樹鼩用于構(gòu)建自身免疫性疾病動物模型展望①

曾雯 雷玲 趙鋮（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南寧 530021）

樹鼩（tupaia belangeri，tree shrew）是一種生活在東南亞、中國華南、西南地區(qū)的哺乳綱攀鼩類小型動物，形似松鼠。中國樹鼩基因組數(shù)據(jù)庫（www.treeshrewdb.org）闡明了樹鼩的基本生物學(xué)特性，其高質(zhì)量的樹鼩基因組解析與人類基因組對比發(fā)現(xiàn)，樹鼩有28個(gè)基因組是靈長類動物特有的，且這些基因在樹鼩與人類的多種疾病的發(fā)病機(jī)制中存在高度的一致性［1］。世界衛(wèi)生組織推薦在動物試驗(yàn)中選用樹鼩替代靈長類動物進(jìn)行人類疾病研究［1］。樹鼩的資源開發(fā)研究已被納入國家“十一五”“十二五”科技支撐計(jì)劃。樹鼩已成功用于病毒性肝炎、流行性感冒、視覺疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的動物模型建立以及研究，但在自身免疫性疾病中少見應(yīng)用。

基礎(chǔ)研究已建立多種自身免疫疾病動物模型，包括自發(fā)型、誘導(dǎo)型和基因工程動物模型。目前多采用嚙齒類動物模型，但其與人類的親源性相差甚遠(yuǎn)，在生理學(xué)和免疫學(xué)上與人類有較大差異，不能復(fù)制人類疾病的組織學(xué)、免疫學(xué)特點(diǎn)的全貌。樹鼩具有與人類更相似的遺傳學(xué)、生物學(xué)特性，是有巨大開發(fā)前景的自身免疫疾病試驗(yàn)動物。本文就樹鼩的基因、組織學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，探討樹鼩用于建立自身免疫疾病動物模型的優(yōu)勢及挑戰(zhàn)。

1 免疫分子

1.1主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）樹鼩MHC的基因序列與人類高度保守，與小鼠相比，MHCⅠ類基因數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹更接近［2-3］。樹鼩的一類MHCⅠ基因位于人類白細(xì)胞抗原A（human leukocyte antigen，HLA-A）區(qū)，與人類基因座具有良好的同源性，樹鼩MHCⅡ類區(qū)域包含所有人類Ⅱ類基因同源體，包括經(jīng)典Ⅱ類基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR，以及非經(jīng)典Ⅱ類基因HLA-DM、HLA-DO，樹鼩的Ⅲ類區(qū)域與人類基因序列高度保守［3］。NKG2D配體家族由MHCⅠ和自然殺傷細(xì)胞活化性配體UL16結(jié)合蛋白（UL16-binding proteins，ULBPs）組成，小鼠和人類的配體家族組成不同，而 樹 鼩與人類NKG2D配體家族 相 似［4-5］。MHC和HLA參與多種自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制，其中包括：HLA-DR15、HLADR1分別是Goodpasture病的易感等位基因和保護(hù)性等位基因，HLA-DR15和HLA-DR4是多發(fā)性硬化的易感等位基因等［6-8］。樹鼩與人類的MHC、HLA基因同源性遠(yuǎn)高于小鼠，使用樹鼩建立自身免疫疾病模型，可能更容易得到與人類發(fā)病特點(diǎn)更相似的結(jié)果。

1.2細(xì)胞因子

1.2.1趨化因子自身免疫疾病的趨化因子相關(guān)研究日趨增長。樹鼩的趨化因子配體12（chemokine ligand 12，CXCL12）蛋白與人和猴CXCL12氨基酸序列的同源性高達(dá)94.4%。樹鼩的趨化性細(xì)胞因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白與人和猴子的CXCR4蛋白的相似性高達(dá)97%，而小鼠和大鼠的CXCR4蛋白與人和猴子的相似性分別為91%和92%。研究發(fā)現(xiàn)：重組人CXCL12蛋白在體外直接促進(jìn)了樹鼩淋巴細(xì)胞的遷移［9］。樹鼩和人類之間的CXCL8和CXCR12的結(jié)合域高度保守，且人CXCL8蛋白可誘導(dǎo)由樹鼩CXCR12表達(dá)的外周血單核細(xì)胞遷移，使用變構(gòu)拮抗劑（瑞帕霉素和SB265610）阻斷人CXCL8和樹鼩CXCR12相互作用后，樹鼩外周血單核細(xì)胞遷移顯著降低［10］。樹鼩的多個(gè)趨化因子與人類存在跨物種交叉免疫反應(yīng)，樹鼩趨化因子可能發(fā)揮與人類相同或相似的作用。而研究顯示人與小鼠之間CXCL1和CXCL10等多個(gè)趨化因子沒有交叉反應(yīng)，尚未檢索到人與小鼠、大鼠之間趨化因子跨物種交叉免疫反應(yīng)的報(bào)道［11］。

