scFv-DEC205-Trap重組包涵體靶向抗原復(fù)性及過程的優(yōu)化①

佟春玉 張喆林 王森 鄭小會 韓玉芳 崔玉東 宋博翠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163000）

金黃色葡萄球菌已經(jīng)成為全世界人類細菌疾病的罪魁禍首之一。金黃色葡萄球菌亞單位疫苗的研發(fā)主要從其致病性的毒力因子為出發(fā)點，本實驗選取的是金黃色葡萄球菌靶向RNAⅢ激活蛋白（target of RNAⅢactivating protein，TRAP）蛋白［1］。TRAP是一種膜相關(guān)的167個氨基酸所組成的蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，在金黃色葡萄球菌中高度保守，且為金黃色葡萄球菌所特有［2］。金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生是通過組氨酸磷酸化TRAP的靶點和激活A(yù)GR基因位點來調(diào)節(jié)的。RNAⅢ激活蛋白（RAP）的磷酸化導(dǎo)致agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的激活，從而產(chǎn)生一種稱為RNAⅢ的調(diào)節(jié)性mRNA分子，并導(dǎo)致毒素的產(chǎn)生。因此，TRAP蛋白在金黃色葡萄球菌毒力致病性方面占據(jù)著極其重要的地位，在所有菌株中都是保守的，可作為葡萄球菌疫苗候選抗原。

雖然體液免疫是抵御金黃色葡萄球菌感染的重要措施，但這種抗體反應(yīng)不足以清除細菌或減少炎癥反應(yīng)，因此金黃色葡萄球菌疫苗要在體液免疫基礎(chǔ)上引起足夠強的細胞免疫才能抵御金黃色葡萄球菌的侵染，而樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是能專職激活細胞免疫的抗原提呈細胞。DC是哺乳動物體內(nèi)最強的抗原提呈細胞，唯一可以激活初始T細胞的抗原提呈細胞，將疫苗靶向到DC成為近年的研究熱點。DEC205是上個世紀末SWIGGARD等在小鼠樹突細胞表面發(fā)現(xiàn)的［3］。DEC205為C型凝集素受體，具有高效靶向性，能準確高效且特異地靶向提呈抗原。

重組表達系統(tǒng)主要包括真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng)相對于真核系統(tǒng)來說操作更加簡單，表達量更高，適用于無修飾的蛋白。因此，大腸桿菌表達系統(tǒng)常常作為實驗的首選，具有異源表達量高、基因組清楚、周期短、抗感染能力強、遺傳背景清楚等優(yōu)點［4］。但蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達系統(tǒng)中快速、大量表達時常形成包涵體，包涵體大小50～500 nm，形狀不固定，只溶一些鹽酸胍、尿素等變性劑。包涵體形成過程中蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序是正確無誤的，但進行空間折疊形成高級結(jié)構(gòu)過程中出現(xiàn)錯誤，所以沒有生物活性。包涵體一般含有一半以上的重組蛋白，其余為RNA聚合酶、核糖體元件、外膜蛋白、質(zhì)粒DNA等雜質(zhì)。所以在包涵體進行溶解前一般需要對包涵體進行洗滌處理，目的是除去大多數(shù)的雜質(zhì)，方便后續(xù)復(fù)性步驟［5-6］。包涵體在溶解的過程中高級結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而失去了生物活性，因此對重組蛋白進行復(fù)性操作成為重中之重。復(fù)性過程主要是變性的蛋白重新折疊的過程，但是在這個過程中會發(fā)生錯誤折疊和聚集等現(xiàn)象。傳統(tǒng)的蛋白復(fù)性方法主要包括稀釋復(fù)性法、透析復(fù)性法、超濾復(fù)性法，近幾年來柱層析復(fù)性法、低分子添加物輔助復(fù)性法和分子伴侶輔助復(fù)性法等成為研究熱點［7-8］。稀釋復(fù)性法的優(yōu)點是簡單、可使還原劑及變性劑下降到一定濃度、復(fù)性蛋白易于后續(xù)檢測。缺點是需要大量的復(fù)性緩沖液、生產(chǎn)成本高、不利于工業(yè)化生產(chǎn)［9］。透析復(fù)性法優(yōu)點是不需要增加溶液的體積，缺點是實驗時間長、容易形成沉淀、不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。超濾復(fù)性的優(yōu)點是復(fù)性速度快，缺點只適合小量的樣品，會在處理過程中出現(xiàn)不可逆的變性風(fēng)險。低分子添加物輔助復(fù)性法和分子伴侶輔助復(fù)性法優(yōu)點是操作簡便、成本低以及復(fù)性率極高。低分子添加物輔助復(fù)性法中的添加物主要分為兩種類型：一類是折疊助劑，包括硫酸銨鹽、精氨酸等，功能是增加分子間的相互作用和穩(wěn)定蛋白的天然構(gòu)象；二類是聚集抑制劑，主要包括一些變形劑如鹽酸胍和尿素、表面活性劑如吐溫（Tween）、SDS等，功能是減弱分子內(nèi)疏水作用抑制聚集的發(fā)生。Tween比PEG4000和PEG6000抑制蛋白聚集作用更強。L-精氨酸可提高蛋白復(fù)性效率［10］。陽離子表面活性劑和β-環(huán)糊精有助于蛋白折疊［11］。

