玫瑰香葡萄傷流液生理活性物質(zhì)非靶代謝組學(xué)分析

劉夢迪，朱歡，謝兆森，凌裕平

（揚州大學(xué)，江蘇揚州 225000）

葡萄傷流液（Bleeding）是指在冬末春初時從葡萄枝條傷口流出的汁液，包含根部從土壤中吸收的水、礦質(zhì)元素，根系合成的生物體需要的糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、植物激素等豐富的化學(xué)成分[1-2]，其中含有部分植物組織液、細胞液及韌皮部有機物等。葡萄傷流液含有豐富資源，生產(chǎn)上有將傷流液應(yīng)用于葡萄膨大保果的報道，也有將葡萄傷流液應(yīng)用于保健的報告[3]，但未全面揭示傷流液整體生理活性物質(zhì)組成。

葡萄萌發(fā)前的一個重要時期即傷流期，葡萄在這期間從休眠狀態(tài)向活躍生長期過渡，根壓通常被認為是導(dǎo)致傷流產(chǎn)生的原因，根系生理活動導(dǎo)致的水勢差使得傷流產(chǎn)生。近年來，國外重新關(guān)注傷流的產(chǎn)生與根壓的關(guān)系[4]，相關(guān)研究通過斷層掃描技術(shù)和三維重建分析產(chǎn)生“根壓”的木質(zhì)部導(dǎo)管形態(tài)。目前，國內(nèi)傷流液研究主要集中于傷流液成分藥用價值方向，對傷流液的基本生理活性成分研究還處于基礎(chǔ)階段[5]。本研究通過非靶向代謝組學(xué)手段測定葡萄傷流物質(zhì)含量，非靶向代謝組學(xué)相較普通代謝組學(xué)分析更為全面，詳盡檢測存在的代謝物，從而盡可能多地體現(xiàn)葡萄傷流液總體代謝物信息[6]。

1 試驗?zāi)康?/h2>

通過測定代謝組產(chǎn)物，旨在為學(xué)術(shù)研究傷流液的產(chǎn)生、參與代謝機理、參與生理活動及為相關(guān)生產(chǎn)應(yīng)用（如調(diào)節(jié)生長過程）、活性成分應(yīng)用（內(nèi)源激素）、藥用保健成分生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗樣品。在傷流產(chǎn)生中期，用離心管采集5 棵生長狀況一致的玫瑰香（位于江蘇揚州邵伯湖度假村果園，日光溫室4 年生限根栽培種植，采用“H”形整枝，株行距規(guī)格8m×10m）1 年生枝條流出的傷流液。收集后，立即置于放有干冰的泡沫盒中暫存，盡快送回試驗室，液氮冷凍后，立即放置于-80℃超低溫冰箱保存。

2.1.2 主要試劑。甲醇（Thermo，≥99.0%）、2-氯苯丙氨酸（Aladdin，98.5%）。

2.1.3 主要儀器。液相色譜儀（Thermo U3000）、質(zhì)譜儀（Thermo QE Focus）、真空濃縮儀（eppendorf 5305）。

2.2 方法

2.2.1 代謝物提取。融化樣本，置于4℃條件下，2mL 離心管里加入100μL 樣本、400μL 甲醇（-20℃），通過60s 振蕩，使得樣本和甲醇溶液混合均勻。4℃條件下離心10min（12000rpm），將所有上清液吸取至新的2mL離心管，真空濃縮干燥，加入150μL2-氯苯丙氨酸（4ppm）80%甲醇溶液復(fù)溶，0.22μm 膜過濾上清液，得到待測樣本，重復(fù)5 次。