1.2.2銀屑病素蛋白樹鼩與人的基因組中大部分序列高度保守，樹鼩基因組中有28個(gè)基因?yàn)殪`長類動物特征，其中包括銀屑病素蛋白（psoriasin protein）編碼基因，但該基因嚙齒類動物并不具備［3］。在銀屑病患者角化細(xì)胞中大量表達(dá)，銀屑病素涉及多種細(xì)胞內(nèi)外功能，包括免疫應(yīng)答、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化及凋亡、細(xì)胞趨化、蛋白質(zhì)磷酸化、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子等，是皮膚屏障的重要組成部分［12-14］。

1.2.3白細(xì)胞介素（interleukin，IL）研究顯示樹鼩的多個(gè)IL基因、氨基氮與人類的同源性均遠(yuǎn)高于小鼠、大鼠，包括IL-21、IL-6、IL-2等［15-17］。

樹鼩的IL-21與人類IL-21核苷酸序列的比對率為83.33%，氨基酸序列的比對率為69.93%。樹鼩IL-21的二級結(jié)構(gòu)、疏水性和表面電荷也與人類IL-21相似。樹鼩IL-21與人類IL-21具有高度的同源性、結(jié)構(gòu)相似性和免疫交叉反應(yīng)性［16］。IL-21R中和抗體已成為多種自身免疫疾病的潛在治療方法，并在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者開展ⅠB期臨床試驗(yàn)［18］；人類和嚙齒動物IL-21的同源性較低（61%～65%），不能產(chǎn)生跨物種交叉免疫反應(yīng)。目前多采用雜交瘤細(xì)胞系方法制造IL-21中和抗體，使用基因工程改造的人源化小鼠生產(chǎn)，但該方法通常面臨人源化小鼠體內(nèi)IL-21R對靶抗原的親和力降低、抗體濃度低下挑戰(zhàn)，且人源化小鼠成本較高［19］。樹鼩可給IL-21中和抗體的研發(fā)和制備提供新的思路。

氨基酸序列分析顯示，人IL-6氨基酸序列與樹鼩的相似度高于大鼠和小鼠，且樹鼩受體蛋白中完全保留了對IL-6受體結(jié)合至關(guān)重要的殘基；樹鼩25個(gè)氨基酸的信號肽和一個(gè)IL-6超家族結(jié)構(gòu)域與人IL-6的蛋白特征相符，蛋白質(zhì)建模提示樹鼩與人的IL-6結(jié)構(gòu)具有高度同源性［17］。抗IL-6R抗體治療克羅恩病、強(qiáng)直性脊柱炎的臨床試驗(yàn)結(jié)果不如小鼠動物試驗(yàn)效果顯著，可能是與IL-6基因、氨基酸及功能差異相關(guān)［20］。

1.3Toll樣受體樹鼩天然免疫識別受體Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）1～9蛋白組成結(jié)構(gòu)與人類TLRs在親緣上很近，高于嚙齒類動物與人的親緣性，尤其是對TLR8的深入研究發(fā)現(xiàn)樹鼩TLR8的功能與人相同，能識別人TLR8的配體R848，并受其刺激而上調(diào)表達(dá)水平［21-22］。而小鼠TLR8無此功能［23］。許多TLR參與多種自身免疫疾病的發(fā)病，如TLR8能增加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1的表達(dá)水平，促進(jìn)系統(tǒng)性硬化（systemic sclerosis，SSc）患者的肺組織纖維化［24］；TLR2（Pro631His）變異的單核苷酸多態(tài)性被認(rèn)為與SSc的彌漫性病變和肺動脈高壓相關(guān)［25］。

2 免疫細(xì)胞與免疫器官

研究顯示，幼年與成年樹鼩的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比存在顯著差異，顯示出類似人類發(fā)育過程中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比“二次交叉”，且中性粒細(xì)胞百分比及細(xì)胞直徑較嚙齒類動物更接近人類［26］。對樹鼩的2 146個(gè)肝臟和肌肉組織的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示近一半的蛋白質(zhì)來自人類數(shù)據(jù)庫［27］。胸腺、脾和淋巴結(jié)等免疫器官的組化形態(tài)學(xué)研究，均提示樹鼩比嚙齒類動物（小鼠和大鼠）更接近于靈長類動物，為研究樹鼩建立人類相關(guān)自身免疫疾病的動物模型提供蛋白質(zhì)組學(xué)、組織學(xué)依據(jù)［28］。

