細(xì)菌sRNA來源、作用機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究進(jìn)展

趙子墨,喬建軍,2,袁琳,龍映鵬,任書江,吳昊

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津,300072)2(天津大學(xué)浙江研究院(紹興),浙江 紹興,312300) 3(天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津,300384)4(天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津,300384)

細(xì)菌發(fā)酵過程中存在著代謝副產(chǎn)物多、產(chǎn)物抑制、環(huán)境脅迫等問題,導(dǎo)致發(fā)酵成本高、產(chǎn)量低,限制了工業(yè)菌株的發(fā)展。解析并優(yōu)化細(xì)菌的代謝途徑、提高它們的環(huán)境適應(yīng)能力可以從根本上改善這些問題,促進(jìn)發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。

細(xì)菌中普遍存在一類長(zhǎng)度在50～400個(gè)核苷酸的較短轉(zhuǎn)錄本,它們以RNA的形式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),這些具有調(diào)控功能的短的RNA通常被稱為小RNA(small RNA, sRNA)[1-2]。sRNA主要通過堿基配對(duì)影響靶mRNA的翻譯和穩(wěn)定性,在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、適應(yīng)環(huán)境變化、應(yīng)激反應(yīng)、群體感應(yīng)、毒力調(diào)節(jié)等各種細(xì)胞過程中發(fā)揮核心作用[2-3]。利用sRNA調(diào)控機(jī)制,可以對(duì)工程菌進(jìn)行改造使其適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件或減弱細(xì)菌毒素的表達(dá)。例如,在乳酸乳球菌中sRNA s042和s015都可以提高菌株的耐酸能力,可緩解其發(fā)酵過程中受到的pH限制,間接提高發(fā)酵產(chǎn)物乳酸鏈球菌素的產(chǎn)量[4-5]。在產(chǎn)氣腸桿菌中過表達(dá)sRNA RyhB并調(diào)節(jié)NADH水平可以優(yōu)化代謝途徑,顯著提高工業(yè)產(chǎn)品2,3-丁二醇的產(chǎn)量[6]。

細(xì)菌應(yīng)對(duì)復(fù)雜的環(huán)境變化時(shí),對(duì)基因的調(diào)控往往是多層次的,與已經(jīng)廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子、雙組分系統(tǒng)等面向DNA的調(diào)控元件不同,sRNA的作用特性使其提供了另一個(gè)豐富的RNA調(diào)節(jié)層,形成對(duì)DNA調(diào)節(jié)層的拓展和補(bǔ)充,共同構(gòu)成細(xì)菌中龐大復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文將從sRNA來源的多樣性、作用機(jī)制的多樣性及sRNA與其他調(diào)控組分的復(fù)雜關(guān)聯(lián)來闡述sRNA在細(xì)菌復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要角色和作用,為解決發(fā)酵工業(yè)存在的問題提供理論參考。

1 sRNA來源的多樣性

隨著對(duì)sRNA研究的深入,sRNA的來源也不僅僅局限于傳統(tǒng)意義上的順式編碼和反式編碼(基因間區(qū)編碼),越來越多的反式作用sRNA被發(fā)現(xiàn)由mRNA的5′非翻譯區(qū)(5′ untranslated region, 5′UTR)和3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated region, 3′UTR)衍生出來,它們往往和原位基因使用共同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或終止位點(diǎn)[7]。豐富的來源使sRNA在細(xì)菌生命過程中發(fā)揮的作用更加廣泛和精細(xì),不同來源的sRNA及其特點(diǎn)匯總在表1中。

