小鼠非酒精性脂肪性肝炎早期YAP活性變化特征及其與膽管反應(yīng)的時(shí)空關(guān)系

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的慢性肝病。據(jù)報(bào)道全球約有25%人口診斷為NAFLD，其中約20%NAFLD患者可能進(jìn)展為NASH。目前NASH已在全球范圍內(nèi)造成了巨大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。因此，探究NASH發(fā)生發(fā)展過程中的病理生理機(jī)制至關(guān)重要。Yes-相關(guān)蛋白（YAP）作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，是肝臟發(fā)育、修復(fù)、細(xì)胞命運(yùn)決定和腫瘤發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。YAP活性的異常增加會(huì)誘發(fā)多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。在四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠模型以及NASH患者肝臟組織中，YAP/TAZ/CYR61的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；YAP下游靶基因CYR61表達(dá)增加可募集巨噬細(xì)胞，促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化的發(fā)展。并且YAP激活能夠促進(jìn)NASH相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。因此YAP激活在NASH疾病進(jìn)展過程中具有重要作用。但是目前尚不清楚NASH早期YAP的活性變化特點(diǎn)。

膽管反應(yīng)（DR）是一種對(duì)肝膽細(xì)胞損傷的再生修復(fù)表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為膽管細(xì)胞增殖所致的原始小膽管形成。目前認(rèn)為角蛋白19（K19）、性別決定區(qū)Y框蛋白9（Sox9）等膽管細(xì)胞標(biāo)志物在肝組織中的陽性表達(dá)是DR發(fā)生的標(biāo)志。研究報(bào)道，NASH患者肝組織中DR發(fā)生程度與肝纖維化分期顯著正相關(guān)，且臨床觀察發(fā)現(xiàn)，NASH肝損傷進(jìn)展似乎可以誘導(dǎo)DR發(fā)生，從而促進(jìn)肝纖維發(fā)生。因此，了解DR發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于闡明NASH病理進(jìn)程有重要的參考價(jià)值。DR發(fā)生依賴于膽管樣細(xì)胞的增殖，探究膽管樣細(xì)胞的來源是解決DR發(fā)生的關(guān)鍵所在。據(jù)報(bào)道在膽汁淤積性小鼠模型中YAP活性增加能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管樣細(xì)胞，參與DR的發(fā)生。然而，尚沒有研究報(bào)道在NASH疾病早期YAP是否也發(fā)揮相似的作用，并參與DR發(fā)生。

因此，本研究擬采用兩種不同致病機(jī)制的NASH小鼠模型，即蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）、硫代乙酰胺（TAA）飲食模型，系統(tǒng)觀察NASH發(fā)生早期YAP活性改變的特點(diǎn)以及其分布與DR發(fā)生分布的時(shí)空關(guān)系，為探尋NASH早期病理發(fā)生機(jī)制提供新線索。

中國(guó)是世界上最大的金條和金幣需求市場(chǎng)，本季度需求呈上升趨勢(shì)，同比上升了25%，至86 t。分析認(rèn)為，中美貿(mào)易戰(zhàn)局勢(shì)升級(jí)，國(guó)內(nèi)股票和債券市場(chǎng)紛紛受挫，本季度金價(jià)再次下跌，投資者紛紛涌入黃金市場(chǎng)。同時(shí)，受益于七夕、中秋節(jié)，以及營(yíng)銷策略的不斷創(chuàng)新，本季度金飾需求旺盛。世界黃金協(xié)會(huì)中國(guó)區(qū)董事總經(jīng)理王立新表示，作為全球最大的金條和金幣市場(chǎng)，本季度中國(guó)實(shí)物黃金投資需求實(shí)現(xiàn)了28%的大幅增長(zhǎng)。這再次體現(xiàn)了黃金在投資組合中不可替代的避險(xiǎn)作用。從第三季度數(shù)據(jù)來看，中國(guó)金飾消費(fèi)需求受到特定節(jié)假日影響十分顯著。金飾零售商也恰當(dāng)?shù)乩脵C(jī)會(huì)開展產(chǎn)品營(yíng)銷活動(dòng)，從而推動(dòng)銷量并提升品牌忠誠度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠72 只（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均置于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始造模實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和操作均遵循南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則，并得到南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及認(rèn)可（NFYY-2020-0339）。

