DNAM-1通過IL-2/STAT-5通路調(diào)節(jié)I型調(diào)節(jié)性T細胞的增殖和功能

Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細胞（Tr1 cell）在免疫應(yīng)答負調(diào)控和維持機體免疫耐受中發(fā)揮重要作用，是CD4T細胞的一類特殊細胞亞群，此類細胞誘導(dǎo)形成于外周免疫器官，以共表達CD49b和LAG-3、高水平分泌抑制性細胞因子白細胞介素（IL）-10、不表達調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白3 轉(zhuǎn)錄因子P3（Foxp3）為主要特點，此外，Tr1細胞免疫抑制功能也與顆粒酶B（GZMB）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的分泌相關(guān)，其數(shù)量降低或功能異常與腫瘤、自身免疫性疾病、感染和移植排斥反應(yīng)等多種疾病發(fā)生密切相關(guān)。

黏附分子DNAM-1分子（CD226）組成性表達于多種免疫細胞表面，為Tr1細胞重要表面標記分子之一，DNAM-1與配體CD155和CD112相互作用介導(dǎo)T細胞的分化和活化、NK細胞的殺傷、血小板的活化聚集、單核巨噬細胞與內(nèi)皮細胞的粘附等多種免疫活動。研究表明DNAM-1可通過活化自身反應(yīng)性T淋巴細胞、抑制Treg的活化增殖參與多種自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展，且證實了阻斷DNAM-1對于移植后免疫耐受重建和治療自身免疫性疾病具有重要意義。有研究證實DNAM-1高表達于人Tr1細胞上，Tr1 細胞殺傷活性依賴于DNAM-1分子的參與，表達于Tr1細胞的DNAM-1與表達于骨髓細胞上的配體CD155的特異性結(jié)合介導(dǎo)了Tr1 細胞激活和脫顆粒，可見DNAM-1對于Tr1 細胞細胞毒性靶標特異性是十分必要的，但DNAM-1是否參與Tr1細胞的分化、增殖和抑制功能卻未見報道。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用單克隆抗體阻斷DNAM-1或敲除小鼠DNAM-1后，CD4T細胞分泌IL-10明顯升高，推測DNAM-1影響Tr1細胞生物學(xué)功能。IL-2/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）-5是控制CD4T細胞亞群分化和增殖的重要信號通路，DNAM-1是否通過影響IL-2/STAT-5通路參與Tr1細胞分化和增殖尚不明確。因此，本研究利用DNAM-1基因敲除小鼠（KO小鼠），通過Tr1 細胞分離技術(shù)或體外誘導(dǎo)技術(shù)，探討DNAM-1分子對Tr1細胞分化、增殖和功能的影響及其相關(guān)分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級野生型（WT）C57BL/6小鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心），6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g。SPF級純合子DNAM-1 KO 小鼠（背景為C57BL/6，南京大學(xué)），SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)并將WT小鼠與純合子DNAM-1 KO小鼠合籠從而獲得Dnam-1F1代雜合子小鼠，隨后繼續(xù)在F1代小鼠間合籠以獲得F2代小鼠，通過鼠尾DNA基因鑒定篩選出DNAM-1 KO小鼠為本實驗所用，所有動物實驗操作均已通過本校動物實驗倫理審批（審批編號：NO.XJYYLL-20144433）。

經(jīng)改造的對輥粉碎機生產(chǎn)的玉米與配合料的粒度達到蛋雞理想粒度，有效減少原料粒度差異，混合更均勻，提高營養(yǎng)利用率，避免挑食，提供均衡營養(yǎng)。采用本生產(chǎn)工藝的蛋雞料，能夠顯著地提高蛋雞養(yǎng)殖效果和養(yǎng)殖效率，從而能夠提高養(yǎng)雞場的收益。

