新型溫敏性重組人釉原蛋白載體與傳統(tǒng)丙二醇藻酸酯載體的體外測試效果比較

釉基質(zhì)蛋白在生物牙齒發(fā)育過程中充當(dāng)了礦化的有機(jī)支架，對羥基磷灰石晶體的沉積和形成至關(guān)重要，其中釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白的一種，占釉基質(zhì)蛋白含量約90%。研究表明釉基質(zhì)蛋白對特定細(xì)胞類型、炎癥介質(zhì)、牙齦組織血管的生成、口腔傷口愈合都有著不同層度的影響。目前唯一獲得FDA認(rèn)證并且應(yīng)用于臨床的釉基質(zhì)蛋白是瑞典Biora開發(fā)豬源性釉基質(zhì)蛋白藥物Emdogain，它是由豬源性釉基質(zhì)蛋白（EMD）和丙二醇藻酸酯（PGA）組成，外觀呈現(xiàn)凝膠狀的物質(zhì)。Emdogain已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療牙周疾病20多年，但隨著口腔疾病越來越復(fù)雜，傳統(tǒng)的PGA載體已不能滿足臨床治療的需求，如自身的機(jī)械強(qiáng)度不足，在牙周組織釋放濃度波動大、不能在傷口提供良好的成型條件、治療后需要服用抗生素抑制細(xì)菌感染牙周傷口。

有研究研發(fā)聚乙二醇和可降解聚酯組成的ABA型三嵌段共聚物（PCLA-PEG-PCLA）凝膠負(fù)載人重組釉原蛋白可促進(jìn)hPDLFs的增殖并上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。有學(xué)者采用層層自組裝技術(shù)對聚己內(nèi)酯紡絲膜的表面進(jìn)行修飾，構(gòu)建出一種能夠控制EMPs釋放的納米涂層修飾的聚己內(nèi)酯紡絲膜。目前的問題是許多載體的特性并不能滿足釉基質(zhì)蛋白在實際應(yīng)用中的情況，其中載體的表征與生物相容性是非常重要的標(biāo)準(zhǔn)。許多研究已報道CS 能提供良好的抗菌活性、生物相容性、生物降解性、溫度敏感特性和可逆凝膠化性質(zhì)。但以CS為載體負(fù)載rhAm的抗菌效果如何，表征是否適合負(fù)載釉基質(zhì)蛋白應(yīng)用于牙周治療，對比傳統(tǒng)的PGA載體在生物相容性上是否具有優(yōu)勢目前尚不清楚。

(4)水體的懸浮顆粒物粒徑不同，其相應(yīng)的光譜特征也有所差異[18-19]，水體粒徑垂直變化對水體遙感反射率有一定的影響[20-21]，如果不考慮其垂直變化，衛(wèi)星遙感反演懸浮顆粒物粒徑將會引起較大誤差，掌握湖泊懸浮顆粒物粒徑的時空分布可為衛(wèi)星遙感監(jiān)測水體信息提拱技術(shù)支持。

因此，本研究評價以CS為基礎(chǔ)的新型溫敏性載體和傳統(tǒng)PGA載體分別負(fù)載rhAm在表征、抗菌效果和生物相容性上的測試效果。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥95%，aladdin）；丙二醇藻酸酯（PGA，百思特）；β-甘油磷酸鈉（麥克林）；溶菌酶（索萊寶）；胎牛血清（Gibco）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；CCK8（Sigma-Aldrich）；青霉素－鏈霉素雙抗（Gibco）；SYBR QPCR Master Mix（Takara）；抗體：RUNX2（聯(lián)科生物）、Collagen I（Abcam）、β-catenin（Santa Cruz）、Ki67（BD bioscienes）、CyclinD1（CST）、β-actin、GAPDH（bioworld）；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（碧云天）。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料的制備 稱取1.0 g CS粉末溶于45 mL乙酸溶液（0.1 mol/L），室溫下攪拌2 h，高壓蒸汽滅菌。配制0.6 g/mL的βGP溶液，濾膜過濾除菌。在低溫條件下，在CS攪拌過程中逐滴加入βGP溶液并繼續(xù)攪拌15 min。低溫下加入rhAm至終濃度為20 μg/mL得到CS-βGP-rhAm凝膠。取3.3 g PGA溶于去離子水并定容至100 mL，高壓蒸汽滅菌，冷卻后加入rhAm攪拌均勻得到PGA-rhAm。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 hPDLFs（上海斯信生物），培養(yǎng)條件為含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的DMEM，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 溶脹率、pH值、凝固時間和相變動力學(xué)曲線測定分別取6%、8%、10%βGP制備的CS-βGP-rhAm于70 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥24 h后稱重（M），然后在蒸餾水中靜置48 h充分溶脹，用濾紙吸去表面的水分后稱重（M）。膜的溶脹率（Esw）＝（M-M）/M×100%。