1.1.2 主要試劑與儀器 蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD，南通特洛菲）；硫代乙酰胺（TAA，Sigma）；蘇木素伊紅染色試劑盒（雷根）；YAP 抗體、K19 抗體、Sox9 抗體（Abcam）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、DAB顯色液（中杉金橋）；RNAiso Plus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green?Premix Ex Taq ?II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）；5%BSA、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天）。NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)（NanoDrop）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏）；組織研磨儀（上海凈信）；Wes 全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)儀（ProteinSimple）；正置明場(chǎng)顯微鏡（Lecia）。

1.2 方法

(二)欲望危機(jī)。欲望危機(jī)就是人的欲望給個(gè)體生命、社會(huì)組織、人與人、人與社會(huì)、人與自然等帶來的危害與破壞。恰當(dāng)而適度的欲望本是人類與社會(huì)前進(jìn)發(fā)展的動(dòng)力，但欲望失當(dāng)和過度便會(huì)造成欲望危機(jī)。欲望危機(jī)的實(shí)質(zhì)就是欲望異化。老子并不反對(duì)人的基本欲望，但他反對(duì)不當(dāng)而過度的欲望。他指出，“五色令人目盲，五音令人耳聾，五味令人口爽，馳騁畋獵令人心發(fā)狂，難得之貨令人行妨。是以圣人為腹不為目，故去彼取此”(十二章)[3]。他從人的基本生理需求欲望——聲色味的過度追求可能導(dǎo)致的危害，得出“災(zāi)禍與人的欲望”相互關(guān)系的基本結(jié)論，這就是“咎莫大于欲得”(四十六章)[3]。

1.2.5 免疫組化 免疫組化檢測(cè)YAP、K19、Sox9 的表達(dá)；其中K19和Sox9為DR鑒定標(biāo)志物之一。步驟如下：肝組織石蠟切片4 μm，65 ℃烘箱烤片2 h；二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，枸櫞酸鹽溶液進(jìn)行微波抗原修復(fù)；3%過氧化氫溶液浸泡10 min；5%BSA室溫封閉1 h；滴加一抗抗體（YAP、K19和Sox9）；4 ℃過夜孵育。次日，PBS浸洗3次（3 min/次）；加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS浸洗3次（3 min/次）；DAB顯色；細(xì)胞核復(fù)染；明場(chǎng)顯微鏡下觀察。肝細(xì)胞細(xì)胞核呈YAP陽性染色為YAP陽性肝細(xì)胞，胞質(zhì)與胞核均呈YAP陽性染色且具有膽管樣細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞為YAP陽性膽管樣細(xì)胞，胞質(zhì)與胞核均呈K19陽性染色和Sox9陽性染色的膽管細(xì)胞為K19陽性DR細(xì)胞、Sox9陽性DR細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野（×400）后，用Image J 圖像處理軟件計(jì)數(shù)該視野下YAP陽性肝細(xì)胞、YAP陽性膽管樣細(xì)胞以及K19陽性、Sox9陽性DR細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

回到家，我對(duì)媽媽說：“媽媽，我不想學(xué)了，舞蹈太難了?！眿寢尪⒅铱戳艘粫?huì)兒，眼中充滿了失望，但仍在和藹地對(duì)我說：“孩子，你不能因?yàn)橐稽c(diǎn)困難就輕易放棄，你不是想?yún)⒓友莩鰡?？為了這個(gè)夢(mèng)想也要堅(jiān)持下去呀！只要功夫深，鐵杵磨成針。遇到困難，要學(xué)會(huì)選擇堅(jiān)持。你想一想，站在舞臺(tái)上，那么多人為你鼓掌，這是一件多么值得驕傲的事兒??！”

