(jī)制解析和結(jié)冷膠高產(chǎn)菌株構(gòu)建工作未來可開展下列研究:1)缺少高效的遺傳操作工具限制了少動(dòng)鞘氨醇單胞菌基因編輯,可建立CRISPR等新一代基因修飾系統(tǒng)全面解析結(jié)冷膠生物合成中各基因的具體功能和調(diào)控機(jī)制;2)結(jié)冷膠四糖重復(fù)單元組裝時(shí)甘油酯基在酶的作用下轉(zhuǎn)移到多糖鏈上,不同?；繒?huì)影響結(jié)冷膠的特性,甘油酯基會(huì)引起結(jié)冷膠脫?；瘯r(shí)顯著的流變學(xué)變化,而編碼甘油?；D(zhuǎn)移酶的基因還尚未闡明,后續(xù)在基因功能解析基礎(chǔ)上可通過基因工程手段調(diào)控甘油酰基轉(zhuǎn)移酶來控制結(jié)冷膠?；?3)由于目前對(duì)鞘氨醇單胞菌合成結(jié)冷膠的生物途徑認(rèn)識(shí)還不夠清晰,可在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等遺傳背景清晰的宿主中,通過構(gòu)建cosmid文庫、TAR克隆技術(shù)、Rec/ET同源重組技術(shù)等異源表達(dá)結(jié)冷膠基因簇,避開原始宿主中復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的緊密控制,探究結(jié)冷膠生物合成的最簡模塊和調(diào)控機(jī)制;4)通過開發(fā)誘導(dǎo)調(diào)控元件,對(duì)代謝途徑代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控,快速響應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境及細(xì)胞內(nèi)代謝物濃度變化,實(shí)現(xiàn)結(jié)冷膠高效合成。結(jié)冷膠生物合成途徑的深入研究,將為基因工程和代謝工程等方法促進(jìn)結(jié)冷膠合成提供理論基礎(chǔ),也將推動(dòng)利用分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)具有不同結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的新型結(jié)冷膠多糖。