1.2 主要試劑

小鼠淋巴細胞分離液（達科為），LEAFTM Purified anti-mouse CD28（Biolegend），LEAFPurified antimouse CD3ε（Biolegend），MojosortMouse CD4T細胞磁珠分離試劑盒（Biolegend），新生牛血清（Gibco），紅細胞裂解液（Sigma），Cell Activation Cocktail（with Brefeldin A）（Biolegend）RPMI 1640 培養(yǎng)基（HyClone），Percp anti-mouse CD4（Biolegend），APC anti-mouse DNAM-1（Biolegend），F(xiàn)ITC anti-mouse CD49b，DNA Marker（Takara），瓊脂糖（Biowest），PE anti-mouse LAG-3（Biolegend），APC anti-mouse CD25（Biolegend），PE anti-mouse p-STAT5（eBioscience），PE anti-mouse IL-10（Biolegend），F(xiàn)ixation/Permeabilization Dilulent（Biolegend），Permeabilization Buffer（Biolegend），CFSE cell division tracker kit（Biolegend），Recombinant TGF-β1（PeproTech），Recombinant IL-2（Biolegend），Recombinant IL-27（Biolegend），RNAiso Plus（TaKaRa），MACS separation buffer（Miltenyi Biotec），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara），qRT-PCR反應(yīng)試劑盒（Takara）。

1.3 研究方法

對于礦工而言，如果不存在獎勵（賄賂）的情況下，是否添加攻擊者進行的交易獲得的獎勵是相同的，因此攻擊者在步驟3只需要較少獎勵即可誘使礦工在主鏈中不加入這筆交易。攻擊者在整個攻擊過程中，只需要賄賂金額小于商品金額即可攻擊成功。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)分子 檢測Tr1細胞胞內(nèi)磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（p-STAT5）表達水平，首先將收集的Tr1 細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中靜置1 h后，按照實驗需求給予IL-2刺激（5 ng/mL或10 ng/mL）30 min，收集細胞，按照1.3.1方法完成胞膜分子染色后進行固定和破膜，加入熒光標記抗體PE anti-mouse p-STAT5進行胞內(nèi)分子染色，室溫避光孵育20 min后洗滌懸浮，流式細胞術(shù)上機檢測后應(yīng)用FlowJo 軟件進行分析。

分離WT 小鼠和KO 小鼠脾臟初始CD4T 細胞（純度≥95%，圖3），在體外環(huán)境下誘導(dǎo)Tr1細胞（純度≥90%，圖4），使用CFSE工作液（5 μmol/L）標記誘導(dǎo)型Tr1細胞，活化增殖3 d后流式細胞術(shù)檢測其增殖能力。FlowJo軟件分析Tr1細胞增殖結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，KO 小鼠Tr1 細胞增殖比例明顯降低（41.16%±3.08%76.21%±5.12%，＜0.01，圖5A）。為明確DNAM-1分子敲除之后是否影響Tr1細胞的活化功能，我們檢測了兩組小鼠Tr1 細胞CD25 和CD69 表達水平。結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠Tr1細胞CD25分子MFI值為2057±185.1，KO 小鼠Tr1 細胞表達量降低，為1566±71.7，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；WT小鼠Tr1細胞CD69分子MFI值為4656±28.27，KO小鼠Tr1細胞表達量降低（4234±69.34），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測胞膜分子和檢測胞內(nèi)細胞因子根據(jù)實驗需要，收集脾臟單個核細胞或體外誘導(dǎo)獲得的Tr1細胞，將每管細胞數(shù)調(diào)整為（1.0～1.2）×10，150 μL PBS重懸細胞；按照說明書推薦劑量加入相應(yīng)的細胞膜分子流式抗體：Percp anti-mouse CD4、FITC anti-mouse CD49b、PE anti-mouse LAG-3、APC antimouse DNAM-1，4 ℃放置30 min；加入流式細胞術(shù)緩沖液重懸后離心洗劑兩次，加入固定液重懸細胞，流式細胞儀（ACEANovoCyte 3130）檢測。

