PCGF1 在直腸腺癌中高表達(dá)，沉默后可抑制直腸腺癌的增殖

直腸腺癌（READ）起源于直腸粘膜上皮細(xì)胞，是最常見的直腸癌類型，占直腸癌90%以上，且男性發(fā)病率高于女性。雖然現(xiàn)在結(jié)腸鏡檢被作為早期發(fā)現(xiàn)和診斷直腸癌的重要手段，但在診斷直腸癌時(shí)，約80%是局限性的，而20%已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)仍然是威脅患者健康和困擾醫(yī)務(wù)工作者的難題。研究發(fā)現(xiàn)，READ的病因包括不良飲食習(xí)慣、煙草、久坐不動(dòng)的生活方式、肥胖、年齡、遺傳、炎癥性腸病和輻射等。但READ發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確。

本文建立栽植機(jī)構(gòu)的數(shù)學(xué)模型，確定投苗速度作為栽植質(zhì)量評(píng)價(jià)的目標(biāo)函數(shù)，根據(jù)栽植系統(tǒng)的工作參數(shù)和結(jié)構(gòu)形式建立約束條件，利用Matlab軟件的優(yōu)化工具求解問題的最優(yōu)解。通過計(jì)算機(jī)輔助分析方法，對(duì)栽植機(jī)構(gòu)進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)仿真分析，求解運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)，即懸杯的運(yùn)動(dòng)軌跡、運(yùn)動(dòng)速度和加速度，用以評(píng)價(jià)懸杯式移栽機(jī)的作業(yè)性能。

多梳家族（PcG）蛋白在胚胎發(fā)育和干細(xì)胞特性維持中發(fā)揮重要作用，研究表明多梳家族蛋白功能失調(diào)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Bmi-1作為多梳家族明星分子，在包括卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中過表達(dá)或者失調(diào)。多梳家族因子1（PCGF1）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高度表達(dá)，且對(duì)細(xì)胞的自我更新和胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用?；蛐蛄蟹治霰砻?，PCGF1在結(jié)構(gòu)上與Bmi-1高度相似，RING finger結(jié)構(gòu)域與Bmi-1相應(yīng)區(qū)域同源性高達(dá)93%，提示這兩個(gè)蛋白可能具有相似的功能。有研究表明，PCGF1在膠質(zhì)瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等腫瘤組織中高度表達(dá)，但在直腸腺癌中尚無相關(guān)研究，因此了解PCGF1在READ調(diào)控中的功能可能會(huì)為其治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

本研究采用生物信息學(xué)方法分析PCGF1在直腸腺癌中的表達(dá)情況，探討PCGF1表達(dá)與直腸癌患者的生存預(yù)后相關(guān)性，并進(jìn)一步通過沉默和過表達(dá)PCGF1基因的雙向操作，探討對(duì)直腸腺癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖的影響，旨在為PCGF1作為READ診斷標(biāo)志物、治療靶標(biāo)和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析

分別采用在線資源ENCORI（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）和UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）分析來自TCGA的腫瘤樣本數(shù)據(jù)。其中，UALCAN用于分析直腸癌樣本中PCGF1基因表達(dá)水平，包括與不同分型、不同分期、組織亞型、性別、種族、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)的基因表達(dá)豐度。本研究通過ENCORI分析PCGF1基因表達(dá)與READ患者生存率的關(guān)系。根據(jù)基因表達(dá)的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組（=79）和低表達(dá)組（=80）。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)

將細(xì)胞提前1 d 種至96 孔板，濃度為8×10/孔，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下讀取每個(gè)孔的吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR

腫瘤組織在10%甲醛中固定、包埋后制作成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)和封閉。與Ki67 抗體（IHC-R098，IBP）4 孵育過夜，然后室溫下與二抗（SE134 羊抗兔，Solarbio）孵育1 h。加入DAB 顯色（DA1010，Solarbio），孵育30 s。光學(xué)顯微鏡下觀察染色效果。

1.4 載體構(gòu)建及病毒包裝

腫瘤組織在10%甲醛中固定、包埋后制作成4 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蒸餾水洗滌5 min，用蘇木素對(duì)組織進(jìn)行染色15 min。然后置于1%鹽酸乙醇溶液中分化30 s，0.25%伊紅染料溶液復(fù)染5 min（G1120，Solarbio），梯度乙醇浸泡脫水封片。所有操作均在室溫下進(jìn)行。

