沉默A549 細(xì)胞中的CD46 和DSG2 可抑制人3 型和7 型腺病毒的侵入及IL-8的釋放

人腺病毒（HAdV）為無包膜的線性雙鏈DNA 病毒，其結(jié)構(gòu)分為病毒核心及衣殼兩部分，衣殼呈二十面體結(jié)構(gòu)，主要由五鄰體、六鄰體和纖毛蛋白3種蛋白構(gòu)成。HAdV為兒童急性呼吸道感染的常見病原之一，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。腺病毒肺炎是世界范圍內(nèi)小于5歲兒童患病率及死亡率最高的病毒性肺炎，死亡率最高可達(dá)50%。腺病毒肺炎引起的持續(xù)性高熱及呼吸衰竭的發(fā)生率占呼吸道常見病毒的首位，常伴有危及生命的嚴(yán)重并發(fā)癥，如呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、肺出血、腦炎等。迄今為止，腺病毒分為7個(gè)亞屬（A-G），包括100多個(gè)基因型；其中B亞屬中的人腺病毒3型（HAdV-3）、人腺病毒7型（HAdV-7）是引起全球范圍內(nèi)兒童重癥腺病毒肺炎的主要病原。然而，目前臨床上尚無針對(duì)HAdV的特異性有效治療方法，因此，對(duì)于腺病毒感染的病毒復(fù)制和炎癥因子干預(yù)的相關(guān)機(jī)制研究對(duì)于制定抗腺病毒策略至關(guān)重要。

既往研究多重點(diǎn)關(guān)注病毒復(fù)制周期進(jìn)入后的階段，如對(duì)腺病毒入胞后早期、中期和晚期病毒基因（包括E1A、IVa2、hexon等）沉默對(duì)體外腺病毒復(fù)制的影響。同時(shí)，抗腺病毒藥物（包括西多福韋）的設(shè)計(jì)也主要靶向病毒入胞后的復(fù)制。腺病毒纖毛蛋白與相應(yīng)的受體結(jié)合后介導(dǎo)腺病毒粘附靶細(xì)胞，啟動(dòng)胞吞作用，促使HAdV 入胞，這是腺病毒感染致病的第一步。腺病毒的纖毛蛋白與受體結(jié)合入胞是病毒感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究報(bào)道三價(jià)化合物ME0322能夠有效地抑制37型腺病毒纖毛蛋白結(jié)合唾液酸受體，茶素沒食子酸酯（EGCG）可以通過與硫酸乙酰肝素或唾液酸部分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合腺病毒粒子。但以上研究均未證明阻斷受體與病毒結(jié)合后的效應(yīng)以及具體機(jī)制。

CD46是識(shí)別B亞屬腺病毒纖毛蛋白的受體之一，B亞屬腺病毒纖毛蛋白與CD46 結(jié)合觸發(fā)了感染。早期研究認(rèn)為CD46 同時(shí)做為HAdV-3 和HAdV-7 的受體近年來橋粒芯蛋白（DSG2）被認(rèn)為是與B亞屬的3、7、11、14、55型腺病毒結(jié)合的主要高親和力受體。HAdV-3和HAdV-7具有嗜氣道上皮細(xì)胞特性，直接與宿主受體CD46、DSG2特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒的初始接觸并促進(jìn)入胞，從而觸發(fā)后續(xù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起呼吸道感染。本文以A549 細(xì)胞為研究對(duì)象，并通過siRNA 的干擾分析沉默CD46、DSG2 對(duì)HAdV-3、HAdV-7的入胞及炎癥因子釋放的影響，說明CD46、DSG2是抗腺病毒感染的潛在靶點(diǎn)，為針對(duì)腺病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合設(shè)計(jì)抗腺病毒藥物以及疫苗的設(shè)計(jì)和改進(jìn)提供參考。

同時(shí)，開設(shè)客觀評(píng)標(biāo)分值體系，采用綜合評(píng)分法，可以根據(jù)維保標(biāo)的物的實(shí)際情況，設(shè)置不同評(píng)審要素，如維修工程師資質(zhì)、經(jīng)驗(yàn)、用戶評(píng)價(jià)和PDCA記錄等客觀指標(biāo)，“從而最大程度減少對(duì)投標(biāo)人維保方案的主觀判斷，避免投標(biāo)人僅因文件做得好的印象分中標(biāo)?！?/p>

