三七丹參片通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮對病毒性心肌炎小鼠的治療作用①

吳志煥（河北工程技術(shù)學(xué)院，石家莊050091）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染引起的心肌炎性病變［1］。柯薩奇病毒B3（Coxsackie virus B3，CVB3）是VMC發(fā)生的主要病原體［2］。目前研究認(rèn)為，CVB3直接攻擊心肌細(xì)胞，引起的免疫病理損傷及心肌炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致VMC心肌細(xì)胞凋亡及壞死的主要原因［3］。故免疫治療是VMC的主要治療方式［4］。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的同時還具有抗病毒作用［5］。近來研究發(fā)現(xiàn)，三七丹參片具有抗心肌缺血/再灌注損傷功能，還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力［6-7］。但三七丹參片是否能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫來治療VMC目前尚不明確。本研究擬建立VMC小鼠模型，從免疫調(diào)節(jié)方面對此進(jìn)行驗(yàn)證，以期為三七丹參片的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物來源健康雄性BALB/c小鼠90只，4～8周齡，體質(zhì)量16～18 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2020-0003。本實(shí)驗(yàn)由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會（IACUC）批準(zhǔn)（批號：IACUC-105061），并遵循《實(shí)驗(yàn)動物使用指南》，符合3R原則。CVB3懸液由中科院武漢病毒研究所王漢中教授提供。

1.1.2主要試劑及儀器三七丹參片（貴州德良方藥業(yè)股份有限公司，批號：Z20050068，規(guī)格：0.5 g/片）；利巴韋林（上海寶曼生物科技有限公司；批號：D3360）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，貨號：G1120）；TUNEL檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XYA113）；肌酸激酶同工酶ELISA試劑盒（滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司，貨號：SND-M192）；肌鈣蛋白ELISA試劑盒（杭州鉑賽生物科技有限公司，貨號：MM-0427M1）、肌紅蛋白ELISA試劑盒（上海西格生物科技有限公司，貨號：XG-E101848）；IL-17、IL-10、維甲酸相關(guān)孤核受體γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RoRγt）、Treg轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）、泛素蛋白酶2（SUMO protease 2，Senp2）、Toll樣受體-4（Toll-like receptor-4，TLR4）、果蠅雙翅邊緣缺刻同基因1（drosophila double-wing edge notch homologous gene 1，Notch1）等抗體（美國Abcam公司，貨號：ab79056、ab225820、ab41174、ab215206、ab58418、ab217274、ab52627）；自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司，型號：Gel Doc EZ）；熒光顯微鏡（美國奧林巴斯公司，型號：CX43）；超聲診斷掃描儀（加拿大VisualSonics公司，RZ-VEVO 3100）。

1.2方法

1.2.1病毒性心肌炎小鼠模型的建立及分組給藥取BALB/c小鼠，參照文獻(xiàn)［8］腹腔注射CVB3病毒懸液100 μl，連續(xù)3 d，1次/d，制備VMC模型。超聲心動圖檢測心功能指標(biāo)心臟射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和心率（heart rate，HR），HR及EF異常降低視為造模成功。共造模成功75只小鼠，隨機(jī)分為模型組、三七丹參片低（0.43 g/kg）、中（0.86 g/kg）、高（1.72 g/kg）劑量組及陽性對照組（利巴韋林，1 mg/kg），每組15只，另取15只小鼠，不做任何處理，正常喂養(yǎng)，作為正常對照組。三七丹參片參照文獻(xiàn)［7］設(shè)置劑量并進(jìn)行配制后，灌胃給藥，1次/d；利巴韋林參照文獻(xiàn)［8］經(jīng)腹腔注射給藥1次；正常對照組及模型組灌胃及腹腔注射等量相應(yīng)溶劑（羧甲基纖維素鈉、生理鹽水），各組均連續(xù)給藥7 d。給藥期間，統(tǒng)計小鼠死亡及飲食活動等一般狀況。

1.2.2小鼠心功能指標(biāo)檢測參照文獻(xiàn)［9］用超聲心動圖檢測小鼠心臟EF、HR。

1.2.3小鼠血清心肌損傷相關(guān)指標(biāo)檢測麻醉小鼠，取腹主動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書檢測肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白水平。

1.2.4小鼠免疫功能檢測麻醉處死后解剖小鼠，將心臟組織分成兩部分，一部分置于-80℃冰箱保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定備用。取小鼠新鮮脾臟參照文獻(xiàn)［8，10］方法用流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾臟中CD4+T/CD8+T、Th17/Treg。