胞內(nèi)細胞因子檢測按以下流程操作：收集待檢測細胞，加入Cell Activation Cocktail（with Brefeldin A）（1×10細胞加入1 μL）刺激6 h，按照實驗需要在刺激過程中選擇加入或不加IL-2（5 ng/mL），刺激完成后PBS重懸后離心、棄上清、胞膜分子染色，每管加入500 μLFixation緩沖液固定細胞25 min，加入Permeabilization 洗滌緩沖液2 mL重懸細胞破膜，在細胞中加入熒光標記抗體PE anti-mouse IL-10進行胞內(nèi)細胞因子染色，室溫避光孵育20 min后Permeabilization 洗滌緩沖液重懸細胞并離心，加入固定液以重懸細胞上機檢測。

流式細胞術(shù)分別檢測脾臟總CD4T細胞和Tr1細胞（CD4CD49bLAG-3）刺激前和刺激后DNAM-1分子表達水平，結(jié)果顯示靜息狀態(tài)CD4T 細胞表達DNAM-1比例為28.90%±1.10%；激活狀態(tài)表達比例為43.03%±4.90%，激活狀態(tài)的CD4T細胞表達DNAM-1水平升高（＜0.05，圖1A）。靜息狀態(tài)Tr1 細胞表達DNAM-1比例為35.25%±2.75%；激活狀態(tài)表達比例為43.43%±1.16%，激活狀態(tài)的Tr1細胞表達DNAM-1水平明顯升高（＜0.05，圖1B）。

加點準則Cpof(·)選擇在可行性概率最大的地方添加試驗點，選取可行試驗點的效率非常高?；趦赡繕思s束應(yīng)對策略和加點準則ISCbi的代理優(yōu)化算法(稱為EI-PoF算法)的具體流程如圖1所示。

1.3.5 CFSE標記法檢測Tr1細胞增殖能力 使用antimouse CD3（3 μg/mL）包被96孔U型細胞培養(yǎng)板，4 ℃冰箱中放置過夜；制備CFSE工作液（5 μmol/L）并重懸Tr1細胞，使細胞密度大于1×10/mL，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中8 min后取出，加入等體積含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液冰浴5 min以終止染色，在離心管中加入2倍體積以上的PBS充分洗滌染液，離心后加入含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基懸浮細胞，將細胞濃度調(diào)整至1×10/mL，加入anti-mouse CD28抗體（5 μg/mL）并加入到已包被的96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；培養(yǎng)1 d后即可觀察到細胞培養(yǎng)板底有克隆團出現(xiàn)，3～5 d收集細胞，流式細胞術(shù)檢測FITC通道的激發(fā)光信號，F(xiàn)lowJo軟件分析細胞增殖能力。

檢測佛波酯（PMA）和離子霉素混合物在加入或不加IL-2刺激前后，Tr1細胞分泌IL-10水平（圖6A）。相比較靜息狀態(tài)，兩組Tr1細胞在接受PMA/離子霉素刺激后，IL-10分泌水平升高（＜0.0001）；WT組在PMA/離子霉素和IL-2共同刺激后，IL-10分泌水平明顯高于單純PMA/離子霉素刺激（＜0.01），而KO 組在接受PMA/離子霉素和IL-2共同刺激后，IL-10分泌水平與單純PMA/離子霉素刺激相比無明顯差異（＞0.05）。分離兩組小鼠Tr1細胞，提取RNA后檢測發(fā)現(xiàn)KO 小鼠Tr1細胞Il-10 mRNA和Gzmb mRNA表達水平均低于WT小鼠（圖6B、C）。

1.3.1 分離小鼠脾臟單個核細胞 脫頸處死小鼠，無菌條件下取出脾臟置于200目篩網(wǎng)上并剪碎，加入小鼠淋巴細胞分離液進行研磨，收集研磨液并在液面上緩慢加入0.5～1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，800×離心30 min，吸取白膜層細胞，加入紅細胞裂解液裂解5 min，重懸、300×離心5 min、棄除上清，重復(fù)操作充分洗滌細胞；細胞計數(shù)后待用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本檢驗，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激活狀態(tài)CD4+T細胞和Tr1細胞高表達DNAM-1

In March of 2014,when Russia annexed Crimea into its territory,the EU announced economic and diplomatic sanctions on Russia,which included restrictions to the energy exploiting technologies,equipment and services,as well as the restrictions to financial services on Russian companies and banks.