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

A549細(xì)胞株（中國(guó)社會(huì)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所兒童呼吸病學(xué)研究室穩(wěn)定傳代后保存提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素（Gibco）。氯化銫（默克），氯化銫離心柱（Bio-Rad）。病毒DNA提取試劑盒（Qiagen）；HAdV-3、7標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和TaqMan熒光探針由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，qRT-PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司引物合成，SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。CD46、DSG2的siRNA干擾序列（siRNA-CD46、DGS2）及非特異性序列（siRNA-CD46、DGS2 Nc）由Santa Cruz公司設(shè)計(jì)并合成，轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基（Santa Cruz），siRNA-CD46（h）（sc-35004），siRNA-DSG2（h）（sc-35226）。BCA 蛋白定量試劑盒、一抗稀釋液及快速封閉液（碧云天生物技術(shù)有限公司），全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。一抗CD46（Abcam）、DSG2(成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；HAdV-3抗體、HAdV-7抗體為廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予；Western blot山羊抗兔二抗（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司），免疫熒光山羊抗兔Cy3二抗（博士德生物工程有限公司）、驢抗小鼠555 二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）。人IL-8 ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 病毒分離與純化

使用Graphpad Prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組比較用采用單因素方差分析，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

處理4、龍粳40，株行距為10cm*30cm。水整地時(shí)施入二胺6公斤、50%硫酸鉀3公斤、尿素2公斤。插秧時(shí)側(cè)深施肥時(shí)加入15公斤云天化復(fù)合肥。

將存放于液氮的A549細(xì)胞系復(fù)蘇傳代，DMEM 高糖培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%雙抗，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，做傳代和轉(zhuǎn)染處理。A549細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于孔板中，配制如下溶液：溶液A：5 μL siRNA-CD46（10 μL siRNADSG2）、5 μL siRNA-CD46 Nc（10 μL siRNA-DSG2 Nc）加入到100 μL siRNA transfection Medium。溶液B：5 μL siRNA transfection reagent 加入到100 μL siRNA transfection Medium。然后將配制好的溶液A直接加入到溶液B中，輕輕混勻后室溫孵育45 min。將0.8 mL siRNA transfection Medium直接加入到溶液A和溶液B 的混合液中，輕輕混勻后分別加入到siRNA-CD46（siRNA-DSG2）處理孔、siRNA-Nc陰性對(duì)照孔，空白對(duì)照孔則只加DMEM培養(yǎng)基，每孔加入所需培養(yǎng)基的一半。7 h后將剩余一半DMEM培養(yǎng)基（20%胎牛血清和2%抗生素）加入到孔板中的每一孔并孵育24 h，24 h后更換新的（10%胎牛血清和1%抗生素）DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA 后CD46、DSG2表達(dá)

將細(xì)胞爬片置于12孔板，A549細(xì)胞（2.5×10/孔）轉(zhuǎn)染siRNA-CD46 24 h，siRNA-DSG2 48 h 后吸棄舊液，以MOI=2000 vp/cell接種HAdV-3、HAdV-7后，用2%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO孵育0.5、2 h，然后用PBS漂洗10 min×3次，在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，5%BSA封閉30 min，隨后加入CD46兔單克隆抗體（1∶200 稀釋）或DSG-2（AH12.2）兔多克隆抗體（1∶100 稀釋），50 μL 的HAdV3（3E6-FITC）單抗（1∶50 稀釋）或HAdV7（6F3-FITC）單抗（1∶100 稀釋）并放入濕盒中，4 ℃孵育過夜；第2天用PBS漂洗10 min×3次，山羊抗兔Cy3 二抗（1∶500 稀釋）或驢抗小鼠555二抗（1∶500 稀釋），室溫避光孵育1 h；經(jīng)DAPI復(fù)染后，貼片，封片，然后在激光共聚焦掃描顯微鏡下采集圖像。