為解決金黃色葡萄球菌免疫問題，實驗構(gòu)建了由靶向樹突狀細胞的DEC205單鏈抗體（scFv-DEC205）和金黃色葡萄球菌抗原Trap的靶向疫苗候選體重組抗原scFv-DEC205-Trap，但其誘導(dǎo)表達后主要以不可溶的包涵體形式存在，由于包涵體復(fù)性折疊的機制目前尚不清楚，體外復(fù)性率極低，如何從所形成的包涵體中提取、復(fù)性scFv-DEC205-Trap蛋白并保持良好的抗原性和靶向性，是本文要解決的問題。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒金黃色葡萄球菌Newman株由八一農(nóng)大生命學(xué)院實驗室儲存，重組菌株BL21（DE3）/pET-32a/scFVDEC205-TRAP質(zhì)粒均由上海生工合成。

1.1.2主要實驗試劑SacⅠ、HindⅢ、Cutsmart Buffer購自BioLab?公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；DL 5000 DNA Marker購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自Coolaber公司；瓊脂糖、LB固體與液體培養(yǎng)基購自青島海博生物有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠IgG/辣椒根酶標記購自天根生化科技（北京）有限公司；Tris-HCl、Tris、NaCl、尿素、EDTA、吐溫80、甘油、PEG 6000、PEG 8000、TritonX-100、精氨酸購自納川生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1BL21（DE3）/pET-32a/scFv-DEC205-Trap菌株鑒定

1.2.1.1質(zhì)粒的提取與雙酶切鑒定從-80℃冰箱中取出BL21（DE3）/pET-32a/scFv-DEC205-Trap菌株（由上海生工合成），放入冰盒中融化至液體，進行菌種的復(fù)蘇實驗。首先在超凈工作臺中將提前滅菌的含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進行倒板，待固體培養(yǎng)基凝固后，輕輕挑取菌株進行劃線處理，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，12 h后挑取長勢良好的單菌落，接種于3 ml含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min振蕩搖床搖12 h，然后吸取2 ml菌液提取基因質(zhì)粒。根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒配套方案進行質(zhì)粒提取，提取后的質(zhì)粒使用Nanodrop2000/2000C分光光度計測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式計算出質(zhì)粒加入量，采用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進行單酶切，SacⅠ和HindⅢ雙酶切（酶切體系：SacⅠ1 μl，HindⅢ1 μl，重組質(zhì)粒8 μl，Cutsmart Buffer 2 μl，ddH2O 8 μl）37℃水浴30 min，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，觀察實驗結(jié)果。

1.2.1.2基因測序?qū)﹄p酶切鑒定正確的菌株送往吉林省庫美有限公司進行測序，測得序列與已發(fā)表序列進行比對（圖1），并將鑒定無誤的菌株擴大培養(yǎng)，冷凍保存。

圖1 重組蛋白表達載體質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic diagram of fusion protein expression vector plasmid