2.2 敲除DNAM-1不影響小鼠Tr1細胞數(shù)量和比例

流式細胞術(shù)鑒定KO小鼠脾臟CD4T細胞和Tr1細胞表達DNAM-1情況結(jié)果顯示：KO小鼠基本不表達DNAM-1 分子（圖2A），基因敲除小鼠構(gòu)建成功。以CD4CD49bLAG-3為Tr1細胞鑒定表型，檢測KO小鼠和同窩WT 小鼠脾臟Tr1 細胞比例和數(shù)量，結(jié)果顯示KO小鼠Tr1細胞比例和數(shù)量無明顯改變（＞0.05，圖2B）。

③Seymour M．Lipset，American Exceptionalism:A double－edged Sword，New York:W．W．North and Company，1996，p．31．

2.3 敲除DNAM-1后Tr1細胞活化和增殖能力降低

1.3.2 體外誘導(dǎo)Tr1細胞 PBS稀釋anti-mouse CD3抗體至3 μg/mL，按照100 μL/孔加入到96孔U型細胞培養(yǎng)板中，4 ℃過夜。分離脾臟單個核細胞懸液并計數(shù)，300×離心5 min 后棄上清，使用MojosortMouse CD4 Na?ve T Cell Isolation Kit 分離小鼠脾臟初始CD4T細胞（na?ve CD4T cell,Tn）并計數(shù)，使用流術(shù)細胞術(shù)鑒定細胞純度，本實驗所用Tn細胞純度≥95%。在Tn細胞中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次加入anti-mouse CD28（5 μg/mL）、TGF-β1（5 ng/mL）、IL-27（30 ng/mL）和IL-2（2 ng/mL）刺激培養(yǎng)；培養(yǎng)1 d后可觀察到培養(yǎng)板底出現(xiàn)細胞克隆團，培養(yǎng)3 d后收集細胞待用。

2.4 敲除DNAM-1降低小鼠Tr1細胞抑制性免疫分子分泌水平

1.3.6 qRT-PCR檢測 Trizol法提取RNA，吸出RNA溶液1 μL，使用微量核酸蛋白濃度測定儀（NanoDrop）檢測RNA溶液濃度，保證實驗所用RNA/比值在1.8～2.0。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進行操作，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃不限時，cDNA產(chǎn)物保存于-20 ℃。使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，引物委托上海生工生物公司合成，引物序列見表1。按照Takara qRT-PCR反應(yīng)試劑盒操作說明進行qRT-PCR操作，cDNA 1 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，ddHO 3 μL，總量10 μL，設(shè)置3個復(fù)孔，使用實時定量PCR儀（Bio-Rad CFX96）進行擴增反應(yīng)，條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共35個循環(huán)；以Gapdh作為內(nèi)參照，使用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪制統(tǒng)計圖表。

2.5 敲除DNAM-1分子通過抑制IL-2/STAT-5通路影響Tr1細胞功能

分別用5 ng/mL和10 ng/mL IL-2刺激WT 小鼠和KO小鼠Tr1 細胞30 min，流式細胞術(shù)檢測p-STAT5表達水平，結(jié)果顯示5 ng/mL IL-2刺激后，WT小鼠Tr1 細胞p-STAT5表達水平（6.42±0.53）%高于KO小鼠Tr1細胞表達水平（3.63±0.65）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；10 ng/mL IL-2 刺激后，WT 小鼠Tr1 細胞p-STAT5表達水平（7.36±0.30）%高于KO小鼠Tr1 細胞表達水平（4.46±0.59）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，圖7）。