2.2.2 非靶代謝組測定。由蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司檢測。（1）色譜條件。采用ACQUITY UPLC@HSS T3 1.8 μm（2.1mm×150mm）色譜柱，自動進樣器溫度8℃，流速0.25mL/min，柱溫40℃，進樣2μL 梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5mM 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序為0～1min，2% B/D；1～9min，2%～50% B/D；9～12min，50%～98% B/D；12～13.5min，98% B/D；13.5～14min，98%～2%B/D；14～20min，2%D-正模式（14～17min，2%B-負模式）。（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30arb，輔助氣10arb。毛細管溫度325℃，全掃描分辨率70000，掃描范圍81～1000，并采用HCD 進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV。

2.2.3 物質(zhì)鑒定。先確認代謝物精確分子量（誤差≤30mg/mL），后根據(jù)MS/MS 碎片模式確認注釋獲得代謝物。

3 結(jié)果與分析

3.1 玫瑰香葡萄傷流液主要代謝物（見表1）

表1 玫瑰香葡萄傷流液主要代謝物

3.2 玫瑰香葡萄傷流液代謝物涉及的代謝通路

由圖1 可知，玫瑰香葡萄傷流液中148 個代謝物定位到34 條通路上，75 個代謝物未能找到相應(yīng)的代謝通路。以三羧酸循環(huán)為骨架，涉及的代謝通路有：醣酵解/糖異生、抗壞血酸和苦杏仁代謝、戊糖和葡萄糖醛酸鹽互變、果糖和甘露糖代謝、酪氨酸代謝、嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、類黃酮生物合成、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝等。較多物質(zhì)在戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉(zhuǎn)化，酪氨酸代謝、果糖與甘露糖代謝3 條代謝通路上檢測到，還有一些代謝物，如2-丁酮酸、木質(zhì)酸等參與多條代謝。

圖1 玫瑰香葡萄傷流液簡化代謝通路網(wǎng)絡(luò)

4 討論

在內(nèi)外因素作用下，植物最終通過基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達形成代謝產(chǎn)物，這是生物表型的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，代謝物可以對基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達和活性產(chǎn)生反作用。作為一類固著性生物，植物可產(chǎn)生總數(shù)在20 萬～100 萬種的代謝產(chǎn)物[7]。經(jīng)非靶代謝檢測發(fā)現(xiàn)，玫瑰香葡萄傷流液的代謝物主要由三部分組成，即初生代謝物、次生代謝物和其他非植物有機體。

（1）傷流液中初生代謝物主要為糖類、脂質(zhì)、氨基酸類、核苷酸及三羧酸循環(huán)中間的有機酸等。構(gòu)成蛋白的20 種氨基酸共檢測出14 種，分別為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、絡(luò)氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸；核酸檢測出包括胞嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷兩種脫氧核糖核酸、尿嘧啶核苷一種核糖核酸；有機酸包括三羧酸循環(huán)中的系列——檸檬酸、酮戊二酸、草酸、延胡索酸、蘋果酸，無氧呼吸產(chǎn)生的乳酸，合成芳香族氨基酸和其他多種芳香族化合物的起始物質(zhì)莽草酸及糖酵解產(chǎn)物丙酮酸等。通過KEGG 查找初生代謝物的分布情況，發(fā)現(xiàn)集中于糖類、多種氨基酸和核酸代謝途徑，初生代謝物是生長發(fā)育及后續(xù)生理活動所必須的。玫瑰香葡萄傷流液檢測結(jié)果能一定程度反應(yīng)葡萄傷流期間樹體生理活動和為發(fā)芽做的準備，糖類、氨基酸和脂質(zhì)等初生代謝物積累和活躍，這些大多來自根系，表明發(fā)育開始之前，根系為供應(yīng)地上部分所需的含氮化合物與碳水化物已進行許多轉(zhuǎn)化和合成作用的代謝活動。尿嘧啶核苷的檢出從側(cè)面反映傷流液中存在與RNA 相關(guān)的核酸生理活動，這與鄭婷等[8]研究結(jié)果一致，木質(zhì)部樹液在傷流期間承擔著傳遞遺傳信息的功能。