2017年的世界互聯(lián)網(wǎng)大會(huì)上，人們還在暢想“人工智能讓生活更美好”，2018年，人們已經(jīng)開始著眼“人工智能的融合發(fā)展的新機(jī)遇”?！叭诤稀笔侨祟悶槲磥砻篮蒙顚ふ业牡缆?，而在這條路上，人工智能帶領(lǐng)人類會(huì)走得更遠(yuǎn)，走向更開闊的生存空間，讓一個(gè)又一個(gè)“可能”與“創(chuàng)見”在人們的生活里落地生根，舒枝展葉。

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在感染早期，HAdV-3、HAdV-7與CD46、DSG2明顯共定位（圖1），HAdV-3、HAdV-7直接與其受體CD46、DSG2結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。

1.5 免疫熒光檢測(cè)病毒與受體結(jié)合情況

A549細(xì)胞（2.5×10/孔）鋪于6孔板，轉(zhuǎn)染siRNACD46 24 h，siRNA-DSG2 48 h后，用凱基全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，并以BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組總蛋白濃度。蛋白質(zhì)在10%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，快速封閉液封閉15 min 后，孵育一抗（CD46，1∶5000；DSG2，1∶2000）于4 ℃過夜，取出膜以TBST 洗脫后，室溫孵育二抗（GAPDH，1∶10 000），使用化學(xué)發(fā)光（ECL）法獲得蛋白條帶，用于比較分析。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)人3、7型腺病毒拷貝數(shù)

siRNA-CD46、siRNA-DSG2分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24、48 h后，siRNA-CD46和siRNA-DSG2組與相應(yīng)的siRNA-NC組比較，以及Control組比較，CD46、DSG2表達(dá)水平下調(diào)，而siRNA-NC組與Control組的CD46、DSG2表達(dá)無明顯差異（圖2A）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

HAdV-3（CQ5291）、HAdV-7（CQ4411）臨床株分離于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科腺病毒感染的住院患兒鼻咽抽吸物（NPAs），長(zhǎng)期液氮保存。采用用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，測(cè)定值，計(jì)算病毒濃度（VP/mL）=×dilution×10，本研究中的HAdV-3和HAdV-7滴度為5×10VP/mL和3×10VP/mL。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒與受體CD46、DSG2結(jié)合促進(jìn)病毒的入胞

互動(dòng)性是推特的又一大特性。傳統(tǒng)媒體時(shí)代，用戶大多數(shù)時(shí)候系被動(dòng)接受內(nèi)容，用戶和信息發(fā)布者之間存在一定的互動(dòng)可能性，如讀者可給報(bào)社編輯寫信或通過收視率向電視臺(tái)作出反饋，但該類模式不對(duì)等程度較高，且實(shí)現(xiàn)較為不便。推特大大提高了用戶間進(jìn)行互動(dòng)的便利。任一推特用戶均可通過“@”、評(píng)論、帶評(píng)論轉(zhuǎn)發(fā)、私信等手段便捷地向其他用戶發(fā)起互動(dòng)，這一行為實(shí)時(shí)傳達(dá)至對(duì)方，對(duì)方也可直接回應(yīng)，這一過程易于實(shí)現(xiàn)，可操作性強(qiáng)。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA-CD46、siRNA-DSG2 降低腺病毒拷貝數(shù)

A549細(xì)胞（2.5×10/孔）鋪于6孔板，轉(zhuǎn)染siRNACD46 24 h，siRNA-DSG2 48 h后，以MOI為l vp/cell分別接種HAdV-3、HAdV-7后，用2%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO孵育2、6、12、24 h，然后按照Qiagen DNA提取試劑盒的說明書提取病毒DNA，qRT-PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)。腺病毒qRT-PCR的引物和探針序列、循環(huán)條件分別參照文獻(xiàn)［25,26］。引物、探針序列（表1）。配制qRT-PCR反應(yīng)體系:HAdV-3：mix 10 μL，上游引物0.6 μL，下游引物1.2 μL，探針0.4 μL，DNA 2.0 μL，dd HO 5.8 μL，合計(jì)20 μL。HAdV-7：mix 10 μL，上游引物1.2 μL，下游引物0.6 μL，探針0.1 μL，DNA 2.0 μL，dd HO 6.1 μL，共計(jì)20 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃3 min；95 ℃15 s；60 ℃1 min（重復(fù)44個(gè)循環(huán)）。