1.1 順式編碼的sRNA

順式編碼的sRNA從基因反義鏈上轉(zhuǎn)錄,因此又被稱作反義sRNA(antisense RNA, asRNA),它們與靶mRNA的一部分完全互補(bǔ),起到迅速調(diào)節(jié)的作用[22]。sRNA GadY,編碼在相鄰基因酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子gadX的相反鏈,與gadXmRNA 3′UTR堿基互補(bǔ)并增加其穩(wěn)定性,導(dǎo)致gadXmRNA的積累,進(jìn)而促進(jìn)下游谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá),有利于大腸桿菌的耐酸生長(zhǎng)[8-9]。lexA基因在金黃色葡萄球菌中是 SOS反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,臨床分離的一種突變株在lexA相反鏈的下游能夠產(chǎn)生sRNAlexA-asRNA,是由于上游基因sbrB內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄終止子(transcriptional terminator, TT)自然突變而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄通讀產(chǎn)生的,能在堿脅迫的環(huán)境下抑制lexA表達(dá)并激活SOS反應(yīng)[23]。雖然該突變?cè)诮瘘S色葡萄球菌中并不保守,但是類似的TT自然突變導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄通讀現(xiàn)象并不罕見,它們代表了一種新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和遺傳進(jìn)化的方式[23]。

1.2 反式編碼的sRNA

最初發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)sRNA是研究相鄰基因時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的(如MicF,DsrA),因此sRNA被認(rèn)為由基因間區(qū)產(chǎn)生[24]。除了基因間區(qū)編碼,越來越多的sRNA被發(fā)現(xiàn)從基因mRNA兩端的非翻譯區(qū)衍生而來,5′UTR和3′UTR正逐漸成為新的sRNA候選庫(kù)。

1.2.1 基因間區(qū)編碼的sRNA

基因間區(qū)編碼的sRNA與其他基因間沒有重疊,獨(dú)立轉(zhuǎn)錄出來發(fā)揮作用。大腸桿菌中的RyhB是一個(gè)經(jīng)典的反式作用sRNA,受到鐵調(diào)控因子Fur的抑制,在缺鐵環(huán)境中,RyhB借助分子伴侶Hfq控制50多個(gè)參與鐵攝取和鐵利用的基因來維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài),發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。類似地,最近在金黃色葡萄球菌中也鑒定出了與維持鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的sRNA IsrR,為應(yīng)對(duì)宿主體內(nèi)的缺鐵環(huán)境,它能抑制非必需途徑中含鐵酶的表達(dá),并將鐵進(jìn)行重新分配[13]。IsrR與RyhB發(fā)揮的功能非常相似,但I(xiàn)srR并不是RyhB的同源物,也不需要Hfq協(xié)助發(fā)揮作用[13]。這說明在細(xì)菌生命進(jìn)化的過程中,無(wú)論革蘭氏陰性菌還是陽(yáng)性菌,sRNA都在快速應(yīng)對(duì)環(huán)境變化中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用。

1.2.2 由5′UTR衍生的sRNA

5′UTR是基因mRNA 5′末端的非翻譯區(qū),不參與蛋白質(zhì)的合成,但最近的研究證明5′UTR可以通過核糖核酸酶(RNase)等的剪切被加工成獨(dú)立的sRNA發(fā)揮作用。銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因rhlI的5′UTR區(qū)域能衍生出一種具有活性的sRNA RhlS,它能夠激活rhlI的翻譯并誘導(dǎo)正丁?；呓z氨酸內(nèi)酯合酶產(chǎn)生,還能調(diào)節(jié)編碼鐵載體受體的基因fpvA的mRNA[10]。沙門氏菌的編碼內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的oppABCDF基因簇的5′UTR中發(fā)現(xiàn)了一種RNA海綿OppX,它能通過隔離sRNA MicF的種子區(qū)域來減弱MicF的抑制作用,促進(jìn)膜孔蛋白OmpF的合成,從而調(diào)節(jié)細(xì)菌包膜的滲透性和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)萚14]。OppX僅僅作為RNA海綿將MicF隔離在一個(gè)不具有活性的復(fù)合體中,而不影響它的水平和穩(wěn)定性[14]。這意味著細(xì)菌sRNA在復(fù)雜調(diào)控中往往不是單獨(dú)發(fā)揮作用,而是與其他調(diào)節(jié)元件共同發(fā)揮作用。