1.2.4 體外降解率和緩釋率測定 分別取6%、8%、10%βGP 制備的CS-βGP-rhAm，稱量后加入pH 為7.0 的PBS，37 ℃搖床中緩慢振蕩，然后每隔1 d（共14 d）取100 μL的溶液，并補(bǔ)加100 μL的PBS。使用BCA試劑盒測定各個時間點的蛋白濃度，計算各時間點的累積藥物緩釋量。取以上組別的凝膠放入20 mL含10U/L溶菌酶和pH值為7.0的PBS緩沖液中，在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以100 r/min連續(xù)搖動，每2 d更換緩沖液。在預(yù)定時間點稱重并計算降解率。

采用倒置法觀察4%、6%、8%、10%βGP制備的CSβGP-rhAm溫敏特性，在37 ℃恒溫水浴箱中，每隔1 min取出玻璃瓶并倒置觀察凝膠的流動性，倒置15 s凝膠不流動的時間點計為凝固時間。

環(huán)境溫度對礦化垃圾反應(yīng)床穩(wěn)態(tài)運行性能具有較大影響，主要表現(xiàn)在影響污染物去除性能及床體水力滲透性能2個方面。

本文以CGDPA為基準(zhǔn),采用定量指標(biāo)評價IMERG終級產(chǎn)品的精度,包括相關(guān)系數(shù)ICC、均方根誤差I(lǐng)RMSE和相對偏差I(lǐng)RB,計算方法如下:

1.2.5 抗菌實驗 將金黃色葡萄球菌懸浮液調(diào)整至1×10CFU/mL，將6.0%βGP交聯(lián)制備的CS-βGP、CS-βGPrhAm 分別以體積比1∶30 與懸浮液混合，3.3%PGA、3.3%PGA-rhAm 分別以體積比1∶55與懸浮液混合，rhAm溶液與懸浮液混合至終濃度為20 μg/mL，實驗分為Control組、CS-βGP-rhAm組、CS-βGP組、PGA-rhAm組、PGA組，各組培養(yǎng)反應(yīng)30 min，然后進(jìn)行涂布實驗、細(xì)菌培養(yǎng)和平板菌落計數(shù)。

1.2.2 黏度測試 黏度計選擇合適的轉(zhuǎn)頭，在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速下測試不同濃度PGA的黏度值。

（2）本文應(yīng)該相應(yīng)的指數(shù)測算方法，從貿(mào)易競爭性和互補(bǔ)性兩個方面，對中約兩國經(jīng)貿(mào)合作程度進(jìn)行測算。結(jié)果顯示，中約兩國的貿(mào)易競爭性較弱，出口商品的差異化明顯，但是兩國貿(mào)易聯(lián)系不斷增強(qiáng)；在貿(mào)易互補(bǔ)性方面，中方出口約地方的貿(mào)易互補(bǔ)性表現(xiàn)較弱，相反，約方出口中方的貿(mào)易互補(bǔ)性相對較強(qiáng)?！耙粠б宦贰背h的有效實施定會拓寬兩國的經(jīng)貿(mào)合作領(lǐng)域，進(jìn)而加強(qiáng)兩國經(jīng)貿(mào)聯(lián)系度。

1.2.7 細(xì)胞增殖、劃痕實驗 將hPDLFs細(xì)胞（4×10/mL）添加到96孔板中，細(xì)胞貼壁后分別加入每組配制好的溶液，實驗分為Control組、CS-βGP-rhAm組、CS-βGP組、PGA-rhAm組、PGA組，每組5個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d、2 d、3 d。避光加入WST-8 溶液后在恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測量吸光值。

將CS-βGP-rhAm、CS-βGP 在37 ℃下凝固后以0.1 g/mL的濃度使用DMEM無菌浸泡獲得浸取液。將3.3%PGA、3.3%PGA-rhAm 加入DMEM 培養(yǎng)基使其PGA終濃度達(dá)到0.4 mg/mL。將每一組溶液測定rhAm的濃度，配制相應(yīng)濃度rhAm作為單獨實驗組。