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡 將20 mg肝組織置于1.5 mL離心管，加入200 μL裂解液（RIPA裂解液加入終濃度為1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF），使用組織研磨儀勻漿（60 Hz，60 s，2次），4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，吸取上清至新1.5 mL離心管；按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定樣本蛋白濃度；使用WES全自動(dòng)蛋白定量檢測(cè)儀測(cè)定YAP蛋白表達(dá)量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用RNAiso Plus試劑盒提取肝組織總RNA；使用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；按照TB Green ?Premix Ex Taq ?II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)YAP 及其靶基因（Ctgf、Cyr61、Acta2）的mRNA 水平。引物序列：YAP上游引物序列：5'-ACCCTCGTTT TGCCATGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGTGCTGGGA TTGATATTCCGTA-3'；Ctgf 上游引物序列：5'-GACC CAAC TATGATGCGAGCC-3'，下游引物序列：5'-CCC ATCCCACAGGTCTTAGAAC-3'；Cyr61 上游引物序列：5'-CTGCGCTAAACAACTCAACGA-3'，下游引物序列：5'-GCAGATCCCTTTCAGAGCGG-3'；Acta2 上游引物序列：5'-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3'，下游引物序列：5'-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3'。以上引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以Gapdh為內(nèi)參，采用2法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 肝組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)正常對(duì)照組、MCD 組、TAA 組各時(shí)間點(diǎn)的肝組織進(jìn)行常規(guī)的HE 染色和Masson染色評(píng)估肝組織病理學(xué)改變以及纖維化情況；按照肝臟脂肪變性、活動(dòng)度、纖維化評(píng)分系統(tǒng)（SAF）和Ishak評(píng)分系統(tǒng)，進(jìn)行活動(dòng)度（A）和纖維化（F）評(píng)分。肝纖維化是NASH進(jìn)展期的標(biāo)志。將A＜2且F≤1 定義為NASH 疾病早期，A≥2 且F＞1 定義為NASH疾病進(jìn)展期。肝組織學(xué)分析由兩名專業(yè)的病理科醫(yī)生完成。

TAA組在第3天表現(xiàn)NASH病理特點(diǎn)，小鼠肝組織中央靜脈區(qū)域33%以上肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變（病理學(xué)評(píng)分為1.8）、少量肝細(xì)胞氣球樣變（病理學(xué)評(píng)分為0.4）并伴有較明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死灶（病理評(píng)分為2.4）（圖2B、G）。與正常對(duì)照組相比，TAA組3 d～2周小鼠肝纖維化評(píng)分無顯著性差異，4、6、12周均出現(xiàn)明顯纖維化（＜0.01，圖2B～H）。因此，劃分TAA組3 d～2周為TAA組NASH疾病早期，4～12周為TAA組NASH疾病進(jìn)展期。

DR標(biāo)志物分子（K19和Sox9）的免疫組化染色結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組小鼠肝組織中只有匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)K19陽性染色和Sox9陽性染色，數(shù)量分別為18.8、30.17/×400視野（圖7A、E；圖8A、E）。在NASH疾病模型誘導(dǎo)階段，MCD組4 周小鼠肝組織匯管區(qū)周圍K19/Sox9陽性DR細(xì)胞略有增加（圖7B、F），但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7I、J）；8 周、12 周肝組織中央靜脈周圍的肝小葉區(qū)域K19/Sox9 陽性DR 細(xì)胞數(shù)量以及管狀結(jié)構(gòu)顯著增多（＜0.01，圖7C、D、I，＜0.001，圖7G、H、J）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

線下主要是教師講授和學(xué)生自主探討相結(jié)合的方式為主，線上以學(xué)習(xí)課程教學(xué)視頻和探討疑難交流為主。教學(xué)方法是教師將線上與線下、自我探索、任務(wù)驅(qū)動(dòng)、問題導(dǎo)向和小組討論相結(jié)合。營(yíng)造輕松自由的上課氛圍,教師與學(xué)生緊密溝通,調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性,提高學(xué)生的參與度。

利用GraphPad Prism 8.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及可視化處理。每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量為3 只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用檢驗(yàn)、One-way ANOVA和Two-way ANOVA等方法分析，組間多重比較在方差齊性時(shí)采用Bonferroni方法，方差不齊性時(shí)采用Dunnett T方法。雙側(cè)＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NASH疾病模型的肝組織病理學(xué)改變

HE染色顯示正常對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無明顯肝細(xì)胞脂肪變性以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A、2A）。MCD組1周表現(xiàn)NASH病理特點(diǎn)，小鼠肝組織中5%～33%肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變（病理學(xué)評(píng)分為1.0）、少量肝細(xì)胞氣球樣變（病理學(xué)評(píng)分為0.6）并伴有炎癥（病理評(píng)分為1.0）（圖1B、G）。與正常對(duì)照組相比，MCD組1、2、4 周肝纖維化評(píng)分無顯著性差異，8、12周出現(xiàn)明顯的肝纖維化（＜0.01，圖1B～H）。因此，劃分MCD組1～4周為MCD 組NASH 疾病早期，8～12 周為MCD 組NASH疾病進(jìn)展期。