1.2.3 由3′UTR衍生的sRNA

與5′UTR類似,3′UTR是mRNA 3′末端的非翻譯區(qū),通過核糖核酸內(nèi)切酶或外切酶的加工,能產(chǎn)生具有豐富調(diào)節(jié)功能的sRNA[25-26]。乳酸乳球菌基因argR的3′UTR中被鑒定出一種sRNA ArgX,它有獨(dú)立的啟動(dòng)子并受到精氨酸濃度和轉(zhuǎn)錄因子CcpA的誘導(dǎo),可以調(diào)節(jié)精氨酸脫亞胺酶途徑中的arcmRNA水平[18]。此外實(shí)驗(yàn)還證明了ArgX與轉(zhuǎn)錄因子ArgR擁有相同的靶標(biāo),從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平協(xié)同發(fā)揮作用[18]。在腸桿菌中,CpxP是一種在內(nèi)膜蛋白錯(cuò)誤折疊引起的應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用的蛋白質(zhì),sRNA CpxQ從cpxPmRNA的3′UTR切割下來并依賴Hfq發(fā)揮作用[19]。CpxQ幾乎涵蓋了整個(gè)cpxP3′UTR,該區(qū)域在腸桿菌中極為保守,可以抑制包括Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaB在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)的合成,從而減少應(yīng)激下膜電位的損失[19]。

表1 不同來源sRNA的特點(diǎn)及舉例Table 1 Characteristics and examples of sRNA from different sources

2 sRNA調(diào)控機(jī)制的多樣性

隨著對(duì)sRNA研究的深入,其多種多樣的作用機(jī)制也逐漸被解析出來,以便更好理解這些數(shù)量龐大、簡(jiǎn)單而又復(fù)雜的調(diào)控組分如何發(fā)揮作用。迄今為止發(fā)現(xiàn)的sRNA作用機(jī)制主要包括與靶標(biāo)RNA堿基配對(duì)、與蛋白質(zhì)直接結(jié)合以及編碼小蛋白質(zhì)發(fā)揮雙重功能(圖1)。

2.1 sRNA與靶mRNA堿基配對(duì)

堿基配對(duì)是sRNA最普遍的作用方式,它們通過堿基配對(duì)來激活或抑制靶mRNA的翻譯,或者提高或降低靶mRNA的穩(wěn)定性,來影響基因表達(dá)。

2.1.1 影響靶mRNA與核糖體結(jié)合

sRNA可以通過與Shine-Dalgarno(SD)序列或起始密碼子堿基配對(duì)來隔離靶mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-binding site, RBS),還可以與mRNA的5′UTR或編碼序列(coding sequence, CDS)相互作用來釋放RBS,進(jìn)而影響核糖體的結(jié)合和mRNA翻譯[1]。鼠傷寒沙門氏菌中sRNA RaiZ從編碼核糖體失活蛋白的基因raiA的3′末端衍生而來,可以與編碼HU-α蛋白的hupAmRNA的RBS結(jié)合形成雙鏈,以阻止30S核糖體負(fù)載,抑制其翻譯[27]。而在腸出血性大腸桿菌中,轉(zhuǎn)錄激活蛋白PchA的CDS序列與自身mRNA 5′UTR配對(duì),隔離了RBS,在缺氧條件下,sRNA DicF通過與pchACDS配對(duì)從而釋放RBS,促進(jìn)pchA表達(dá)并增強(qiáng)了有利于定殖宿主的關(guān)鍵毒力因子EHEC Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達(dá)[28]。

