MiRNA-26a通過調(diào)控結(jié)締組織生長因子緩解血管平滑肌細(xì)胞的鈣化

血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓、血管損傷等普遍存在的病理表現(xiàn)。其主要特征為血管壁僵硬性增加，順應(yīng)性降低，易導(dǎo)致心肌缺血、左心室肥大和心力衰竭，引發(fā)血栓形成、斑塊破裂，是心腦血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的重要因素之一。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是一種富含半胱氨酸的多肽，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、促纖維化因子和血管生成因子中起重要作用。這種肽可以從各種細(xì)胞系中釋放，包括纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。MicroRNA是一個小的非編碼單鏈RNA家族，為了調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，miRNA可以與特定的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合。許多研究報道，miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、激素分泌和個體發(fā)育等生物學(xué)活動。據(jù)報道m(xù)iRNA-26a在不同來源的細(xì)胞類型中對細(xì)胞命運和存活產(chǎn)生不同的影響。miRNA-26a被認(rèn)為是骨骼肌生成的有效誘導(dǎo)劑和增殖性肝細(xì)胞癌和淋巴瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期停滯的促進(jìn)劑。miRNA-26a能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，同時抑制細(xì)胞分化和凋亡，并改變TGF-β途徑的信號傳導(dǎo)。然而miRNA-26a在血管鈣化過程中是否作用于其他基因并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用還未見報道。本實驗通過調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子研究miRNA-26a對血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響，明確miRNA-26a在血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用。以期為血管平滑肌細(xì)胞鈣化的治療提供新的理論依據(jù)及治療思路。

圖紙會審工作對工程質(zhì)量有著直接影響，要引起足夠的重視。在審查過程中，一定要注意細(xì)節(jié)方面，避免出現(xiàn)的錯誤，將所有問題都解決掉，真正意義上做到萬無一失。過程中要做好記錄，發(fā)現(xiàn)其中存在不足地方，便于后期的完善，從而提高圖紙的科學(xué)合理性，為施工提供正確的指導(dǎo)，確保在工期之內(nèi)完成。另外造價預(yù)算也是很重要的，制定一份詳細(xì)計劃，對資金進(jìn)行合理分配，保證發(fā)揮出有效的作用，防止前期投入過多，后期施工出現(xiàn)麻煩等問題。會審人員要認(rèn)真負(fù)責(zé)，樹立起求真務(wù)實的態(tài)度，再小的問題都要處理，為施工開展做好充足的準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞A7r5，購買于中科院上海細(xì)胞庫。DMEM（Gibco，C11995500BT）；胎牛血清（TBD，TBD11HT）；PBA、0.25%胰蛋白酶（雷根）；BGP（Sigma）；甲醛（麥克林）；茜素紅法鈣質(zhì)染色試劑盒（上海歌凡）；Trizol（Ambion）；SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems）；Ologi (dT) 18 Premer、PrimeScript IIRTase、Recombinant Rnase Inhibitor（TAKARA）；堿性磷酸酶（ALP）測試盒（南京建成，A059-1-1）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（solarbio），兔抗OPG、OPN、BMP-2、Collagen II（Abcam）；兔抗GAPDH和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（bioswamp）。

1.2 方法

1.2.1 A7r5 鈣化模型構(gòu)建 A7r5 細(xì)胞在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5%CO中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于12 孔板中培養(yǎng)過夜。鈣化培養(yǎng)基（CM；DMEM補充有10 mmol/L β-甘油磷酸鹽（BGP）和3 mmol/L CaCl誘導(dǎo)VSMC 細(xì)胞鈣化，誘導(dǎo)0、12、24、48、72 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-26a mimic和inhibitor及效率鑒定轉(zhuǎn)染前24 h，在2 mL完全培養(yǎng)基中接種5×10細(xì)胞，種于6 孔板，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為90%。取100 pmol miRNA稀釋于250 μL Opti-MEM中，輕輕吹吸5次混勻。取5 μL LipofectamineRNAiMAX稀釋于250 μL Opti-MEM 中，將兩液體混勻，室溫孵育20 min。將500 μL復(fù)合物加到細(xì)胞中，搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染4 h后換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 實驗分組及處理 將細(xì)胞分為5 組：正常對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組VSMC 細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化；模型+AR234960組的VSMC細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，加入10 μmol·L的AR234960 激動劑干預(yù)12 h；AR234960+miR-26a mimic組的VSMC細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，先用10 μmol·L的AR234960激動劑處理12 h，再轉(zhuǎn)染miR-26a mimic；miR-26a mimic組的VSMC細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后轉(zhuǎn)染mimic。