將hPDLFs細(xì)胞（2.5×10/mL）添加到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞接近100%匯合時，使用200 μL槍頭劃痕，完成劃痕后用1×PBS洗去漂浮細(xì)胞，分別加入每組配制好的溶液，實驗分為Control組、CS-βGP-rhAm組、CS-βGP組、PGA-rhAm組、PGA組。48 h后顯微鏡拍下細(xì)胞遷移情況，imge J分析劃痕面積（0 h面積為A，48 h面積為B）。遷移率=[(A-B)/A]×100%。

CS、CS-βGP、CS-βGP-rhAm置于37 ℃恒溫水浴鍋，每隔1 min在分光光度計測定450 nm的吸光值，繪制相變動力學(xué)曲線并測定相應(yīng)pH值。

1.2.8 蛋白印跡分析檢測 按照說明書利用RIPA提取蛋白，BCA測定蛋白濃度，將定量樣品在SDS-PAGE凝膠中上樣、電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至NC膜，5%BSA封閉1 h。加入相應(yīng)I抗CyclinD1（1∶1000）、Ki67（1∶500）、RUNX2（1∶1000）、Collagen I（1∶2000）、β-catenin（1∶500）、GAPDH（1∶2000）、β-actin（1∶2000），4 ℃孵育過夜，洗膜3次，按1∶8000稀釋Ⅱ抗，孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J分析結(jié)果。

1.2.9 實時定量PCR檢測 根據(jù)Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，利用分光光度計測試RNA的A260/280，在1.8～2.0的樣品可用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR以管家基因GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以2法進(jìn)行分析，各引物序列（表1）。

1.2.10 堿性磷酸酶（ALP）染色 室溫下使用4%多聚甲醛適當(dāng)固定細(xì)胞，用1×PBS洗滌細(xì)胞3次，去除洗滌液后加入適量BCIP/NBT染色工作液。室溫避光孵育12 h，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌1～2次即可終止顯色應(yīng)，將樣品置于顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用GraphPad prism8.0軟件分析實驗結(jié)果，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較使用檢驗，多組比較則采用單因素方差分析，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

那道白光如天空中滑落的電，掛著尖銳的破空聲，準(zhǔn)確地插入了土狼王張開的大口中。他聽到土狼王的筋肉在白光的沖擊和擠壓下，傳出敗革一般的“撲撲”聲，又聽到包裹在筋肉內(nèi)的骨頭，在與白光的碰撞和摩擦中，發(fā)出“咔咔”的碎裂聲。然后，白光停在了土狼王的體內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 PGA-rhAm制備和黏度測試

鑒于臨床制劑黏度和豬源性釉基質(zhì)蛋白藥物Emdogain黏度度值約為3.0～4.0 Pa·s，本研究醫(yī)用PGA的濃度與黏度值呈正相關(guān)，在3.3%、3.4%PGA濃度下能夠達(dá)到3.054±0.0263 Pa·s、3.463±0.0458 Pa·s，當(dāng)以3.3%PGA結(jié)合rhAm的時候能夠保持3.262±0.055 Pa·s（圖1A、B）。

由表4可知，42個待評價水樣中Ⅰ類水質(zhì)樣本數(shù)為7個，占總數(shù)量的16.67%；Ⅱ類水質(zhì)樣本數(shù)為11個，占總數(shù)量的26.19%；Ⅲ類水質(zhì)樣本數(shù)為8個，占總數(shù)量的19.05%；Ⅳ類水質(zhì)樣本數(shù)為12個，占總數(shù)量的28.57%；Ⅴ類水質(zhì)樣本數(shù)為4個，占總數(shù)量的9.52%。優(yōu)于地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)比例約為62%，其余水質(zhì)均較差。由此可知，榆林市礦區(qū)周邊地下水水質(zhì)受到一定的污染。由各因子的權(quán)重W可知，主要的污染因子為NO-3，其次為SO2-4、NO-2，總硬度和TDS受污染較小。

2.2 CS-βGP-rhAm凝固時間、溶脹和pH值測試

凝固實驗顯示，6%、8%、10%βGP的CS凝膠凝固時間分別是5 min、6 min、6 min，并且測試6%βGP-CS凝膠的相變動力學(xué)曲線，6%βGP-CS 和6%βGP-CSrhAm分別從5、6 min起A值開始趨向穩(wěn)定（圖2AB）。6%βGP-CS相比8%和10%βGP-CS具有較高的溶脹率（＜0.01，圖2C）。CS 溶于酸性溶液的pH 值為5.45±0.04，當(dāng)CS結(jié)合4%、6%、8%、10%βGP的時候可以將水凝膠的pH分別提高為6.73±0.02、6.96±0.02、7.15±0.02、7.16±0.00，并且結(jié)合rhAm后和凝固后的pH值無明顯變化（圖2D）。