2.1.2 影響靶mRNA的穩(wěn)定性

sRNA另一種常見的作用機(jī)制是提高或降低靶mRNA的穩(wěn)定性,具體形式包括促進(jìn)或抑制mRNA的降解、使轉(zhuǎn)錄提前終止從而抑制mRNA合成等等。枯草芽孢桿菌中的sRNA RoxS,能在蘋果酸的存在下通過富C區(qū)結(jié)合在yflSmRNA的5′末端,使其避免被核酸外切酶RNase J1切割,延長(zhǎng)半衰期,同時(shí)增強(qiáng)該mRNA與核糖體的結(jié)合促進(jìn)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YflS的表達(dá)[29]。大腸桿菌的多順反子galETKM操縱子中,sRNA Spot42通過堿基配對(duì)結(jié)合在galT的終止密碼子附近,引起轉(zhuǎn)錄提前終止和核酸內(nèi)切酶RNase Ⅲ或RNase E介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物切割,產(chǎn)生2種長(zhǎng)度不同的galETmRNA[30]。與此同時(shí),Spot 42還會(huì)下調(diào)galK的轉(zhuǎn)錄和翻譯,并促進(jìn)galKMmRNA的降解,這些調(diào)控共同導(dǎo)致了galET的表達(dá)增加和galKM的表達(dá)減少,引起半乳糖代謝的變化從而優(yōu)化大腸桿菌的生長(zhǎng)[30]。類似的sRNA調(diào)節(jié)多順反子差異表達(dá)的現(xiàn)象似乎在細(xì)菌中普遍存在,在多種生命過程中起到重要過渡作用。

2.1.3 其他配對(duì)機(jī)制

革蘭氏陽(yáng)性菌中還有一些不同于上述配對(duì)機(jī)制的調(diào)節(jié)實(shí)例。最近在李斯特菌中發(fā)現(xiàn)prsA2mRNA的5′UTR能與hlymRNA(編碼李斯特菌溶血素O)的3′UTR直接配對(duì),從而防止RNase J1介導(dǎo)的prsA2mRNA的降解,該mRNA-mRNA作用有利于李斯特菌毒力因子的表達(dá)[31]。此外,sRNA與其他sRNA也可以通過直接配對(duì)相互作用。(詳見下文3.4節(jié)內(nèi)容)

2.2 sRNA與蛋白質(zhì)直接結(jié)合

除了在轉(zhuǎn)錄后水平通過堿基配對(duì)調(diào)控靶標(biāo),一些sRNA可以直接結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)揮作用,其中最具有代表性的是6S RNA和CsrB/CsrC。6S RNA最先在大腸桿菌中被鑒定出來,在細(xì)菌中廣泛存在,它通過與RNA聚合酶的全酶形式特異性結(jié)合,下調(diào)許多依賴σ因子的基因轉(zhuǎn)錄,有助于幫助細(xì)菌應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境,缺乏6S RNA還會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活表型造成影響[32-33]。大腸桿菌中CsrA蛋白可以調(diào)節(jié)碳通量、生物膜形成和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因,通常結(jié)合mRNA結(jié)構(gòu)環(huán)內(nèi)的GGA基序影響翻譯或改變靶標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性[34-35]。CsrA的調(diào)節(jié)活性主要被sRNA CsrB和CsrC調(diào)節(jié),它們分別含有22個(gè)和13個(gè)重復(fù)GGA基序,可以作為RNA海綿隔離CsrA使其遠(yuǎn)離靶標(biāo)[34-35]。此外,sRNA McaS也能通過隔離CsrA調(diào)節(jié)其活性[36]。在許多細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了Csr系統(tǒng)或其同源物,如假單胞菌屬中含有Rsm系統(tǒng),以類似的機(jī)制發(fā)揮作用[35]。

2.3 雙功能sRNA編碼小蛋白質(zhì)

sRNA能夠以非編碼RNA形式結(jié)合mRNA發(fā)揮作用,有些sRNA本身還包含小的開放閱讀框(open reading frame,ORF),可以翻譯成小的編碼蛋白發(fā)揮作用,這樣的sRNA稱為雙功能sRNA[37]。雙功能sRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯蛋白2種功能之間可能會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,進(jìn)一步豐富了sRNA介導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