社會實踐是高校人才培養(yǎng)過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié),實踐基地為學(xué)生將來順利適應(yīng)社會提供了重要平臺。高校應(yīng)該與用人單位建立長期的聯(lián)系，通過與城市街道、企事業(yè)單位、社會機構(gòu)等的聯(lián)系，探索有利于幫助學(xué)生提高社會競爭力的合作方式，建立一批有法律保障的、穩(wěn)定地、可持續(xù)的社會實踐基地。另外,還可以聘請一些優(yōu)秀教師共同參與,為社會實踐基地的建設(shè)提供技術(shù)服務(wù)和智力支持。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較使用單因素方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

除公共課和理論性很強的基礎(chǔ)課外，其他課程都是校企雙方共同授課，校內(nèi)教師講授基本理論，企業(yè)老師講授專業(yè)技能。以草坪養(yǎng)護(hù)方向的核心課程《高爾夫球場草坪建植與養(yǎng)護(hù)》為例，本門課程理論部分由校內(nèi)教師講授，實踐部分在企業(yè)完成，學(xué)生學(xué)到的不是單一的操作技能，而是整個草坪建植養(yǎng)護(hù)的綜合技能，經(jīng)過一個周期的學(xué)習(xí)，真正做到了理論和實踐相結(jié)合，在掌握了高爾夫球場草坪草養(yǎng)護(hù)要點的基礎(chǔ)上，理解了草坪草生長規(guī)律，掌握了各項操作技能，為今后從事各類草坪養(yǎng)護(hù)奠定了基礎(chǔ)。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟檢測蛋白濃度，按照每孔20 μg蛋白上樣電泳，結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入一抗稀釋液，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影，TANON GIS軟件讀取灰度值。

基層協(xié)商民主需要技術(shù)和資源的支撐，社區(qū)資源有限，加之政府在搭建資源籌集平臺上支持力度不夠，使收集民意信息網(wǎng)絡(luò)運行效率不高，不僅協(xié)商結(jié)果難以落實，還造成了部分社區(qū)居民習(xí)慣于組織安排，不善于自己發(fā)表意見，更有部分城市社區(qū)居民對社區(qū)事務(wù)冷淡，缺乏公共責(zé)任意識。 談到民意采集情況，H社區(qū)負(fù)責(zé)消防安全的工作人員說：

1.2.4 茜素紅染色 取各組細(xì)胞用PBS洗3遍后，用4%多聚甲醛固定30 min，吸去4%多聚甲醛溶液，加入3 mL茜素紅染色液，室溫染色30 min。蒸餾水速洗，在倒置顯微鏡下觀察染色效果，拍照。

1.2.8 雙熒光素酶基因檢測 將細(xì)胞分為6組，分別為miR-26a mimic+空載體組、miR-26a mimic+CTGF 3'-UTR野生型、miR-26a mimic+CTGF 3'-UTR突變型、miR-26a inhibitor+空載體組、miR-26a inhibitor+CTGF3'-UTR野生型、miR-26a inhibitor+CTGF 3'-UTR突變型。將CTGF 3的3'-UTR序列克隆到熒光素酶載體中構(gòu)建野生型或突變型質(zhì)粒。將miR-26a與構(gòu)建的質(zhì)?；蛳鄳?yīng)對照共轉(zhuǎn)染，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性檢測，計算得出相對熒光素酶活性。

1.2.5 qPCR 檢測miR-26a、CTGF 表達(dá) Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增。反應(yīng)程序：95℃，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；72℃，25 s，循環(huán)40次。以2法計算相對表達(dá)量。引物序列如表（表1）。