1.5 病毒感染及穩(wěn)定細(xì)胞系建立

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)符合實(shí)驗(yàn)條件的樣品進(jìn)行了分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Student's檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2012年年底，松遼委制定了《“節(jié)水增糧行動(dòng)”項(xiàng)目水資源論證審查工作方案》，確定了審查方式和審批流程，設(shè)定報(bào)告審批的水資源論證審查約束性條件，對(duì)審查方式、時(shí)間和專家組組成等多方面工作提出了明確目標(biāo)和工作進(jìn)度要求。同時(shí)，組織成立了由國內(nèi)知名專家、學(xué)者為組長(zhǎng)的評(píng)審專家組，為水資源論證報(bào)告書評(píng)審提供智力支持。

自《完善促進(jìn)消費(fèi)體制機(jī)制實(shí)施方案（2018-2020年）》提出以來，旅游業(yè)迎來了新一輪的黃金發(fā)展時(shí)期，當(dāng)下，我國旅游產(chǎn)業(yè)社會(huì)綜合效益顯著，高于世界平均水平，國民經(jīng)濟(jì)綜合貢獻(xiàn)和社會(huì)就業(yè)綜合貢獻(xiàn)率超過10%。旅游已然成為提升人民幸福感的剛需，僅2017年，我國人均出游已達(dá)3.7次；2015-2017年間，我國旅游綜合最終消費(fèi)占同期國民經(jīng)濟(jì)最終消費(fèi)總額的比重超過14%，旅游綜合資本形成占同期國民經(jīng)濟(jì)資本形成總額的比重約6%，旅游綜合出口占國民經(jīng)濟(jì)出口總額的比重約6%①。促進(jìn)旅游產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，推進(jìn)由觀光旅游到休閑旅游的轉(zhuǎn)型，是我國旅游業(yè)市場(chǎng)未來發(fā)展的重點(diǎn)。

1.6 Western blot檢測(cè)

用RIPA 裂解液（R0010，Solarbio）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑（cOmplete ?Protease Inhibitor Cocktail）。用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，一抗按照1∶1000稀釋4 ℃孵育過夜（PCGF1、βactin，Abcam），洗膜后分別于HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠抗體（1∶5000，BioRad，Hercules）室溫孵育1 h。利用ECL Plus（Amersham Pharmacia Biotech）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

人胚腎細(xì)胞（293FT），人直腸腺癌細(xì)胞系（SW1463，SW837）和人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞（HCoEpiC）由本實(shí)驗(yàn)室保存。所有細(xì)胞在37 ℃、5%CO條件下，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

雄性BALB/c裸鼠（4～6周齡，=18）（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所），飼養(yǎng)在無菌環(huán)境中，24 ℃和50%～70%濕度條件下，12/12 h的光/暗循環(huán)，并允許自由獲得食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（NC）、過表達(dá)組（OE）和敲低組（KD），6只/組。分別將SW837-NC、SW837-OE和SW837-KD 細(xì)胞（6×10/mL）重懸于100 μL PBS 溶液中，注射入裸鼠左側(cè)腋下皮下組織。1 d/次測(cè)腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，以每組動(dòng)物移植腫瘤體積的均值繪制生長(zhǎng)曲線。裸鼠麻醉后拍照，完整剝離腫瘤，稱取移植瘤質(zhì)量、測(cè)量腫瘤體積，拍照后固定于中性福爾馬林液中固定后進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。

1.9 H&E染色

將PCGF1全長(zhǎng)序列克隆到pLVX-IRES-Puro載體中（Overexpression,OE），同時(shí)針對(duì)PCGF1敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并克隆到pLVX-shRNA2載體中（Knockdown，KD），進(jìn)行慢病毒包裝。將293FT細(xì)胞按照5×10/mL提前1 d鋪種至6孔板，分別將構(gòu)建的載體與PMD和SPA質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，6～8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，用0.22 μm濾膜分別于48 h、72 h收集上清液，加入病毒濃縮液后4 ℃離心獲得高滴度慢病毒濃縮液。PCGF1 過表達(dá)載體引物，F(xiàn)orward:5'-GGAATTC ATGGCGTCTCCTCAGGGGGGC-3'，Reverse:5'-CG CGGATCCCTACCTCCTCTTCTCTTTCACACTG-3'；PCGF1 沉默載體引物，F(xiàn)orward:5'-CACCGGCAGGA CATCGTGTATAAGC-3'，Reverse:5'-AAACGCAGGA CATCGTGTATAAGCC-3'。