1.2.5HE及TUNEL染色檢測心肌組織病理變化和心肌細(xì)胞凋亡率取1.2.4項(xiàng)下4%多聚甲醛中固定的組織標(biāo)本，常規(guī)處理后切成5 μm的切片。取部分切片按HE及TUNEL試劑盒說明書方法分別染色、封片后，置于顯微鏡下觀察組織變化。采用Image J軟件檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目，并計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6免疫組化法檢測心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達(dá)水平取1.2.5項(xiàng)下部分切片，抗原滅活修復(fù)后，加入一抗（RoRγt、Foxp3，1∶500）室溫孵育4 h后，加入二抗（1∶500）室溫孵育，DAB顯色后置于顯微鏡下觀察拍照，并采用Image J軟件檢測心肌組織中各蛋白陽性表達(dá)的平均光密度值。

1.2.7免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在心肌組織中的表達(dá)水平取1.2.6項(xiàng)下剩余組織切片，經(jīng)曲拉通透化后，加入一抗（兔抗MIF，1∶500）4℃孵育過夜，加入TRITC標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG，1∶200）孵育顯色后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，以Image J圖像分析系統(tǒng)檢測MIF表達(dá)熒光水平。

1.2.8Western blot檢測心肌組織中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表達(dá)取1.2.4中-80℃保存的心肌組織300 mg，4℃解凍后，冰上勻漿、離心分離后，取上清液，BCA法定量蛋白濃度后，取100 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1一抗（1∶2 000）、β-actin內(nèi)參抗體（1∶3 000），4℃孵育過夜后，加入二抗（1∶2 000），37℃孵育4 h后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三七丹參片對小鼠一般行為的影響正常對照組小鼠無死亡，行為活動正常。模型組小鼠有8只死亡，活動量及飲食減少，解剖后觀察心臟呈白色點(diǎn)狀或條索狀病變。丹參三七片低、中、高劑量組小鼠死亡數(shù)分別為5只、3只、1只，陽性對照組有3只小鼠死亡，且各治療組小鼠飲食及活動量均有所增加。

2.2三七丹參片對小鼠心功能的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心臟EF、HR降低（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組HR、EF升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 小鼠心臟超聲心動圖Fig.1 Echocardiogram of mice heart

表1 各組小鼠心臟EF、HR比較（±s）Tab.1 Comparison of heart EF and HR of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠心臟EF、HR比較（±s）Tab.1 Comparison of heart EF and HR of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 HR（Times/min）422.28±20.21 212.82±10.841）286.17±14.362）340.12±15.942）3）387.58±19.722）3）4）338.39±14.432）3）EF（%）78.93±3.28 51.60±2.461）59.43±1.382）66.57±3.012）3）74.78±3.122）3）4）66.19±3.052）3）

2.3三七丹參片對小鼠心肌損傷標(biāo)志物的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組心肌損傷標(biāo)志物降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠心肌損傷標(biāo)志物變化（±s）Tab.2 Changes of myocardial injury markers of mice in each group（±s）

表2 各組小鼠心肌損傷標(biāo)志物變化（±s）Tab.2 Changes of myocardial injury markers of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Creatine kinase isoenzyme/（U·ml-1）30.23±1.64 137.07±4.921）103.39±9.532）76.12±2.282）3）45.11±2.022）3）4）77.23±2.112）3）Myoglobin/（μg·L-1）80.02±4.01 584.12±10.141）403.26±13.122）223.53±10.142）3）164.39±8.132）3）4）228.09±10.352）3）Troponin/（μg·L-1）15.23±1.34 59.37±4.761）50.27±3.122）38.82±2.042）3）22.19±1.132）3）4）38.15±2.162）3）

2.4三七丹參片對小鼠心肌組織病理變化及心肌細(xì)胞凋亡率的影響正常對照組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無損傷。模型組小鼠心肌組織橫紋模糊，心肌細(xì)胞水腫、胞漿疏松且淡染，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，心肌細(xì)胞凋亡率高于正常對照組（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠心肌組織橫紋逐漸清晰，心肌細(xì)胞壞死及炎癥浸潤等病理損傷逐漸緩解，心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高心肌損傷越輕，凋亡率降低越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Apoptosis rate（%）9.19±0.91 45.63±2.241）36.25±1.492）28.18±1.042）3）16.24±0.722）3）4）29.29±1.432）3）

圖2 各組小鼠心肌HE及TUNEL染色圖（×200）Fig.2 HE and TUNEL staining of myocardium of mice in each group（×200）

2.5三七丹參片對小鼠免疫功能的影響與正常對照組相比，模型組小鼠Th17/Treg、CD4+T/CD8+T升高（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照 組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表4。