2 結(jié)果

2.1 A7r5細(xì)胞鈣化模型鑒定

Western blot和qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞中miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低（＜0.05），OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，AR234960 干預(yù)后miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表達(dá)無顯著差異（＞0.05），而miR-26a mimic的干預(yù)后miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高（＜0.05），OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低（＜0.05）。與miR-26a mimic組相比，AR234960+miRNA-26a mimic組miR-26a、OPG mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低（＜0.05），而OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白的表達(dá)顯著升高（＜0.05，圖6）。

2.2 VSMCs細(xì)胞鈣化前后miR-26a、CTGF表達(dá)差異

隨著VSMCs細(xì)胞鈣化時間的增加，細(xì)胞中miR-26a的表達(dá)逐漸降低，且各個時間點與0 h相比均具有顯著性差異（＜0.05，圖2A）。CTGF mRNA的表達(dá)則與miR-26a 相反，隨著鈣化時間增加，細(xì)胞中CTGF mRNA 的表達(dá)逐漸增加（＜0.05），除12 h 時CTGF mRNA的表達(dá)與0 h之間沒有顯著差異（＞0.05），其他時間與0 h相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖2B）。

2.3 轉(zhuǎn)染效率鑒定

經(jīng)過檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-26a的表達(dá)量驗證轉(zhuǎn)染效率。由結(jié)果可知（圖3），對照組、miR-26a-mimic NC、miR-26a-inhibitor NC 3組間沒有顯著性差異（＞0.05）。另外miR-26a-mimic組中miR-26a的表達(dá)量顯著高于miR-26a mimic NC 組（＜0.05），而miR-26a-inhibitor組中miR-26a的表達(dá)顯著低于miR-26a-inhibitor NC組（＜0.05）。說明miR-26a模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染成功。

2.4 各組細(xì)胞鈣化沉積檢測

與對照組相比，模型組ALP活性顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，AR234960干預(yù)后ALP的活性升高，但沒有顯著性差異（＞0.05），而miRNA-26a mimic顯著降低了細(xì)胞中ALP 的活性（＜0.05）；與miRNA-26a mimic組相比，AR234960+miRNA-26a mimic組ALP活性顯著升高（＜0.05，圖5）。

2.5 ALP活性檢測

茜素紅染色結(jié)果（圖4）顯示，NC組中，細(xì)胞基質(zhì)未著色，細(xì)胞無色。模型組中細(xì)胞外基質(zhì)呈暗紅色，可見明顯鈣化結(jié)節(jié)。與模型組組相比，AR234960增加了細(xì)胞的鈣化程度，而miRNA-26a mimic則在一定程度上緩解了細(xì)胞鈣化現(xiàn)象。

2.6 各組細(xì)胞中miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白表達(dá)情況

茜素紅染色結(jié)果顯示（圖1），對細(xì)胞不做鈣化處理時，細(xì)胞透明，細(xì)胞基質(zhì)未著色。當(dāng)鈣化時間為12～24 h時，細(xì)胞基質(zhì)鈣鹽沉積染色不明顯，透明細(xì)胞較多。48～72 h細(xì)胞基質(zhì)中有明顯鈣鹽沉積，但72 h時鈣化程度太為明顯。為便于后續(xù)實驗，選擇48 h為鈣化時間。

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測

與miR-26a-mimic 組相比，miR-26a-inhibitor 組CTGF 3'-UTR 野生型中相對熒光素酶活性顯著升高（＜0.05），而miR-26a-mimic組和miR-26a-inhibitor組在CTGF 3'-UTR突變型和空載組中均無顯著性差異（＞0.05，圖7）。

1.2.7 ALP 活性檢測 收集各組細(xì)胞用PBS 沖洗3 次后，加入裂解液，冰上溶解30 min，收集細(xì)胞并用-70 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，4 ℃，8000 r/min離心10 min，取上清，嚴(yán)格按照ALP活性檢測試劑盒說明書檢測ALP活性，實驗重復(fù)3次。