2.3 CS-βGP-rhAm體外降解和緩釋rhAm性能的檢測

觀察金黃色葡萄球菌菌落的數(shù)量，相比對照組，CS-βGP能抑制金黃色葡萄球菌的生長，PGA則對于金黃色葡萄球菌的抑制效果不及CS-βGP（＜0.001），當(dāng)CS-βGP負(fù)載rhAm后并不影響自身的抗菌特性，PGA負(fù)載rhAm后對抑制金黃色葡萄球菌的生長沒明顯變化（圖4）。

2.4 抗菌效果檢測

本實驗通過測試3種不同濃度的βGP-CS凝膠在7 d內(nèi)緩釋rhAm的比例，7 d結(jié)果顯示（6%、8%、10%）βGP-CS-rhAm凝膠藥物緩釋比例分別約達(dá)到58.4%、63.9%、70.0%。同時檢測6%βGP-CS-rhAm在15 d內(nèi)藥物緩釋的情況，結(jié)果顯示15 d內(nèi)凝膠緩釋藥物的比例約達(dá)到70.9%（圖3A、B）。模擬口腔環(huán)境測試（6%、8%、10%）βGP-CS-rhAm 3周內(nèi)的降解情況，結(jié)果顯示隨著時間的增加，凝膠的降解率越高，6%βGP-CS-rhAm凝膠保留率最高約達(dá)到20.1%，其余為10.4%和7.3%（圖3C）。

2.5 細(xì)胞增殖、遷移實驗

CCK8法結(jié)果顯示，第1天與對照組相比，CS-βGPrhAm、PGA-rhAm、rhAm 的A 值均有增加（＜0.01），PGA-rhAm相比CS-βGP-rhAm的A值更高（＜0.01）。第2天，CS-βGP（＜0.01）和CS-βGP-rhAm（＜0.001）相比對照組A值高，CS-βGP 負(fù)載rhAm后相比rhAm組的A 值高（＜0.01），CS-βGP-rhAm 的A 值高于PGArhAm（＜0.001）。第3天與第2天的趨勢一致，CS-βGP相比對照組A值提高更加顯著（＜0.001，圖5A）。蛋白水平上，CS-βGP-rhAm組相比對照組（＜0.001）、PGArhAm（＜0.01）組高表達(dá)Ki67，同時CS-βGP-rhAm 組（＜0.05）和CS-βGP 組（＜0.05）低表達(dá)CyclinD1（圖5B）。劃痕實驗顯示，CS-βGP、rhAm 和PGA組48 h內(nèi)沒有明顯的促遷移作用，CS-βGP-rhAm和PGA-rhAm組相比于對照組能促進(jìn)hPDLFs遷移（＜0.01），CS-βGP負(fù)載rhAm后相比rhAm組能夠促進(jìn)細(xì)胞在劃痕中的遷移（＜0.05），但是rhAm與PGA結(jié)合后沒明顯的增益效果，CS-βGP-rhAm組相比PGA-rhAm組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5C）。

2.6 細(xì)胞成骨分化實驗

不同條件對hPDLFs 處理7 d 后，與對照組相比，CS-βGP 負(fù)載rhAm 上調(diào)collagen I（＜0.01）、RUNX2（＜0.001）、β-catenin（＜0.05）蛋白表達(dá)，PGA 負(fù)載rhAm對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響不顯著。RT-qPCR檢測各實驗組對RUNX2、OCN 基因表達(dá)水平的影響，RUNX2基因表達(dá)結(jié)果顯示，和對照組相比，各實驗組均能上調(diào)RUNX2基因的表達(dá)（＜0.05）。相比CS-βGP單獨組，負(fù)載rhAm后能上調(diào)RUNX2基因的表達(dá)（＜0.01），并且CS-βGP-rhAm 組比PGA-rhAm 組更能上調(diào)RUNX2表達(dá)（＜0.05）。OCN基因表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，各實驗組均能提高OCN 基因的表達(dá)（＜0.05）。相比CS-βGP單獨組，負(fù)載rhAm后能上調(diào)OCN基因的表達(dá)（＜0.05），并且CS-βGP-rhAm 組比PGArhAm組更能上調(diào)OCN表達(dá)（＜0.05，圖6A、B）。利用堿性磷酸酶試劑盒對各實驗組hPDLFs進(jìn)行染色，4 d和7 d的染色結(jié)果顯示，rhAm和CS-βGP組染色數(shù)量相比對照組多，PGA組無明顯變化，CS-βGP負(fù)載rhAm后細(xì)胞染色強(qiáng)度和數(shù)量均高于對照組和PGA-rhAm組（圖6C）。