3 自身免疫疾病的樹鼩模型

迄今為止僅報(bào)道了SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、和1型糖尿病3種人類自身免疫疾病的樹鼩模型。

3.1SLE模型RUAN等［29］將樹鼩腹腔內(nèi)注射脂多糖和植脂烷成功建立SLE模型。該模型樹鼩表現(xiàn)為肝、脾、腎、肺、心的多臟器損害，肝臟病理表現(xiàn)為彌漫性肝細(xì)胞壞死、粒細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞大量變性。SLE相關(guān)性肝炎的異質(zhì)性較大，部分文獻(xiàn)提示人類SLE相關(guān)肝炎病理為脂肪變性、干細(xì)胞大量壞死，與該樹鼩模型肝臟病理相似；且小鼠、大鼠的誘導(dǎo)型SLE模型多表現(xiàn)為單一或少數(shù)臟器受累［30-31］。樹鼩的SLE模型可能更能反映人類疾病的組織學(xué)特點(diǎn)的全貌。

3.2關(guān)節(jié)炎-間質(zhì)性肺病模型GAO等［32］報(bào)道將樹鼩皮下注射牛Ⅱ型膠原蛋白建立關(guān)節(jié)炎-間質(zhì)性肺病模型，該模型的肺部炎癥過程與小鼠、大鼠動物模型不同，表現(xiàn)為早期顯著的關(guān)節(jié)病變，較長時(shí)間后出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞肺部浸潤，該模型為探索RA相關(guān)的間質(zhì)性肺病提供了一個(gè)獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

3.31型糖尿病在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1型糖尿病樹鼩體內(nèi)檢測到較高水平的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），且早期出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶的升高，而鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠及大鼠動物模型通常檢測到HDL降低，樹鼩更利于研究1型糖尿病患者HDL升高及糖尿病早期肝損害的機(jī)制［33-34］。此外樹鼩具有自發(fā)性糖尿病，其癥狀如酮癥、白內(nèi)障以及胰腺病理學(xué)檢查等和人類糖尿病一致［33］。

據(jù)報(bào)道，每10種動物藥物研發(fā)的藥物中只有1種通過了臨床試驗(yàn)，而臨床藥物實(shí)驗(yàn)中與藥物相關(guān)的肝毒性是實(shí)驗(yàn)終止的最常見原因之一。大多經(jīng)肝臟清除的藥物被細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P，CYP）代謝［35］。KARL等［36］的研究顯示，敲除小鼠特有NADPH-P450氧化還原酶基因后，注射吉非替尼及阿扎那韋試驗(yàn)小鼠的藥物代謝更接近于人類。鼠類的P450功能基因與人類差異較大是鼠類與人藥代動力學(xué)差異的原因之一，而樹鼩的CYP功能基因比嚙齒動物更接近人類［35］

4 總結(jié)與展望

樹鼩兼具靈長目和嚙齒類動物的特點(diǎn)：其器官組織、生化代謝、基因組學(xué)與靈長類動物具有高度同源性，具有體型小、腦體比值高、繁殖周期短、生育能力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)等優(yōu)勢；且樹鼩與靈長類動物相比，更易獲取、價(jià)格更低廉、操作更方便、倫理審核更簡化。樹鼩獨(dú)特的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、組織學(xué)特性，決定了樹鼩在人類自身免疫疾病科學(xué)研究中的優(yōu)勢。迄今使用樹鼩構(gòu)建的自身免疫疾病動物模型已取得一定成果，相關(guān)研究顯示：樹鼩的免疫分子、免疫細(xì)胞的基因及氨基酸與人類具有保守性，樹鼩多個(gè)免疫分子與人類存在跨物種交叉免疫反應(yīng)，樹鼩免疫細(xì)胞與免疫器官與人類的相近程度更高，以及樹鼩存在與人類更相似的藥物代謝機(jī)制。預(yù)示著樹鼩在自身免疫疾病研究領(lǐng)域的巨大應(yīng)用前景。但樹鼩相較其他應(yīng)用成熟的試驗(yàn)動物而言，仍面臨許多挑戰(zhàn)，如經(jīng)驗(yàn)不足、樹鼩專用的特異性試劑盒正處于開發(fā)起步階段等，仍需不同領(lǐng)域的科學(xué)工作者協(xié)同合作，共同分享，突破瓶頸。