3 討論

近年來，許多研究表明miRNA在骨代謝和血管鈣化中發(fā)揮著重要作用。OPG/RANKL/RANK信號通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路之一，而CTGF是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的有絲分裂原，是RANKL的靶基因之一，其通過促進(jìn)A7r5的生長、遷移、凋亡、粘附和基質(zhì)成分的分泌，在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。在本實驗中鈣化后細(xì)胞中CTGF基因的表達(dá)顯著增加，同時miRNA-26a的表達(dá)顯著降低。通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，CTGF激動劑AR234960能夠誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，而通過miRNA-26a干預(yù)后，細(xì)胞鈣化現(xiàn)象得到緩解，表明miRNA-26a mimic能在一定程度上抑制細(xì)胞鈣化。

2)中孔數(shù)量增加更有利N2和I-3吸附量(孔容)的增加。隨硝酸改性時間、溫度、濃度和超聲功率增加，I-3的吸附量先增后減，在75 min、343 K、硝酸濃度為7 mol/L、功率為70～80 W時，改性活性碳I-3吸附最佳。

ALP、OPG、OPN、BMP-2是典型的骨鈣化調(diào)節(jié)因子，但這些因子均已在血管中發(fā)現(xiàn)并且在病變血管與非病變血管之間存在差異。ALP作為一種催化磷酸單脂水解的金屬酶，是鈣化機制中最重要的功能基因之一。研究表明，鈣化主動脈和主動脈瓣中ALP活性顯著增加，而miRNA-29b處理的大鼠血清中ALP活性顯著降低。在成骨細(xì)胞分化中高表達(dá)的矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被敲除后，A7r5細(xì)胞中ALP的表達(dá)和鈣化均顯著降低。在本實驗中，模型組細(xì)胞中ALP 的活性顯著增加，AR234960 干預(yù)后使ALP 的活性增加加劇，而經(jīng)過miRNA-26a mimic處理后，細(xì)胞中ALP活性均顯著降低，表明miRNA-26a在一定程度上可以降低ALP的活性，緩解細(xì)胞鈣化。

在實際問題中，團(tuán)體可以是學(xué)校、醫(yī)院、工廠、農(nóng)莊等企事業(yè)單位，也可以是國家、北約、APEC等政治、軍事、經(jīng)濟等組織.資源可以是活動空間或場所、交通工具、辦公用具、通訊工具、醫(yī)療衛(wèi)生健身娛樂以及生活用具等物品或準(zhǔn)入票據(jù)(包括俱樂部的會員卡、影戲歌舞盛會的入場券、其他招待券通行證或門票)，也可以是各部門評優(yōu)獎勵或參與團(tuán)體的會議、考察、旅游、宴會以及其他社交活動的限定名額(相當(dāng)于席位問題的代表數(shù)).

BMP-2通過啟動成骨基因的核心轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)間充質(zhì)前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Yang等研究表明，趨化因子分型素通過劑量依賴的方式促進(jìn)OPN、BMP-2的表達(dá)，同時下調(diào)OPG的表達(dá)，進(jìn)而對成骨鈣化和動脈粥樣硬化鈣化起到促進(jìn)作用。另有研究表明，OPG和核因子受體激活因子-κB配體細(xì)胞因子系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)血管鈣化，在血管中具有保護(hù)作用。在本實驗中，A7r5細(xì)胞鈣化后OPG的表達(dá)顯著降低，Collagen II的表達(dá)顯著增加。miRNA-26a mimic能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)胞鈣化導(dǎo)致的miRNA-26a 和OPG 表達(dá)降低，而OPN、BMP-2、Collagen II 的表達(dá)顯著降低，為miRNA-26a mimic能夠有效抑制血管鈣化提供了新證據(jù)。通過雙熒光素酶基因檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a與CTGF之間存在靶基因結(jié)合位點。

綜上，本實驗表明miRNA-26a mimic 能夠有效降低細(xì)胞中ALP活性及OPN、BMP-2、Collagen II基因的表達(dá)，同時增加鈣化細(xì)胞中OPG基因水平。通過雙熒光素酶基因檢測證明了miRNA-26a與CTGF之間存在靶基因結(jié)合位點，為miRNA-26a通過調(diào)控CTGF水平進(jìn)而對緩解血管鈣化提供了理論依據(jù)。