1.10 免疫組化

使用TRIzol 試劑（Invitrogen）從細(xì)胞中分離總RNA，根據(jù)操作說明檢測(cè)PCGF1 mRNA表達(dá)水平。然后使用Prime ScriptRT試劑盒（Takara）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR反應(yīng)采用SYBR Green PCR試劑盒（Takara）。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。反應(yīng)在ABI7500 Fast Real-Time PCR體系（Applied Biosystems）中進(jìn)行。反應(yīng)條件為95 ℃10 min,95 ℃15 s 40個(gè)循環(huán)，60 ℃35 s。分析每個(gè)樣品的熔化曲線。使用2方法計(jì)算每個(gè)重復(fù)的均值來計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。PCGF1 引物，F(xiàn)orward: 5'-TTAAGATGGCGTCT CCTCAGG-3'，Reverse: 5'-AGTGGCTGTGTCTCGT GGAT-3'；GAPDH引物，F(xiàn)orward:5'-CGCTCTCTGCT CCTCCTGTTC-3'，Reverse: 5'-ATCCGTTGACTCCG ACCTTCAC-3'。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別將SW837和SW1463細(xì)胞作為目的細(xì)胞，按照1×10/孔的比例提前1 d鋪至6孔板，將制備的慢病毒濃縮液分別感染細(xì)胞，12 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h。加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。1周后挑選單克隆細(xì)胞集落更換至24孔板用1 μg/mL濃度的嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行有限稀釋篩選。消化細(xì)胞后稀釋至100 mL，取1 μL加入預(yù)先放入99 μL 10%FBS-DMEM培養(yǎng)基的96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，嘌呤霉素濃度為1 μg/mL，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后移至6孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。SW837 NC和SW1463 NC分別代表陰性對(duì)照細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌中PCGF1表達(dá)及生存分析

UALCAN 在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中PCGF1 在READ組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，PCGF1在READ組織中的表達(dá)高于正常對(duì)照組織（＜0.0001，圖1A）。PCGF1表達(dá)在正常組織和直腸腺癌之間以及正常組織和直腸粘液腺癌之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。不同病理分期READ組織中PCGF1表達(dá)均高于正常對(duì)照組（＜0.05），并且Ⅳ期直腸腺癌組織PCGF1表達(dá)高于I期組織（圖1C）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的READ組織中PCGF1表達(dá)與正常對(duì)照組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。對(duì)PCGF1表達(dá)與READ患者總生存率相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PCGF1表達(dá)高于平均值，且與OS下降顯著相關(guān)（HR=2.57，=0.023，圖1E）。

2.2 PCGF1表達(dá)水平驗(yàn)證

為驗(yàn)證上述生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果，我們對(duì)人正常直腸上皮細(xì)胞和人直腸腺癌上皮細(xì)胞中PCGF1 mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞中PCGF1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著高于正常對(duì)照細(xì)胞（＜0.01，圖2A）。

某商住小區(qū)工程是B市先進(jìn)技術(shù)開發(fā)區(qū)中心樓板，工程包含了6棟主要建筑、2個(gè)地下車庫，高層住宅建筑地上層數(shù)是31層，地下1層。此次工程中為了充分滿足施工質(zhì)量目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)節(jié)能環(huán)保目標(biāo)，對(duì)外墻和屋面建筑施工使用了以下節(jié)能環(huán)保設(shè)計(jì)方法：①對(duì)于該建筑項(xiàng)目的外墻部分，墻面涂料使用的是具備良好的防水性與透氣性8mm厚的纖維水泥漿當(dāng)作基層涂料，選取了25mm厚的干掛石板施工，透孔縫進(jìn)行封膠處理。②對(duì)于該建筑項(xiàng)目的屋面，選擇采用泥聚苯發(fā)泡顆?，F(xiàn)澆找坡，任搗任抹，使用1：3的配比水泥砂漿鋪筑20mm厚度開展找平處理。而外墻粘結(jié)層則使用的是3～5mm厚的B型聚合物水泥砂漿粘結(jié)層，使用7～10mm的地磚面材進(jìn)行鋪實(shí)。

2.3 建立PCGF1沉默穩(wěn)定細(xì)胞系

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC 細(xì)胞相比，SW837 KD細(xì)胞和SW1463 KD細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著降低（＜0.05，圖4），而PCGF1過表達(dá)則對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯作用。