表4 各組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T比較（±s）Tab.4 Comparison of Th17/Treg and CD4+T/CD8+T in each group（±s）

表4 各組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T比較（±s）Tab.4 Comparison of Th17/Treg and CD4+T/CD8+T in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Th17/Treg 0.16±0.04 4.12±0.461）3.36±0.352）2.09±0.242）3）0.99±0.092）3）4）2.11±0.262）3）CD4+T/CD8+T 1.42±0.12 2.33±0.201）1.91±0.142）1.71±0.112）3）1.57±0.102）3）4）1.72±0.102）3）

圖3 小鼠脾臟淋巴液中Th17及Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3流式檢測結(jié)果Fig.3 Flow cytometric detection results of Th17 and Treg transcription factor Foxp3 in mice spleen lymph

2.6三七丹參片對小鼠心肌組織MIF表達(dá)的影響與正常對照組相比，模型組小鼠MIF表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠MIF表達(dá)降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

表5 各組小鼠MIF表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of MIF expression in mice of each group（±s）

表5 各組小鼠MIF表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of MIF expression in mice of each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 MIF 1.09±0.11 2.93±0.241）2.35±0.242）1.88±0.182）3）1.44±0.122）3）4）1.89±0.152）3）

圖4 各組小鼠心肌組織MIF免疫熒光染色圖（×400）Fig.4 MIF immunofluorescence staining of myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.7三七丹參片對小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達(dá)的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞RoRγt陽性表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3陽性表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠RoRγt陽性表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3陽性表達(dá)升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表6。

表6 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達(dá)水平比較（±s）Tab.6 Comparison of RoRγt and Foxp3 positive expression levels in myocardial tissue of mice in each group（±s）

表6 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達(dá)水平比較（±s）Tab.6 Comparison of RoRγt and Foxp3 positive expression levels in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 RoRγt 4.41±0.14 36.91±1.281）28.58±1.152）20.97±1.052）3）12.47±0.622）3）4）20.49±0.042）3）Foxp3 25.36±1.33 2.28±0.161）7.48±0.582）10.29±1.052）3）18.27±1.322）3）4）10.08±1.082）3）

圖5 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3免疫組化染色圖（×400）Fig.5 Immunohistochemical staining of RoRγt and Foxp3 in myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.8三七丹參片對心肌組織中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Senp2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Senp2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標(biāo)變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表7、圖6。

表7 各組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group（±s）

表7 各組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 IL-17/β-actin 1.05±0.09 2.84±0.281）2.41±0.262）1.93±0.192）3）1.58±0.152）3）4）1.99±0.192）3）IL-10/β-actin 1.13±0.10 2.73±0.261）2.22±0.242）1.86±0.182）3）1.47±0.142）3）4）1.84±0.172）3）TLR4/β-actin 1.02±0.12 2.99±0.251）2.52±0.232）2.06±0.222）3）1.65±0.172）3）4）2.08±0.262）3）Notch1/β-actin 1.01±0.10 2.73±0.241）2.12±0.252）1.72±0.172）3）1.45±0.142）3）4）1.78±0.172）3）Senp2/β-actin 1.19±0.11 0.13±0.041）0.32±0.052）0.62±0.062）3）0.85±0.082）3）4）0.60±0.052）3）

圖6 各組小鼠心 肌 組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.6 Western blot analysis of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group

3 討論

新型冠狀病毒、腸道病毒、腺病毒、流感病毒等均可誘發(fā)VMC［11-12］。CVB3誘導(dǎo)的VMC在臨床上最為常見，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者出現(xiàn)心力衰竭或死亡等［13］。本研究通過腹腔注射CVB3建立VMC小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，小鼠死亡率增高、心肌細(xì)胞壞死及炎癥浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重，并伴隨心功能指標(biāo)心臟EF、HR的明顯降低，以及心肌損傷標(biāo)志物水平的異常升高，提示造模成功。大量研究發(fā)現(xiàn)，三七丹參片中的丹參、三七具有抗心肌損傷作用，且馬婧等［14］發(fā)現(xiàn)丹參、三七也是抗新冠病毒的潛在藥物，提示三七丹參片也可能是緩解VMC心肌損傷的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著三七丹參片劑量的升高，VMC小鼠死亡逐漸減少，心肌損傷及炎癥浸潤緩解明顯，心功能損傷也得到顯著改善，且三七丹參片高劑量組改善效果優(yōu)于中、低劑量組及陽性對照組，證實(shí)了三七丹參片也可緩解CVB3感染誘發(fā)的心肌損傷，對VMC有較好的改善作用。