HAdV-3、HAdV-7感染A549細(xì)胞后，病毒拷貝數(shù)呈時(shí)間依賴性增加（＜0.01，圖2B-E），且HAdV-7的病毒拷貝數(shù)高于HAdV-3。轉(zhuǎn)染siRNA-CD46后6、12、24 h，HAdV-3、HAdV-7 病毒滴度均下降（HAdV-3:6 h，＜0.05；12、24 h，＜0.0001；HAdV-7：2 h，＜0.01；6 h，＜0.001，12、24 h，＜0.0001，圖2B、C）。在各時(shí)間點(diǎn)，與HAdV-3、HAdV-7組相比，siRNA-CD46 Nc組的病毒拷貝數(shù)無明顯變化。與HAdV-3、HAdV-7組相比，siRNADSG2 Nc組的病毒拷貝數(shù)與病毒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），而干擾DSG2 后2、6、12、24 h 顯著降低了HAdV-3、HAdV-7的病毒拷貝數(shù)（＜0.0001，圖2D～E）。沉默CD46、DSG2，HAdV-7的拷貝數(shù)降低比例均大于HAdV-3：沉默CD46，HAdV-7的拷貝數(shù)在2、6、12、24 h分別減低75.54%、72.36%、81.97%、88.18%，HAdV-3的拷貝數(shù)在2、6、12、24 h 分別減低65.71%、69.16%、67.09%、73.71%；沉默DGS2，HAdV-7感染后2、6、12、24 h 的拷貝數(shù)分別降低88.42%、87.17%、86.38%、87.78%，HAdV-3 的拷貝數(shù)在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別降低55.85%、77.57%、78.10%、73.56%。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA-CD46、siRNA-DSG2抑制腺病毒感染誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生

HAdV-3、HAdV-7感染A549細(xì)胞后2、6 h，與非感染Mock infection組比較，炎癥因子IL-8隨時(shí)間延長(zhǎng)釋放增加（＜0.0001，圖3）；且HAdV-7感染后較HAdV-3產(chǎn)生更高水平IL-8。siRNA干擾CD46后降低HAdV-3、HAdV-7 感染誘導(dǎo)的IL-8 釋放（＜0.0001，圖3A、B）。同時(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA-DSG2 后，IL-8 的產(chǎn)生也明顯下降（＜0.0001，圖3C、D）。

3 討論

人腺病毒是兒童呼吸道感染最常見的病毒病原之一，而3、7型腺病毒通常與重癥感染和嚴(yán)重暴發(fā)有關(guān)。腺病毒纖毛蛋白與其受體結(jié)合啟動(dòng)了病毒感染靶細(xì)胞的過程，B亞屬的3、7型腺病毒主要是纖毛蛋白通過與受體CD46、DSG2 結(jié)合作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HAdV-7和HAdV-3基因序列差異主要在纖毛蛋白上。為此，本研究從病毒與受體結(jié)合角度進(jìn)一步探討沉默受體CD46、DSG2對(duì)3、7型腺病毒感染的影響。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在腺病毒感染早期，HAdV-3、HAdV-7與其主要粘附受體CD46、DSG-2結(jié)合后，腺病毒在胞漿、胞核共定位均增加，胞漿尤為明顯，表明HAdV-3、HAdV-7 與細(xì)胞表面受體CD46、DSG-2結(jié)合是腺病毒內(nèi)化的關(guān)鍵步驟。由于病毒受體不存在變異的特性,阻斷宿主細(xì)胞受體與病毒的結(jié)合以及抑制病毒蛋白的入胞可能是一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。在其他病毒研究中發(fā)現(xiàn)，連花清瘟可能通過阻斷病毒與宿主受體結(jié)合發(fā)揮抗病毒作用；CXCR 拮抗劑Plerixafor（AMD3100）能夠阻斷HIV 與其共受體CXCR4相互作用而抑制HIV感染；抗精神病藥物，尤其是吩噻嗪類藥物，可以顯著阻斷SARS-CoV-2 與ACE2的結(jié)合可能是防治SARS-CoV-2感染的有效藥物。本研究通過特異性的siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，有效沉默A549細(xì)胞膜表面的受體CD46、DSG2后感染HAdV-3、HAdV-7，研究顯示無論是使用siRNA-CD46 還是siRNA-DSG2 后，腺病毒拷貝數(shù)較沉默前均明顯下降，結(jié)果說明siRNA-CD46、siRNA-DSG2 有效阻斷HAdV-3、HAdV-7 與其受體結(jié)合，從而使病毒入胞減少。腺病毒感染靶細(xì)胞同時(shí)還啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)，在某些情況下，過度的細(xì)胞因子釋放，如IL-6、IL-8或TNF-α，可引起嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)甚至多器官功能障礙。本研究中，HAdV-3、HAdV-7感染A549細(xì)胞后，病毒拷貝數(shù)及IL-8 的產(chǎn)生明顯增加，且HAdV-7 感染后在A549中病毒拷貝數(shù)及IL-8的水平高于HAdV-3，這與我們前期發(fā)現(xiàn)HAdV-7比HAdV-3感染更易引起重癥肺炎和嚴(yán)重的細(xì)胞因子反應(yīng)及研究報(bào)道的HAdV-7感染人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8比HAdV-3多一致。本研究發(fā)現(xiàn)沉默CD46、DSG2后能夠顯著抑制HAdV-3、HAdV-7誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生；另外，沉默CD46、DSG2后，HAdV-7干擾組產(chǎn)生IL-8水平仍較HAdV-3 干擾組高，這一結(jié)果可能有助于解釋HAdV-7感染后病情重于HAdV-3感染這一臨床現(xiàn)象。