1.2.1.3SDS-Page鑒定將活化的BL21（DE3）/pET-32a/scFv-DEC205-Trap重組菌以1∶100比例接種至Amp+抗性LB液體培養(yǎng)基，在37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)，直至菌液OD600nm值在0.6～0.8之間。加終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達4 h后，吸取1 ml菌液，8 000 r/min離心10 min，棄上清，加入40 μl無菌ddH2O重懸沉淀，再加5×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）10 μl，渦旋混勻后，100℃沸水浴10 min，冷卻至室溫，取5 μl樣品進行SDS-PAGE分析。首先組裝儀器進行驗漏，配置分離膠，等待30 min后配置濃縮膠并插梳子，靜置30 min后點樣，首先80 V恒壓電泳至樣品進入分離膠層，調(diào)節(jié)電壓至120 V，直至溴酚藍到達分離膠底部終止電泳。進行切膠后小心取下凝膠放入考馬斯藍R-250染色液中染色20 min，在脫色液中進行脫色，直到條帶清晰可見，進行拍照。

1.2.2scFv-DEC205-Trap誘導(dǎo)表達將活化的重組菌株scFv-DEC205-Trap以1∶100接種至Amp+抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃，180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，直至菌液OD600為0.6～0.8，停止培養(yǎng)。加終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達4 h，4℃8 000 r/min離心10 min收集菌體，用緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，100 mmol/L NaCl）洗滌菌體2次，然后用溶液（50 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，100 mmol/L NaCl，1%Triton X-100）重懸菌體（溶液與菌液比例約為20 ml∶200 ml），冰浴超聲破碎菌體15 min（功率：150 W，破碎/間隔時間為：5 s/5 s）。

1.2.3scFv-DEC205-Trap包涵體沉降將超聲波破碎后的混懸液用渦旋機渦旋混勻后，取4管（每管200 μl）混懸液，分別以100 g、400 g、900 g、6 200 g離心3 min，然后取沉淀和上清，進行SDS-PAGE電泳。

1.2.4scFv-DEC205-Trap包涵體洗滌選取最優(yōu)離心條件離心后的包涵體，分別用洗滌液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，100 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100，2 mol/L尿素）、洗滌液Ⅱ（100 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，300 mmol/L NaCl，3%Triton X-100）各洗滌1次，洗滌時需在4℃冷凍搖床上振搖30 min，收集大量的scFv-DEC205-Trap離心沉淀物。

1.2.5scFv-DEC205-Trap包涵體溶解探索影響scFv-DEC205-Trap包涵體溶解的4個條件包括溶解溶液、溶解溫度、溶解時間以及是否振蕩進行單因素優(yōu)化，設(shè)計詳見表1。

表1 溶解條件優(yōu)化表Tab.1 Optimization of dissolved conditions

取4管洗滌后的包涵體混懸液，每管200 μl，8 000 r/min離心10 min，棄盡上清，稱取每管包涵體重量，按照1 g濕重包涵體中加入20 ml溶解液的比例分別加入2、4、6、8 mol/L的尿素溶液，室溫條件下，100 r/min振蕩0.5 h溶解包涵體，離心后取上清進行SDS-PAGE檢測；同樣方法取4管包涵體混懸液，用最優(yōu)尿素溶解溶液A，分別在4℃、20℃、30℃、40℃條件下，100 r/min振蕩0.5 h溶解包涵體，離心后取上清SDS-PAGE檢測；再取4管包涵體混懸液，用最優(yōu)的尿素溶液A和溫度B，100 r/min分別振蕩0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、12 h，5個時間溶解包涵體，離心后取上清SDS-PAGE檢測；取2管包涵體混懸液，用優(yōu)化后的A、B、C條件，分別以100 r/min振蕩、靜置溶解包涵體，離心后取上清SDS-PAGE檢測（每組實驗重復(fù)3次）。

1.2.6scFv-DEC205-Trap包涵體復(fù)性100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）緩沖液中分別加入復(fù)性添加劑0.3 mol/L精氨酸、10%甘油、0.2%吐溫80、5%PEG 6000、5%PEG 8000（表2），作為包涵體復(fù)性緩沖液，每種緩沖液分別以25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1的比例稀釋包涵體溶解液，4℃振蕩24 h，8 000 r/min離心3 min，采用酶標儀測定上清蛋白濃度，同時進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，每組實驗重復(fù)3次，選擇效果最佳的復(fù)性添加劑。

表2 不同添加劑的scFv-DEC205-Trap包涵體復(fù)性緩沖液Tab.2 Buffer with different additives for renaturation of scFv-DEC205-Trap inclusion bodies