3 討論

臨床治療中通過注射Emdogain在牙周缺損部位并配合常規(guī)縫合手術(shù)使藥物發(fā)揮長期的療效。Emdogain在使用的過程中由于其載體PGA在37 ℃下仍然維持流動相，給手術(shù)的縫合帶來不便。已有研究報道一種以乙二醇甲殼素為基礎(chǔ)的熱響應(yīng)水凝膠支架，它能在30 s內(nèi)由流動相轉(zhuǎn)為非流動相，但短時間內(nèi)的成型可能不便于手術(shù)縫合。本研究制備的CS-βGP-rhAm在37 ℃下5～6 min成型，推測能在口腔溫度影響下對翻瓣手術(shù)后形成的缺口而成型，從而提高手術(shù)的效率。同時CS-βGP相比PGA具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，具有機(jī)械強(qiáng)度的植入體一般有利于相關(guān)細(xì)胞附著從而有利于成骨分化。傳統(tǒng)的PGA載體負(fù)載藥物有增稠的效果，但是藥物緩釋情況并不穩(wěn)定。關(guān)于藥物在載體的緩釋時間，有研究表明進(jìn)行牙周手術(shù)后，上皮細(xì)胞在第2周內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力，遞送載體的緩釋能力適合維持在2周以上，CS-βGP負(fù)載rhAm后具有至少15 d緩釋和21 d的降解能力。有研究也利用溫敏性殼聚糖凝膠作為載體負(fù)載胰島素，48 h緩釋率已經(jīng)達(dá)到50%。而本研究的CS-βGP在48 h緩釋率達(dá)到40%，這種差異可能與釋放因子的相對分子質(zhì)量有關(guān)，胰島素的相對分子質(zhì)量約為6000，而rhAm相對分子質(zhì)量約為25 000。

由圖4可知，料液比改變時，藕片硬度以及感官評分基本不變，綜上可以推斷得出料液比不是影響硬度的主要因素，因此在后續(xù)實驗中不作為變量考慮。

符合臨近水源，遺址點分布較為密集且出土實物文本較多較全，代表性較強(qiáng)，可以作為昂昂溪文化突出代表的是五福及滕家崗等處遺址。

患者在使用Emdogain治療后需要定期使用抗生素，目的是為了預(yù)防傷口發(fā)生感染，這些很大程度與微生物定植相關(guān)。盡管PGA對牙齦卟啉單胞菌有顯著的抑制作用，但對非致病性革蘭氏陽性菌沒有顯著抑制作用。同時研究表明金黃色葡萄球菌是種植體周圍感染的主要需氧菌，一旦微生物形成生物膜將大大降低臨床的治療效果。殼聚糖已被證實對牙齦卟啉菌的生長有抑制作用，本研究也證明CS-βGP相比PGA更能夠抑制金黃色葡萄球菌生長。

修復(fù)牙周組織是牙周缺損治療的目標(biāo)，hPDLFs的增殖、遷移和成骨分化能力對于加速受損組織的恢復(fù)非常重要。CS-βGP促進(jìn)hPDLFs增殖和遷移，rhAm和CS-βGP聯(lián)用有明顯的增益效果，PGA負(fù)載rhAm對細(xì)胞的增益效果沒有前者明顯。有研究表明羥基磷灰石與CS 混合可得到介孔結(jié)構(gòu)支架，發(fā)現(xiàn)這種支架對hPDLFs沒有毒性，但并沒有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果。ALP是成骨樣細(xì)胞的標(biāo)注物，相比PGA，CS-βGP可以誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)ALP，同時CS-βGP負(fù)載rhAm后也明顯上調(diào)相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究對CS-βGP和PGA在表征、抗菌效果和生物相容性三方面進(jìn)行效果評價，實驗表明CSβGP具有替代傳統(tǒng)PGA載體的潛力。