大腸桿菌sRNA AzuR(以前被稱作IsrB)能夠通過堿基配對(duì)抑制cadA和galE的mRNA的表達(dá),同時(shí)它還編碼含有28個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)AzuC,AzuC能與需氧甘油-3-磷酸脫氫酶GlpD相互作用增加其活性[38]。研究發(fā)現(xiàn),AzuR的堿基配對(duì)區(qū)域和AzuC的編碼區(qū)域相重合,這意味著它們之間存在互相干擾和競(jìng)爭(zhēng)[38]。此外,另一個(gè)sRNA FnrS也被證明可以抑制AzuC的翻譯,增加了AzuCR RNA作用的靈活性[38]。在其他研究中,大腸桿菌sRNA SgrS、Spot42以及位于金黃色葡萄球菌毒力調(diào)控中心的sRNA RNAⅢ也被證明具有雙功能屬性[37,39-40]。

a-sRNA通過阻止或促進(jìn)核糖體結(jié)合RBS來抑制或激活翻譯;b-sRNA提高或降低mRNA穩(wěn)定性;c-sRNA通過隔離其他sRNA干擾其活性; d-sRNA通過隔離蛋白降低其活性;e-雙功能sRNA結(jié)合mRNA或編碼小蛋白質(zhì)圖1 sRNA調(diào)控作用機(jī)制示意圖Fig.1 Mechanism of sRNA regulation

3 sRNA與其他組分共同構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

細(xì)菌在面對(duì)環(huán)境壓力和環(huán)境變化時(shí),往往需要同時(shí)對(duì)多種途徑進(jìn)行調(diào)節(jié),涉及一系列靶標(biāo)基因,可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)靶標(biāo)的sRNA在其中發(fā)揮了巨大的作用。在以往的研究中,基因調(diào)控可以通過核糖開關(guān)、轉(zhuǎn)錄因子、雙組分系統(tǒng)等從轉(zhuǎn)錄或其他層面發(fā)揮作用,這些調(diào)控與sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控必然是錯(cuò)綜復(fù)雜交織在一起的,共同形成龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),使細(xì)菌以最優(yōu)效率完成對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。sRNA通過與各個(gè)元件之間的相互影響,在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到重要的紐帶作用。

3.1 sRNA與核糖開關(guān)

核糖開關(guān)是另一類存在于5′UTR的調(diào)控性非編碼RNA,可以通過響應(yīng)代謝物或離子的變化從而改變自身結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[41]。一些sRNA內(nèi)部含有核糖開關(guān),可以從代謝物和轉(zhuǎn)錄后水平同時(shí)調(diào)控靶標(biāo)基因。

糞腸球菌的乙醇胺(ethanolamine, EA)代謝eut基因簇中含有雙組分系統(tǒng)EutVW,其中組氨酸激酶EutW負(fù)責(zé)感知環(huán)境中的EA,并磷酸化轉(zhuǎn)錄因子EutV使其成為具有活性的二聚體形式,隨后EutV通過結(jié)合eutG前終止子附近的雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)來阻止eut轉(zhuǎn)錄終止[42]。sRNA EutX編碼在基因eutT和eutG之間,它內(nèi)部含有一個(gè)響應(yīng)腺苷鈷胺素(adocbl)的核糖開關(guān),還含有可供EutV結(jié)合的另一個(gè)雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)[42]。Adocbl是EA代謝的關(guān)鍵輔因子,當(dāng)沒有Adocbl時(shí),EutX可以反式發(fā)揮作用,通過雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)隔離EutV,使eut轉(zhuǎn)錄提前終止,關(guān)閉下游基因通路;當(dāng)Adocbl存在時(shí),EutX內(nèi)部核糖開關(guān)構(gòu)象的改變使雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)消失,不能隔離EutV,導(dǎo)致eut基因簇多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄通讀,開啟EA代謝(圖2)[42]。這種包含核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)可能是sRNA的數(shù)量不需要過多的變化,核糖開關(guān)的存在使sRNA能通過代謝物來感知環(huán)境的變化,代謝物介導(dǎo)的構(gòu)象改變也更為迅速和直接,使sRNA能更快速地參與到下游基因的調(diào)控中。