1.2.7Western blot鑒定復(fù)性后的scFv-DEC205-Trap聚丙烯酰胺凝膠電泳，115 mA恒流跑1.5 h后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）膜上，觀察Marker是否轉(zhuǎn)移成功，如果轉(zhuǎn)移成功，用ddH2O水沖洗NC膜，并將NC膜放入5%脫脂乳中37℃密封1 h；棄掉密封液，加入適量PBST溶液振蕩洗滌4次，15 min/次；棄盡PBST溶液，按1∶5 000比例稀釋scFv-DEC205-Trap小鼠免疫后血清作為一抗溶液，室溫孵育1 h；棄盡一抗溶液。重復(fù)上述一抗步驟，按1∶5 000比例稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG二抗溶液，室溫孵育1 h后；棄盡二抗溶液。取出NC膜用ddH2O沖洗干凈，使用ECL顯色液顯色，觀察并記錄實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果對合成的含有scFv-DEC205-Trap目的基因的重組質(zhì)粒進行提取，使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進行單酶切和SacⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示：scFv-DEC205-Trap質(zhì)粒在1 248 bp處可見清晰條帶，同時雙酶切之后條帶與空載體條帶大小相同，說明scFv-DEC205-Trap原核表達載體構(gòu)建成功。

圖2 scFv-DEC205-Trap質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of scFv-DEC205-Trap plasmid by restriction enzyme digestion

2.2靶向重組蛋白的可溶性檢測結(jié)果將質(zhì)粒鑒定結(jié)果正確的scFv-DEC205-Trap用IPTG誘導(dǎo)后，為了盡量得到更多的蛋白，對菌液進行超聲波破碎，再對超聲波的沉淀與上清液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖3所示：scFv-DEC205-Trap蛋白在67 kD處的沉淀中的蛋白條帶明顯多于上清液，說明scFv-DEC205-Trap蛋白主要為不可溶蛋白。

圖3 scFv-DEC205-Trap蛋白可溶性檢測結(jié)果Fig.3 Soluble detection of scFv-DEC205-Trap protein

2.3scFv-DEC205-Trap包涵體沉降結(jié)果 經(jīng)誘導(dǎo)表達后的scFv-DEC205-Trap菌株，分別以100 g、400 g、900 g、6 200 g離心力來沉淀菌體，再進行超聲波破碎，之后采取聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。結(jié)果顯示：scFv-DEC205-Trap菌株經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達，且主要以不可溶性的包涵體形式存在，凝膠電泳結(jié)果顯示在離心力大于400 g離心3 min以上，96%的包涵體蛋白可以沉淀下來（圖4）。

圖4 scFv-DEC205-Trap包涵體沉降結(jié)果Fig.4 scFv-DEC205-Trap settlement results of inclusion body

2.4scFv-DEC205-Trap包涵體溶解結(jié)果用含2、4、6、8 mol/L 4個梯度的尿素溶液溶解包涵體，離心后取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果顯示，4個梯度的尿素溶液溶解效果呈不斷上升趨勢，所以含8 mol/L的尿素溶液溶解效果最佳（圖5A）；以4℃、20℃、30℃、40℃4個溫度溶解包涵體，結(jié)果顯示，在4～40℃的溫度范圍內(nèi)包涵體溶解效果大致相同，所以在4～40℃溫度范圍內(nèi)均可使包涵體溶解（圖5B）；以0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、12 h不同時間溶解包涵體，結(jié)果顯示，0.5 h以上即可使包涵體溶解，但12 h溶解的效果最佳（圖5C）；100 r/min振蕩、靜置溶解包涵體，結(jié)果顯示，振蕩、靜置對包涵體溶解無影響（圖5D）。綜上所述，本實驗的最優(yōu)選擇是8 mol/L尿素溶液，室溫條件下，振蕩后靜置0.5 h溶解scFv-DEC205-Trap包涵體效果最好。