2.4 PCGF1沉默抑制細(xì)胞增殖

我們采用雙向操作技術(shù)，分別構(gòu)建PCGF1過表達(dá)和沉默的慢病毒載體，以SW837和SW1463為基礎(chǔ)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后挑選單克隆，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。對(duì)建立的細(xì)胞系進(jìn)行Western blot分析，證實(shí)過表達(dá)和沉默細(xì)胞系均構(gòu)建成功，且SW837和SW1463細(xì)胞沉默效率分別為80.5%和71.9%（圖3），將該細(xì)胞系作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)細(xì)胞系，按照過表達(dá)和沉默分別命名為OE和KD細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞為NC細(xì)胞。

山東抗日根據(jù)地，是抗日戰(zhàn)爭(zhēng)爆發(fā)以后由中國共產(chǎn)黨領(lǐng)導(dǎo)建立的一個(gè)重要的敵后抗日戰(zhàn)略基地。山東抗日根據(jù)地的建立和發(fā)展，每一步歷程都是同黨的民眾動(dòng)員工作緊密相聯(lián)的，文化動(dòng)員是其中不可或缺的重要組成部分。山東黨組織在艱苦卓絕的斗爭(zhēng)環(huán)境中，毅然擔(dān)負(fù)起“國民精神總動(dòng)員”的重任，借助文化的力量去教育群眾、動(dòng)員群眾、組織群眾，從而使他們自覺地投身于抗日戰(zhàn)爭(zhēng)中。在根據(jù)地廣大民眾的積極配合下，黨的民眾動(dòng)員工作收到了很好的效果，成為抗戰(zhàn)取得勝利的關(guān)鍵因素。

2.5 PCGF1沉默移植腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)

鑒于PCGF1可以在體外抑制READ細(xì)胞增殖，我們進(jìn)一步通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定PCGF1在體內(nèi)的作用。結(jié)果顯示，與NC和OE組相比，KD組腫瘤體積和質(zhì)量縮小（圖5A），且在荷瘤期間，KD組腫瘤生長(zhǎng)明顯慢于NC組和OE組，相應(yīng)的腫瘤體積也較?。ǎ?.05，圖5B）。對(duì)3組腫瘤重量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示KD組的腫瘤質(zhì)量低于其它兩組(＜0.05)，而NC組和OE組之間沒有顯著性差異（圖5C）。同時(shí)，小鼠體質(zhì)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖5D）。在H&E 和免疫組化實(shí)驗(yàn)中，腫瘤細(xì)胞增殖通過Ki-67染色檢測(cè)，結(jié)果顯示KD組腫瘤組織中Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組（＜0.05），而NC組和OE組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖6）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)PCGF1 主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，并且PCGF1缺失的胚胎干細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的外胚層和中胚層發(fā)育缺陷。本課題組在以往對(duì)小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PCGF1可以直接與Oct4啟動(dòng)子結(jié)合維持P19細(xì)胞的多能性，提示PCGF1在干細(xì)胞多能性維持上具有重要作用，而且該作用主要與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)。眾所周知，腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的表觀遺傳異常已經(jīng)被證實(shí)可以引起腫瘤的所有特征表型。PcG蛋白的功能失調(diào)，無論是功能獲得還是功能缺失，都會(huì)導(dǎo)致表觀遺傳的限制或者促進(jìn)，引發(fā)錯(cuò)誤的下游效應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤的特征。截止目前，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)包括PCGF1在內(nèi)的多個(gè)PcG蛋白在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤等多種腫瘤中顯著升高，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Bmi-1作為PCGF1高度同源的PcG家族蛋白，在大腸癌中表達(dá)明顯升高，其與大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，且對(duì)Ki67的表達(dá)具有間接調(diào)控作用，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型中，敲除Bmi-1 可以減少肝轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)Bmi-1 則增加肝轉(zhuǎn)移。Mel18（PCGF2）通過抑制reg3b 和STAT3 信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸腺瘤細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，參與小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

奶奶編蓑衣的姿勢(shì)很優(yōu)雅，像她平時(shí)做針線活那樣細(xì)致認(rèn)真。蓑衣草曬干后有些扎手，編起來容易斷，爺爺會(huì)端來一碗水，喝一大口含在嘴里，腮幫子都鼓起來，然后猛然張口一噴，水霧四散開來，均勻地散落在蓑衣草上，干燥的蓑衣草經(jīng)水霧的浸潤，就會(huì)變得柔韌。爺爺將一撮撮蓑衣草細(xì)密拼疊，奶奶用一道道繩線緊纏密繞，如此循環(huán)往復(fù)，像是在合奏一首優(yōu)美的樂章。父親有時(shí)會(huì)呆呆地望著他們，深深地陶醉著，屋里屋外，飄蕩著蓑衣草的清香……