3.2 sRNA與雙組分系統(tǒng)

雙組分系統(tǒng)是原核生物適應(yīng)環(huán)境的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),通過協(xié)調(diào)細(xì)菌毒力、運(yùn)動(dòng)、抗生素耐藥性、代謝、形態(tài)分化、應(yīng)激反應(yīng)等各種生物過程,來維持體內(nèi)平衡和各種細(xì)胞功能[43-46]。雙組分系統(tǒng)通常包含2種組分,一個(gè)是稱為組氨酸激酶的傳感器元件,負(fù)責(zé)感知環(huán)境信號(hào);另一個(gè)是稱為響應(yīng)調(diào)節(jié)器的效應(yīng)元件,負(fù)責(zé)根據(jù)信號(hào)產(chǎn)生細(xì)胞響應(yīng)[47]。

雙組分系統(tǒng)中的效應(yīng)器可以通過結(jié)合DNA來調(diào)節(jié)基因的表達(dá),因此也可以促進(jìn)sRNA的產(chǎn)生。例如,大腸桿菌RcsB是FixJ/NarL家族的響應(yīng)調(diào)節(jié)器,磷酸化的RcsB可以同源二聚化并調(diào)節(jié)sRNA基因rprA、osmC和ftsZ的啟動(dòng)子,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的sRNA RprA還可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)調(diào)控因子RpoS,激活一系列靶標(biāo)基因表達(dá)[48]?；魜y弧菌中,雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR是腸道定殖所必需的[49]。研究發(fā)現(xiàn),在高滲透壓和酸脅迫的條件下,OmpR直接與sRNA CoaR的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其表達(dá),CoaR能通過解除TcpI對(duì)菌毛蛋白亞基TcpA的抑制從而促進(jìn)TcpA的表達(dá),增強(qiáng)霍亂弧菌的腸道定殖能力[49]。

圖2 糞腸球菌sRNA EutX調(diào)節(jié)乙醇胺代謝示意圖[42]Fig.2 sRNA EutX regulates ethanolamine metabolism in Enterococcus faecalis[42]

雙組分系統(tǒng)的合成也可以受到sRNA的調(diào)控。大腸桿菌NarP/NarQ雙組分系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)無(wú)氧呼吸基因的表達(dá),研究顯示narPmRNA受到sRNA SdsN137和RprA的抑制[50]。此外,大腸桿菌中的另一個(gè)雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR可以直接激活sRNA OmrA/B的啟動(dòng)子,但同時(shí)envZ-ompRmRNA本身也是OmrA/B的下調(diào)靶標(biāo),它們共同形成了一種負(fù)反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制[51]。sRNA OmrA/B對(duì)envZ-ompR的抑制似乎僅影響OmpR的總量但不影響具有活性的磷酸化OmpR的量,這意味著OmpR調(diào)節(jié)子可能存在著多層次的調(diào)控[51]。

3.3 sRNA與轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是廣為人知的一大類調(diào)控因子,通過識(shí)別目標(biāo)啟動(dòng)子處特定的DNA序列,招募或阻斷RNA聚合酶,從而上調(diào)或下調(diào)該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始[52]。

sRNA的轉(zhuǎn)錄通常受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。例如,正常情況下枯草芽孢桿菌中的sRNA RoxS受到轉(zhuǎn)錄因子Rex的抑制,而在蘋果酸存在時(shí),RoxS會(huì)暫時(shí)擺脫這種抑制,并反式作用于編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的yflSmRNA,增強(qiáng)其表達(dá),促進(jìn)蘋果酸代謝(圖3)[29]。另一個(gè)sRNA RosA也受到轉(zhuǎn)錄因子CcpA的抑制,CcpA是枯草芽孢桿菌中碳代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,通過抑制RosA間接調(diào)控sRNA RoxS,使RoxS可以響應(yīng)不同碳源代謝調(diào)控,發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖3)[53-54]?？梢钥闯?sRNA受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié),可以在轉(zhuǎn)錄后水平擴(kuò)展轉(zhuǎn)錄因子的影響范圍,使相關(guān)基因的調(diào)節(jié)更加全面。