何良諸神情恍惚，跟隨趙集，朝酒店走去。十多年前，何良諸走向小勺酒店。小勺款款走出來，往門框上一靠，抱住胳膊，一挑尖溜溜下頦，說：“進(jìn)來呀?！?/p>

2.2 NASH疾病早期肝組織中YAP表達(dá)和活性變化

免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝組織中除匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)YAP陽性染色以外，肝細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有YAP表達(dá)（圖3A、E；圖4A、E）。在MCD組和TAA組的NASH疾病早期小鼠肝組織中肝細(xì)胞內(nèi)YAP活性顯著增加，表現(xiàn)為YAP的表達(dá)量增多且多位于細(xì)胞核（圖3B～D、F；4B～D、F）。與正常對(duì)照組相比，MCD組NASH早期（1、2、4周）小鼠肝組織中YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量增加（＜0.001），且在2周達(dá)到峰值后逐漸減少（圖3G）。與正常對(duì)照組相比，TAA組NASH早期（3 d、1周、2周）小鼠肝組織中YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量增加（＜0.001），于2周時(shí)達(dá)到峰值（圖4G），并且YAP陽性染色范圍由中央靜脈區(qū)域向整個(gè)肝小葉逐漸擴(kuò)大（圖4B～D）。

qPCR 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，MCD 組NASH早期（1、2、4周）小鼠肝組織中YAP及其下游靶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加（＜0.01，圖5A）。TAA組NASH早期（1、2周）小鼠肝組織中YAP及其下游靶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加（＜0.05，圖5B）。與正常對(duì)照組相比，兩個(gè)模型組NASH疾病早期肝組織YAP及其下游靶基因mRNA水平均增加。

網(wǎng)架高度是網(wǎng)架選型的關(guān)鍵點(diǎn)之一。平板型網(wǎng)架的力學(xué)模型可等效成一塊考慮剪切變形的夾層板，為了保證必要的剛度，網(wǎng)架的高度隨跨度L的增加而增大，網(wǎng)架高度既是控制網(wǎng)架變形的主要因素，同時(shí)也影響著網(wǎng)架桿件內(nèi)力的大小，相應(yīng)也影響著網(wǎng)架節(jié)點(diǎn)形式的選取。一般來說網(wǎng)架高度越高，網(wǎng)架剛度就越大，桿件受力越小，但是并非越高越好，網(wǎng)架高度太高一方面會(huì)增加施工安裝的難度，另一方面由于桿件長(zhǎng)細(xì)比增加導(dǎo)致桿件截面加大，最終反而可能導(dǎo)致網(wǎng)架用鋼量增加。因此合理的網(wǎng)架高度應(yīng)該是在滿足承載力和變形要求的前提下，盡量減小網(wǎng)架桿件數(shù)量和用鋼量，通常采用試算法來確定合理的網(wǎng)架高度。

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝組織YAP總蛋白表達(dá)量較低，其蛋白特征性峰面積為1385（圖6A、B）。在NASH早期誘導(dǎo)階段，與正常對(duì)照組相比，MCD組1、2、4周小鼠肝組織YAP總蛋白表達(dá)量增加（＜0.001），2 周達(dá)到最高值后降低（圖6A）；與正常對(duì)照組相比，TAA組3 d、1周、2周小鼠肝組織YAP總蛋白表達(dá)量增加（＜0.001，圖6B）。

1.2.1 NASH小鼠模型建立 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、MCD組、TAA組。正常對(duì)照組：普通飼料和飲用水，分別于3 d、1 周、2 周、4 周、6 周、8 周、12 周隨機(jī)選取3只收集肝組織；MCD組：蛋氨酸膽堿缺乏飼料（除蛋氨酸、膽堿缺乏外，含40%蔗糖和10%脂肪）和飲用水，分別于1、2、4、8、12周隨機(jī)選取3只收集肝組織；TAA組：普通飼料和含300 mg/L硫代乙酰胺的飲用水，分別于3 d、1 周、2 周、4 周、6 周、12 周隨機(jī)選取3只收集肝組織。