（2）葡萄傷流液中種類最豐富的是次生代謝物，通過KEGG 定位次生代謝物所在通路，發(fā)現(xiàn)主要來源于各種氨基酸代謝轉(zhuǎn)化，而次生代謝物主要參與植物的信號傳導(dǎo)、植物與環(huán)境的互作及植物防御等[9]。傷流液次生代謝物按照生物合成的起始分子和功能，包含維生素、生長類物質(zhì)、苯丙烷類、有機酸和生物堿等，這些物質(zhì)之前較少有文獻報道。檢測出的生物堿有甜菜堿、膽堿和煙堿，甜菜堿是由膽堿和甘氨酸合成，是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)滲透壓的重要緩沖物質(zhì)，在逆境中具有保護細胞膜的功能；γ-氨基丁酸（GABA）由谷氨酸脫羧酶催化形成，能通過調(diào)控植物的抗氧化防御系統(tǒng)來緩解逆境脅迫；生長類物質(zhì)包括生長素、油菜素內(nèi)酯、兒茶酚胺和水楊酸等，這些物質(zhì)均能提高植物逆境抗性。另外，苯丙烷代謝物質(zhì)對于果實成熟至關(guān)重要，能夠調(diào)控多項關(guān)于葡萄轉(zhuǎn)色基因；尸胺、亞精胺、腐胺等多胺參與植物體內(nèi)DNA 和蛋白質(zhì)的生物合成及RNA 翻譯；吲哚乙酸、吲哚乙腈等生長素已證實，在西瓜膨大方面發(fā)揮著一定作用。這些植物激素對果實的發(fā)育和膨大均能起到積極作用，一定程度解釋了用傷流液來代替人工激素處理果實，可以使其膨大的原理，這項技術(shù)的應(yīng)用相較于傳統(tǒng)的激素噴施更綠色、環(huán)保，也能減少植物傷流期的營養(yǎng)浪費。

（3）玫瑰香傷流液中其他非植物有機體的成分，如二甲基砜、三氟醋酸，來自自然土壤與地下水，進一步表明傷流與根系吸收的木質(zhì)部徑流有關(guān)。

（4）玫瑰香葡萄傷流液中的一些物質(zhì)目前已證實有一定藥用價值，如煙酰胺核苷酸廣泛參與人體多項生化反應(yīng)，與免疫、代謝息息相關(guān)，能夠延緩、改善、防止衰老；甘草查耳酮A 具有抗炎、抗腫瘤、抗微生物、抗HIV、抗過敏等多種作用[10]；肌醇可幫助降低膽固醇，促進細胞新陳代謝[11]。

5 結(jié)論

通過對玫瑰香葡萄傷流液進行非靶代謝鑒定，發(fā)現(xiàn)其含有豐富的初生代謝物、次生代謝物、其他非植物有機體。在前人研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，檢測出之前沒有報道過的新物質(zhì)。通過KEGG 查找代謝物的分布情況，發(fā)現(xiàn)初生代謝物集中在糖類、多種氨基酸和核酸代謝途徑，次生代謝物主要來源于各種氨基酸代謝轉(zhuǎn)化。分析這些物質(zhì)的來源和功能推測，傷流液不僅承擔著運輸養(yǎng)分和遺傳信息的功能，而且要抵御逆境脅迫帶來的威脅。

傷流在以往的文獻報道中，已展現(xiàn)出較強的抗羥自由基能力和熱穩(wěn)定性[12]。本研究在此基礎(chǔ)上，進一步加深對傷流液成分的探究，分析葡萄傷流中的活性物質(zhì)與經(jīng)濟物質(zhì)，既能為研究葡萄傷流和傷流期后期的萌芽機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，又能為生產(chǎn)上傷流液運用于果實品質(zhì)的提升機理進行研究。同時發(fā)現(xiàn)傷流液中的一些物質(zhì)具有保健和美容功效，可為將來葡萄傷流液的保健品開發(fā)提供新思路。