病毒感染攻擊心肌等宿主細(xì)胞時，會誘發(fā)機(jī)體一系列的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)CVB感染宿主細(xì)胞后可導(dǎo)致反應(yīng)性T細(xì)胞和抗體應(yīng)答的產(chǎn)生，而心臟損傷后自身抗原的釋放也可誘導(dǎo)抗原致敏的CD4+T細(xì)胞激活，CD4+T細(xì)胞激活后可通過激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤加重心臟損害［15］；CHEN等［16］發(fā)現(xiàn)病毒感染產(chǎn)生的CD4+T和CD8+T可持續(xù)存在并導(dǎo)致心臟慢性炎癥的發(fā)生，而調(diào)控CD4+T/CD8+T平衡可減輕VMC心肌損傷。免疫細(xì)胞中的Th17可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤而發(fā)揮促炎作用，Treg可抑制炎癥反應(yīng)并維持免疫平衡，Treg與Th17比例失衡也提示機(jī)體免疫功能的紊亂。DAI等［17］發(fā)現(xiàn)，VMC小鼠體內(nèi)存在Treg/Th17失衡；呂愛婷等［8］發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡可緩解VMC小鼠心肌損傷，提示CD4+T、CD8+T、Th17、Treg等是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，且與VMC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)VMC小鼠體內(nèi)存在CD4+T/CD8+T、Treg/Th17的失衡，以及心肌炎癥因子IL-17、IL-10表達(dá)的升高和先天免疫力蛋白酶Senp2表達(dá)的缺失，提示VMC小鼠免疫功能失衡及炎癥反應(yīng)是引起心肌損傷的可能原因。三七具有抗炎、提高免疫功能作用，丹參具有抗細(xì)胞凋亡、抗炎、抗心肌損傷作用，張興城等［7］及楊艷等［18］等發(fā)現(xiàn)由三七和丹參兩種藥物聯(lián)合組成的三七丹參片具有較好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗細(xì)胞凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，三七丹參片劑量越高，CD4+T/CD8+T及Treg/Th17越趨向于平衡，Th17轉(zhuǎn)錄因子RoRγt在心肌組織細(xì)胞中陽性表達(dá)水平越低、Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在心肌組織中陽性表達(dá)越高、心肌細(xì)胞炎癥因子釋放越少、心肌細(xì)胞凋亡率越低，提示三七丹參片可能通過調(diào)節(jié)免疫平衡、降低炎癥反應(yīng)來緩解VMC小鼠心肌損傷及凋亡。

TLRs是巨噬細(xì)胞識別病毒、細(xì)菌等抗原微生物，激活機(jī)體免疫應(yīng)答、激活抗原呈遞，介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的主要通路。王芳潔等［19］發(fā)現(xiàn)抑制TLR4表達(dá)可緩解CVB3感染小鼠的心肌炎癥損傷程度。MIF是炎癥因子刺激巨噬細(xì)胞后釋放的細(xì)胞因子，可抑制巨噬細(xì)胞游走、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)菌及病毒的感染。DE SOUZA等［20］發(fā)現(xiàn)在呼吸道合胞病毒感染引起的肺組免疫炎癥損傷過程中，抑制肺組織MIF表達(dá)可降低肺組織炎癥損傷。Notch1是RoRγt的上游調(diào)節(jié)因子，李志萍等［21］發(fā)現(xiàn)Notch1信號激活可干預(yù)Treg/Th17分化平衡過程，且抑制Notch1激活，可降低支原體感染肺炎兒童肺組織免疫炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，CVB3感染小鼠后，也可激活Notch1、TLR4通路，并促進(jìn)MIF在心肌組織中的表達(dá)，提示Notch1、TLR4通路激活也可能參與VMC小鼠免疫炎癥反應(yīng)過程。三七丹參片各劑量組小鼠心肌組織中Notch1、TLR4及MIF表達(dá)呈劑量依賴性降低，且高劑量組優(yōu)于陽性對照組，提示三七丹參片改善VMC小鼠免疫功能及炎癥損傷的作用可能與抑制Notch1、TLR4及MIF表達(dá)有關(guān)。

三七丹參片可能通過調(diào)節(jié)免疫功能，降低炎癥反應(yīng)來改善VMC小鼠心肌損傷及凋亡，且其降低免疫炎癥反應(yīng)作用可能與抑制Notch1、TLR4通路激活有關(guān)。但病毒感染引起的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，且靶點(diǎn)較多，三七丹參片對于免疫調(diào)節(jié)的靶向調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。