2.3 NASH小鼠模型肝組織表現(xiàn)出廣泛的膽管反應(yīng)

其中，(a,x)為不完全Gamma函數(shù)，pFq(a1,…,ap;b1,…,bq;z)為廣義超幾何函數(shù)，將式(14)代入式(13)可得：

TAA組4 周小鼠肝組織中央靜脈周圍出現(xiàn)K19/Sox9陽性DR細(xì)胞（圖8B、F），但與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8I、J）；6 周、12 周肝組織中的K19/Sox9陽性DR細(xì)胞數(shù)量以及管狀結(jié)構(gòu)不斷增加分布于整個(gè)肝小葉中（＜0.01，圖8C、D、I；＜0.001，圖8G、H、J）。

2.4 NASH疾病模型早期YAP激活與DR發(fā)生的時(shí)空關(guān)系

通過比較MCD、TAA 飲食誘導(dǎo)NASH 疾病早期YAP激活時(shí)間以及DR發(fā)生時(shí)間，發(fā)現(xiàn)MCD組和TAA組小鼠肝組織中的YAP活性增加時(shí)間：MCD組1 周、2周（圖3B、C、圖5A，圖6A），TAA 組3 d、1 周、2 周（圖4B～D、圖5B、圖6B），均早于DR發(fā)生的時(shí)間：MCD組4周、8 周、12 周（圖7B～D、F～H），TAA組4、6、12周（圖8B～D、F～H）。

進(jìn)一步觀察MCD組和TAA組NASH疾病進(jìn)展過程中肝細(xì)胞內(nèi)YAP激活與DR發(fā)生的時(shí)空關(guān)系，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組小鼠肝組織中只有匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞呈YAP 陽性染色，數(shù)量為9.8/×400 視野（圖9A、E；圖10A、E）。在NASH疾病早期誘導(dǎo)階段，MCD組2 周小鼠肝組織中YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量增加至峰值90.8/×400視野（＜0.001）后持續(xù)減少（圖3C，9E），4 周肝組織匯管區(qū)DR開始發(fā)生時(shí)，YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量減少（＜0.001），并且在匯管區(qū)出現(xiàn)了YAP陽性膽管樣細(xì)胞（圖9B、E）；NASH疾病進(jìn)展期，8 周、12 周小鼠肝組織中央靜脈周圍的肝小葉區(qū)域表現(xiàn)出廣泛的DR（圖7C、D、G、H），同時(shí)中央靜脈周圍的肝小葉區(qū)域的YAP陽性肝細(xì)胞繼續(xù)減少，YAP陽性膽管樣細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加（＜0.001），并且發(fā)現(xiàn)大量的由YAP陽性膽管樣細(xì)胞組成的管狀結(jié)構(gòu)（圖9C～E）。

在NASH疾病早期誘導(dǎo)階段，TAA組2 周小鼠肝組織YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量增加至峰值69.2/×400視野（＜0.001）后持續(xù)減少（圖4D；圖10E）；在NASH疾病進(jìn)展期，TAA 組4 周小鼠肝組織中央靜脈區(qū)域周圍DR 開始發(fā)生時(shí)，同樣YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量開始減少（＜0.001），并且在中央靜脈區(qū)出現(xiàn)了YAP陽性膽管樣細(xì)胞（圖10B、E）；6、12周小鼠肝組織整個(gè)肝小葉區(qū)域表現(xiàn)出廣泛的DR 時(shí)（圖8C、D、G、H），位于肝小葉區(qū)域YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少（＜0.001），YAP陽性膽管樣細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加（＜0.001），并且觀察到大量的由YAP陽性膽管樣細(xì)胞組成的管狀結(jié)構(gòu)（圖10C～E）。