CcpA, Rex-轉(zhuǎn)錄因子;RosA, RoxS-sRNA;ResDE-雙組分系統(tǒng); yflS-編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;ppnkB-編碼NAD激酶; 黑色表示蘋果酸鹽為碳源時(shí)的代謝調(diào)控途徑, 灰色表示阿拉伯糖為碳源時(shí)的代謝調(diào)控途徑。圖3 枯草芽孢桿菌sRNA RoxS調(diào)節(jié)不同碳源 代謝途徑示意圖[29,53-54]Fig.3 sRNA RoxS regulates metabolic pathways of different carbon sources in Bacillus subtilis[29,53-54]

反過來轉(zhuǎn)錄因子也可以作為靶標(biāo)受到sRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。flhDC操縱子編碼轉(zhuǎn)錄因子FlhD4C2,它是大腸桿菌一系列運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的主要激活因子,受到編碼在其對(duì)鏈上的反義sRNA AsflhD的精確調(diào)控,過多或過少的AsflhD都會(huì)抑制其中flhD的翻譯,進(jìn)而影響一系列運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因使細(xì)菌運(yùn)動(dòng)減緩[55]。大腸桿菌RpoS是應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)約500個(gè)基因,它的表達(dá)受到3個(gè)sRNA,ArcZ、DsrA、RprA的轉(zhuǎn)錄后激活,還受到sRNA CyaR的轉(zhuǎn)錄后抑制,涉及多種機(jī)制的聯(lián)合作用[56]。

3.4 sRNA與sRNA

除了研究廣泛的mRNA靶標(biāo),sRNA還可以作為RNA海綿直接作用于其他sRNA,干擾它們的活性和穩(wěn)定性。sRNA-sRNA作用與sRNA-mRNA作用之間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,有助于細(xì)菌對(duì)基因表達(dá)微調(diào)以應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力[56]。

大腸桿菌應(yīng)激調(diào)控因子RpoS既受到sRNA ArcZ、DsrA、RprA的激活,又受到sRNA CyaR的抑制,這其中包含了sRNA ArcZ與CyaR之間的相互作用,ArcZ以一種非全長(zhǎng)的形態(tài)直接與CyaR配對(duì),誘導(dǎo)CyaR被RNase E降解并減輕它對(duì)RpoS的抑制[56]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在乙醇脅迫下,sRNA Zms4和Zms6通過調(diào)控多個(gè)乙醇抗性相關(guān)的靶標(biāo)基因,對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)、乙醇耐受性和產(chǎn)量都有顯著影響[57]。Zms4和Zms6可以不需要Hfq直接結(jié)合,通過競(jìng)爭(zhēng)或結(jié)構(gòu)變化影響與各自靶標(biāo)的結(jié)合,從而精準(zhǔn)調(diào)控代謝途徑以適應(yīng)環(huán)境變化[57]。

sRNA RosA是第一個(gè)在革蘭氏陽(yáng)性菌中經(jīng)證實(shí)的RNA海綿,它通過堿基配對(duì)與至少2個(gè)sRNA,RoxS和FsrA相互作用,其中RosA-RoxS的相互作用不僅影響RoxS的水平,還影響其穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)活性(圖3)[53]。RosA作為RNA海綿在其中主要有2個(gè)作用:一方面是以富G區(qū)域與RoxS中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的富C區(qū)結(jié)合,降低其活性;另一方面RosA還能刺激RoxS 5′莖環(huán)的打開來促進(jìn)其降解,這種作用使RoxS的半衰期大大縮短,使調(diào)控更為迅速和精準(zhǔn)[53]。后來在金黃色葡萄球菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的RNA海綿。一種前噬菌體編碼的sRNA SprY,能夠與金黃色葡萄球菌中的核心毒力調(diào)節(jié)sRNA RNAⅢ進(jìn)行堿基配對(duì),阻止RNAⅢ調(diào)節(jié)其靶標(biāo),從而降低金黃色葡萄球菌的溶血活性和毒力[58]。