2.5scFv-DEC205-Trap包涵體復(fù)性結(jié)果分別以25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1比例在不同復(fù)性添加劑中稀釋包涵體變性液，經(jīng)過酶標儀濃度測定結(jié)果顯示（圖6）：精氨酸復(fù)性添加劑緩沖液5倍稀釋包涵體變性液，復(fù)性率高于其他組；復(fù)性添加劑PEG6000/8000復(fù)性率低于其他組；同時取5倍稀釋的復(fù)性添加劑進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進一步證明了上述結(jié)論。綜上，選擇0.3 mol/L精氨酸的100 mmol/L Tris-HCl緩沖液5倍稀釋包涵體變性液復(fù)性效果最好。

圖6 包涵體復(fù)性結(jié)果Fig.6 Inclusion body renaturation

2.6復(fù)性后scFv-DEC205-Trap蛋白免疫原性驗證將純化后的蛋白進行Western blot分析，以驗證重組蛋白在復(fù)性后的免疫原性，結(jié)果蛋白分別在67 kD處出現(xiàn)明顯可見的單一條帶，如圖7，與預(yù)期相符，說明重組蛋白復(fù)性成功且免疫原性良好。

圖7 Western blot結(jié)果Fig.7 Western blot result

3 討論

本實驗將TRAP蛋白基因與scFv-DEC205基因片段進行連接，構(gòu)建Trap-scFv-DEC205重組基因表達載體，通過IPTG誘導(dǎo)表達后，成功表達出scFv-DEC205-Trap重 組 蛋 白。scFv-DEC205-Trap大 部 分表達蛋白以不可溶的包涵體形式而存在。實驗對scFv-DEC205-Trap重組包涵體蛋白沉降條件、重組包涵體蛋白溶解的最佳條件以及包涵體復(fù)性條件和復(fù)性方法等進行研究。結(jié)果顯示，在離心速度大于400 g，離心時間3 min以上96%的包涵體蛋白就會發(fā)生沉降；含8 mol/L的尿素溶解液在4～40℃的搖床培養(yǎng)0.5 h以上包涵體蛋白就可達到充分溶解。用不同添加劑緩沖液5倍稀釋復(fù)性包涵體蛋白，緩沖液pH=8.0復(fù)性最合適，0.3 mol/L精氨酸的100 mmol/L Tris-HCl緩沖液5倍稀釋包涵體變性液復(fù)性效果最好。

本實驗探討不同的離心力對包涵體沉降的影響，結(jié)果顯示較小的離心力可使96%的包涵體蛋白沉降，說明包涵體蛋白的密度比較大，利用差速離心法不能去除像細胞碎片這類的雜質(zhì)。因此，本實驗采取包涵體洗滌處理，隨著洗滌次數(shù)的增加，目的蛋白含量不斷減少，而雜蛋白并未明顯減少，這說明了在異源的表達過程中，不僅目的蛋白以包涵體的形式存在，雜蛋白也會以包涵體的形式存在，而且通過實驗證明采取洗滌方法不能去除雜蛋白。實驗探討包涵體溶解實驗中，溶解溫度，溶解時間，溶解過程中是否振蕩對溶解的效果并無影響，經(jīng)分析得到的可能結(jié)論是scFv-DEC205-Trap包涵體蛋白在實驗設(shè)計的溶解條件下就已達到了溶解能力的上限。為了節(jié)約成本，快速簡便地獲得包涵體蛋白，本實驗采用低分子添加物和分子伴侶輔助稀釋復(fù)性法復(fù)性包涵體蛋白。分別以100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）緩沖液為對照，并向其中分別加入復(fù)性添加劑0.3 mol/L精氨酸、10%甘油、0.2%吐溫80、5%PEG6000和5%PEG8000，并以不同的比例稀釋復(fù)性緩沖液。其中精氨酸和甘油的作用是促進復(fù)性中間體向自然態(tài)折疊；吐溫80和PEG是聚集抑制劑，抑制復(fù)性中間體的聚集。從促進中間體向自然態(tài)折疊和抑制中間體向聚集態(tài)折疊兩個不同角度來探索不同小分子復(fù)性添加劑對復(fù)性的影響。結(jié)果表明：在復(fù)性緩沖溶液中添加0.3 mol/L精氨酸的復(fù)性率效果最好，這與余秀娟團隊研究［10］的結(jié)果一致。PEG復(fù)性緩沖液復(fù)性率低于不添加任何物質(zhì)緩沖液復(fù)性率，可能原因是PEG存在占位效應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)自我形成沉淀。