3 討論

NASH作為一種嚴(yán)重的NAFLD形式已成為肝衰竭、肝移植的重要原因之一。然而，目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局尚未批準(zhǔn)用于治療NASH的特定藥物，部分原因是對(duì)NASH疾病各個(gè)時(shí)期潛在的病理生理機(jī)制不完全了解。因此，探索NASH疾病早期的病理特征，對(duì)NASH治療或長(zhǎng)期預(yù)后具有重要意義。YAP是一種具有高度保守性的轉(zhuǎn)錄共激活因子，由于缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，YAP需與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，共同調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖以及減少細(xì)胞凋亡等。生理?xiàng)l件下，肝組織中的YAP活性受到抑制，主要以磷酸化形式滯留在細(xì)胞質(zhì)中或被降解，參與維持成年肝臟正常組織形態(tài)和生理功能。然而，在NAFLD疾病動(dòng)物模型以及NASH患者肝臟中均發(fā)現(xiàn)YAP活性異常增加，并且YAP活性的增加與疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)關(guān)系；如在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD猴子肝組織中YAP主要在肝細(xì)胞以及膽管細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，并且YAP活性增加與NAFLD活動(dòng)度評(píng)分呈正相關(guān)。在纖維化NASH患者肝組織中發(fā)現(xiàn)YAP在反應(yīng)性管狀細(xì)胞（RDC）的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但在細(xì)胞核的表達(dá)更顯著，并且YAP表達(dá)水平與肝損傷指標(biāo)（肝細(xì)胞氣球樣變、肝小葉炎癥）呈正相關(guān)。這些研究表明YAP活性的異常增加參與了NASH疾病的發(fā)生發(fā)展，然而在飲食誘導(dǎo)的NASH疾病早期中YAP活性變化及其特點(diǎn)尚未報(bào)道。本研究在組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，MCD組和TAA組NASH疾病早期小鼠肝組織中肝細(xì)胞內(nèi)YAP的表達(dá)量明顯增多且多位于細(xì)胞核。同時(shí)，這兩種飲食誘導(dǎo)NASH早期小鼠肝組織中YAP 及其下游靶基因（Ctgf、Cyr6 和Acta2）的mRNA水平和YAP蛋白表達(dá)量顯著增加。因此，這些結(jié)果提示YAP活性在MCD和TAA飲食誘導(dǎo)NASH疾病早期肝組織中均顯著增加。

DR表現(xiàn)為表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物（如K19和Sox9等）的細(xì)胞從匯管區(qū)擴(kuò)展到肝小葉中。DR不僅常見于膽道疾病，也存在于包括NAFLD、肝細(xì)胞肝癌在內(nèi)的各種肝臟疾病中。在NASH患者中，DR程度與NAS評(píng)分、纖維化階段和門靜脈炎癥程度密切相關(guān)，提示DR與NASH的疾病進(jìn)展之間存在相關(guān)性。此外，研究證實(shí)YAP活性的增加能夠調(diào)控各類膽道疾病中DR的發(fā)生，如：在原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的肝臟中發(fā)現(xiàn)YAP在DR細(xì)胞中表達(dá)；并且肝臟特異性YAP基因的敲除可顯著降低膽管結(jié)扎所致的膽汁淤積小鼠肝臟中的DR。此外，有研究也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞YAP基因特異性敲除可導(dǎo)致3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫可樂定（DDC）誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷小鼠肝組織中的DR顯著減少。這表明YAP活性是DR發(fā)生所必需的。然而在NASH早期病理生理?xiàng)l件下YAP激活與DR發(fā)生的關(guān)系目前尚不明確。

本研究采用免疫組化檢測(cè)了DR相關(guān)的分子標(biāo)志物K19和Sox9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MCD和TAA小鼠肝組織YAP活性增加的初始時(shí)間（MCD組1 周；TAA組3 d）早于DR發(fā)生的初始時(shí)間（MCD組4周；TAA組4周）。因此，我們推測(cè)YAP的激活可能是DR發(fā)生的關(guān)鍵。此外，對(duì)K19/Sox9和YAP免疫染色的時(shí)空分析表明，在MCD小鼠中，4 周時(shí)YAP陽性膽管樣細(xì)胞和DR細(xì)胞開始出現(xiàn)在匯管區(qū)，隨后在8、12周時(shí)二者均擴(kuò)散到中央靜脈區(qū)域。在TAA小鼠中，4周時(shí)YAP陽性膽管樣細(xì)胞和DR細(xì)胞開始出現(xiàn)在中央靜脈區(qū)，隨后在6、12周時(shí)二者向中央靜脈周圍的肝小葉延伸。因此，我們發(fā)現(xiàn)在MCD以及TAA飲食誘導(dǎo)的NASH疾病進(jìn)展過程中，YAP陽性膽管樣細(xì)胞和DR細(xì)胞幾乎同時(shí)出現(xiàn)，并且分布區(qū)域高度重合。與我們的結(jié)果相似，有研究在四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中觀察到DR細(xì)胞以及YAP陽性細(xì)胞均分布在匯管區(qū)周圍的肝小葉中。有研究發(fā)現(xiàn)在NASH患者以及小鼠模型中，當(dāng)DR由匯管區(qū)擴(kuò)散到周圍的肝小葉中時(shí)，YAP陽性RDC也出現(xiàn)在肝小葉中，并且YAP陽性RDC的數(shù)量與K19陽性細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)。提示在NASH疾病進(jìn)展過程中YAP的活性變化特征及其分布與DR發(fā)生分布位置具有時(shí)空相關(guān)關(guān)系。