PCGF1在宮頸癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織及細(xì)胞模型中表達(dá)水平升高也提示其可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在具有更高克隆形成能力的側(cè)群細(xì)胞（SP）中，PCGF1表達(dá)水平更高。PCGF1過表達(dá)可以增加HeLa細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞S周期細(xì)胞分布，降低G2/M期細(xì)胞比率。本課題組以往的研究也證實(shí)，PCGF1沉默后可以抑制c-Myc信號(hào)通路，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。隨著研究的不斷深入，PCGF1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控功能逐漸被挖掘出來。有研究證實(shí)，PCGF1可以直接與p21Waf1/Cip1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而抑制p21Waf1/Cip1表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，而p21是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期進(jìn)程的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。PCGF1在干細(xì)胞樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，且PCGF1敲低后干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的神經(jīng)球形成和自我更新能力下降，皮下異種移植物增殖能力下降，而PCGF1過表達(dá)則表現(xiàn)出干細(xì)胞樣表型。PCGF1可以直接結(jié)合于RDH16啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而抑制其表達(dá)。上述研究提示PCGF1可能在腫瘤干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮重要作用，這是腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接證據(jù)。

本研究首先通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PCGF1在READ中的表達(dá)顯著高于正常組織，而且這種高表達(dá)與患者的生存預(yù)后差密切相關(guān)。隨后，我們進(jìn)一步在細(xì)胞水平上進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PCGF1在直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均明顯上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，為了深入研究PCGF1對(duì)直腸腺癌調(diào)控的分子機(jī)制，我們采用經(jīng)典雙向操作方法，分別構(gòu)建PCGF1基因過表達(dá)和敲低的慢病毒載體，選取293T為包裝工具細(xì)胞，并利用嘌呤霉素對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行篩選，挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，最后獲得穩(wěn)定過表達(dá)和沉默的直腸癌細(xì)胞模型，經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩種細(xì)胞的PCGF1沉默效率均大于70%。通常情況下，腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯發(fā)生改變，而且與腫瘤放化療抗性及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，我們利用該細(xì)胞系重點(diǎn)分析PCGF1在調(diào)控細(xì)胞增殖方面的作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)PCGF1 沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力顯著下降，而PCGF1過表達(dá)則對(duì)細(xì)胞增殖能力沒有明顯作用。不僅如此，我們通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCGF1沉默后明顯抑制腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的增殖和生長(zhǎng)，同樣PCGF1過表達(dá)沒有改變腫瘤生長(zhǎng)速度和體積。因此，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均提示PCGF1是直腸腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因，這為PCGF1可能是一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)，可以用來抑制體內(nèi)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)提供了有力證據(jù)。有趣的是，有研究發(fā)現(xiàn)PCGF1結(jié)合于結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的啟動(dòng)子上，并且通過增加KMT2A表達(dá)和減少KDM6A表達(dá)，分別促進(jìn)H3K4組蛋白三甲基化和減少K3K27組蛋白三甲基化，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄活化作用。這一結(jié)果與我們的研究結(jié)論相一致，也進(jìn)一步為PCGF1在直腸腺癌細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用提供了有力證據(jù)。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析和建立直腸腺癌細(xì)胞模型初步發(fā)現(xiàn)PCGF1可能在READ的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，為下一步PCGF1作為直腸腺癌靶向治療的關(guān)鍵基因提供了理論基礎(chǔ)。但是，本研究也有一些局限性：一方面，沒有觀察成瘤動(dòng)物體內(nèi)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。另一方面，PCGF1對(duì)直腸癌抑制作用的確切機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。由于PCGF1具有表觀遺傳抑制作用，下一步我們將在此細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，通過大規(guī)模測(cè)序?qū)CGF1下游調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，進(jìn)一步探究其在READ中作用的直接分子機(jī)制，為開發(fā)READ診斷和治療的靶分子提供理論依據(jù)。總之，隨著對(duì)腫瘤表觀遺傳失調(diào)機(jī)制的了解深入，對(duì)PCGF1等表觀遺傳修飾因子的研究將揭示包括READ在內(nèi)等多種腫瘤的表觀遺傳修飾信息和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，從而為精準(zhǔn)治療提供新的策略和靶點(diǎn)。