3.5 sRNA多靶標(biāo)的調(diào)控順序

sRNA介導(dǎo)的調(diào)控通常都會(huì)有多個(gè)靶標(biāo),一些靶標(biāo)屬于同一代謝途徑可能會(huì)被同時(shí)調(diào)控,但另一些不同作用的靶標(biāo)就涉及到調(diào)控順序的問題,優(yōu)先調(diào)控哪些靶標(biāo)可能取決于細(xì)菌所處環(huán)境的變化。

在中華根瘤菌中,sRNA rnTrpL來源于色氨酸合成基因trpE(G)上游的色氨酸轉(zhuǎn)錄衰減子中,含有一個(gè)小的ORFtrpL,編碼含有14個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽peTrpL[59]。當(dāng)色氨酸充足時(shí),trpL的翻譯會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止,釋放rnTrpL,使其下調(diào)trpDC操縱子,減少色氨酸的生物合成;然而,當(dāng)抗生素四環(huán)素存在時(shí),rnTrpL會(huì)產(chǎn)生與色氨酸無(wú)關(guān)的積累,此時(shí)rnTrpL會(huì)和其他2種分子peTrpL及rplUrpmAmRNA形成抗生素依賴性的核糖核蛋白復(fù)合物,降低編碼核糖體蛋白L21和L27的rplUrpmAmRNA穩(wěn)定性[59]。研究表明,這2種靶標(biāo)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系時(shí),四環(huán)素和peTrpL的存在會(huì)導(dǎo)致sRNA rnTrpL特異性向rplU轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)移,說明在抗生素存在的環(huán)境,sRNA rnTrpL需要優(yōu)先處理與抗生素耐藥性相關(guān)的靶標(biāo)[59]。

4 總結(jié)與展望

sRNA在細(xì)菌的多種生命活動(dòng),尤其是涉及毒力、應(yīng)激反應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境變化的過程中發(fā)揮著重要的作用。然而,sRNA不是單獨(dú)發(fā)揮作用的,它與各個(gè)調(diào)節(jié)模塊間有著不可或缺的緊密聯(lián)系。核糖開關(guān)的存在拓展了sRNA響應(yīng)代謝物和離子的能力;轉(zhuǎn)錄因子和雙組分系統(tǒng)通過激活sRNA的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步拓展了它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控范圍,使相關(guān)基因的控制更為精準(zhǔn)和全面;反過來sRNA也可以作為上游去調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和雙組分系統(tǒng)基因的表達(dá),進(jìn)而引發(fā)更大的調(diào)控鏈;sRNA還可以作為海綿調(diào)節(jié)其他sRNA的活性和穩(wěn)定性。此外,面對(duì)環(huán)境的變化,sRNA的靶標(biāo)和發(fā)揮的作用也會(huì)及時(shí)的調(diào)整,以達(dá)到最優(yōu)效果。

不同調(diào)節(jié)模塊相互聯(lián)結(jié)共同形成了細(xì)菌中龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),增強(qiáng)了細(xì)菌在各種復(fù)雜環(huán)境中的生命力,sRNA在其中發(fā)揮著異常重要的連接和補(bǔ)充作用。通過了解sRNA及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制,有利于輔助我們進(jìn)行代謝路徑的設(shè)計(jì),構(gòu)建更安全、更高效的工程菌株,解決發(fā)酵過程中副產(chǎn)物多、產(chǎn)物抑制等問題,助力發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展。目前對(duì)包括細(xì)菌、酵母等在內(nèi)的工業(yè)微生物的sRNA研究仍然不夠充分,許多發(fā)酵過程中具有顯著表達(dá)差異的sRNA還未被解析,相信在未來,sRNA的研究會(huì)在工程菌的運(yùn)用、致病菌感染治療等方面發(fā)揮更多、更大的作用。