DR的細(xì)胞起源一直備受爭(zhēng)議。膽管細(xì)胞的增殖、肝祖細(xì)胞的激活和增殖以及肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化均可為DR發(fā)生提供細(xì)胞來源。據(jù)報(bào)道，YAP通路參與調(diào)節(jié)DR細(xì)胞命運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)YAP激活與DR具有時(shí)空相關(guān)性，這讓我們思考YAP如何控制DR。在MCD飲食誘導(dǎo)的NASH早期，2周時(shí)YAP主要在肝細(xì)胞核中表達(dá)，4周時(shí)YAP陽性肝細(xì)胞開始逐漸減少，YAP陽性膽管樣細(xì)胞首先出現(xiàn)在DR發(fā)生的初始位置，即匯管區(qū)周圍；在NASH進(jìn)展期（8～12周），YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，而YAP陽性膽管樣細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，并分布在中央靜脈周圍的肝小葉中，與DR細(xì)胞的分布一致。在TAA飲食誘導(dǎo)的NASH早期，2周時(shí)YAP主要在肝細(xì)胞核中表達(dá)；在NASH進(jìn)展期（4～12周），4周時(shí)YAP陽性肝細(xì)胞開始逐漸減少，YAP陽性膽管樣細(xì)胞首先出現(xiàn)在DR發(fā)生的初始位置，即中央靜脈區(qū)域，6、12周時(shí)YAP陽性肝細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，而YAP陽性膽管樣細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，并分布在中央靜脈周圍的肝小葉中，與DR細(xì)胞的分布一致。提示在MCD以及TAA小鼠中，4 周時(shí)肝細(xì)胞中的YAP激活可能會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化膽管細(xì)胞并參與DR的發(fā)生發(fā)展。

與我們的結(jié)果相似，近年來肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化被認(rèn)為是DR的重要細(xì)胞來源。Nf2（YAP上游負(fù)性調(diào)控因子）肝細(xì)胞特異性敲除小鼠的譜系追蹤顯示，肝細(xì)胞內(nèi)的YAP激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為YAP陽性膽管細(xì)胞。在膽汁淤積性小鼠模型中YAP活性持續(xù)激活能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管樣細(xì)胞，參與DR發(fā)生。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中Notch通路的激活可介導(dǎo)肝細(xì)胞向膽管樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)DR發(fā)生。而Notch信號(hào)通路可作為YAP的下游效應(yīng)器調(diào)控肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管樣細(xì)胞。因此，我們推測(cè)在MCD和TAA飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中，YAP在肝上皮細(xì)胞的活性改變特征及其分布與DR發(fā)生分布的這種時(shí)空關(guān)系可能為YAP激活介導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管樣細(xì)胞并參與DR發(fā)生提供依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在NASH疾病早期肝細(xì)胞內(nèi)YAP激活并早于DR發(fā)生；另外YAP在肝上皮細(xì)胞活性改變特點(diǎn)及其分布與DR發(fā)生分布具有時(shí)空相關(guān)關(guān)系，同時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)YAP的激活可能誘導(dǎo)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為膽管樣細(xì)胞，參與DR發(fā)生。但本研究?jī)H在動(dòng)物模型中研究NASH疾病早期YAP活性變化特征及其與DR的時(shí)空關(guān)系，還需結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)確定肝細(xì)胞內(nèi)YAP和DR表型分子的表達(dá)與分布情況，進(jìn)一步探究這種時(shí)空關(guān)系演變的分子機(jī)制。