目前關(guān)于腺病毒的研究中臨床研究占大多數(shù)，對(duì)于其基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究報(bào)道較少，以往對(duì)抗腺病毒的研究主要在對(duì)腺病毒早期基因和晚期基因的干擾方面，而腺病毒與受體結(jié)合是感染的第一步，針對(duì)病毒進(jìn)入的抗病毒藥物可以從源頭上防止病毒感染細(xì)胞，而且還避免了細(xì)胞內(nèi)藥物輸送的需要，防止腺病毒與受體結(jié)合可以有效阻止病毒感染、細(xì)胞損傷和后續(xù)的細(xì)胞因子釋放。本研究通過A549細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，證明阻斷腺病毒結(jié)合的受體從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞并降低炎癥因子的產(chǎn)生，由此，可針對(duì)siRNA或者其他分子干預(yù)阻斷腺病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合設(shè)計(jì)抗腺病毒藥物；同時(shí)，病毒蛋白中的受體結(jié)合區(qū)相對(duì)不變，也可以對(duì)其設(shè)計(jì)或改進(jìn)疫苗作為預(yù)防感染的靶點(diǎn)。然而，這些防治方法亟需我們更深入地了解病毒與受體的相互作用機(jī)制，包括確定復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等仍待深入研究。此外，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也是本研究的局限性之一，這主要是由于人腺病毒感染宿主具有高度的種屬特異性，只能在自然宿主細(xì)胞中進(jìn)行有效復(fù)制，而人腺病毒的復(fù)制和表達(dá)在其他種屬細(xì)胞中往往受到限制。故缺乏可支持腺病毒感染/致病的動(dòng)物模型也是抗腺病毒藥物研究及致病機(jī)制研究進(jìn)展緩慢的主要原因之一。近年來有中國(guó)樹鼩以及一些人類細(xì)胞、組織和干細(xì)胞人源化小鼠作為允許感染動(dòng)物模型進(jìn)行人腺病毒相關(guān)研究。本課題組也在積極構(gòu)建人源化CD46小鼠肺部感染模型，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍待運(yùn)用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.針對(duì)人員分工控制不合理，對(duì)于物資采購(gòu)和驗(yàn)收這兩個(gè)崗位，要建立崗位責(zé)任制，采購(gòu)人員的具體工作，采購(gòu)人員和用戶的責(zé)任和權(quán)利，保護(hù)學(xué)校和設(shè)備用戶的權(quán)益。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證明沉默CD46、DSG2表達(dá)后阻斷了HAdV-3、HAdV-7的病毒侵入以及感染誘導(dǎo)的IL-8釋放，以期為選擇抗病毒藥物靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)新型疫苗提供參考思路。