3 討論

Tr1細胞是一類具有免疫抑制功能的CD4T細胞亞群，在維持自身免疫耐受和抑制病理性免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮的重要作用，多種跨膜免疫分子參與Tr1細胞活化和增殖過程。DNAM-1為T細胞活化共刺激分子，其與LFA-1交聯(lián)參與T細胞激活免疫突觸形成和活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究表明DNAM-1高表達于Tr1細胞上并被視為Tr1 細胞標志性分子，本研究旨在探明DNAM-1是否參與Tr1細胞分化、增殖和抑制功能。

在旅游服務(wù)類，洪江古商城的實景表演、導(dǎo)游講解及古裝拍照增加旅游體驗的趣味性與知識性。黔陽古城的風(fēng)味小吃，如春卷、綠豆粉是其顯著特色。高椅古村儺堂戲、黑米等特色民俗和物產(chǎn)為旅游者帶來新鮮體驗。荊坪古村的農(nóng)家樂、棋牌娛樂活動豐富了旅游者旅游體驗。

DNAM-1分子高表達于激活狀態(tài)的CD4T細胞，并參與Th細胞亞群的分化和增殖過程。研究表明DNAM-1與淋巴細胞功能相關(guān)抗原（LFA）-1共同參與T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并在T活化狀態(tài)的淋巴細胞中表達上調(diào)。本課題組在前期發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)CD4T細胞和Tr1細胞DNAM-1分子MFI值升高，DNAM-1分子參與調(diào)節(jié)性T細胞分化增殖過程。本研究發(fā)現(xiàn)DNAM-1分子在激活狀態(tài)的CD4T細胞和Tr1細胞中表達升高，此結(jié)果與文獻報道的DNAM-1高表達于激活狀態(tài)的效應(yīng)性T細胞并促進T細胞的活化過程相一致。CD25為IL-2受體（IL-2R）α亞單位，主要表達于激活狀態(tài)的T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞；細胞活化標記分子CD69 是T 細胞激活后最早表達的膜表面分子之一。我們發(fā)現(xiàn)缺少DNAM-1的Tr1細胞體外增殖能力降低，細胞活化標記分子CD96和CD25表達降低，此結(jié)果說明DNAM-1參與了Tr1細胞的活化和增殖過程，文獻報道DNAM-1 參與CD4初始T 細胞的發(fā)育和分化過程，并促進Th1細胞的極化而抑制Th2細胞極化，本結(jié)果為補充DNAM-1參與Tr1細胞這一特殊CD4+T細胞亞群活化和增殖過程提供依據(jù)。為明確DNAM-1是否參與Tr1細胞的免疫功能，我們檢測了KO小鼠Tr1細胞分泌IL-10和表達Gzmb情況，結(jié)果表明Tr1細胞DNAM-1分子缺如后，其抑制性細胞因子IL-10分泌水平和與細胞毒作用效應(yīng)分子Gzmb表達均降低，這些結(jié)果雖為明確DNAM-1分子參與Tr1細胞功能提供了重要依據(jù)，但相關(guān)分子機制并不清楚。

Tr1細胞分化、發(fā)育和抑制功能與細胞因子信號密切相關(guān)。研究表明IL-2在促進T細胞活化和調(diào)控T細胞亞群分化中發(fā)揮重要作用，其可通過調(diào)控細胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)性細胞因子影響T細胞轉(zhuǎn)錄命運和代謝過程。在IL-2信號刺激下，IL-2R與JAK酪氨酸激酶偶聯(lián)繼而激活STAT5等轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)節(jié)CD4T細胞的分化，參與CD4T細胞的激活、分化增殖和功能發(fā)揮。近年有研究結(jié)果表明IL-2促進Tr1細胞的分化與增殖過程，考慮到本實驗中使用IL-2刺激后，KO小鼠Tr1細胞IL-10低分泌水平并未逆轉(zhuǎn)，分析敲除DNAM-1可能影響了Tr1細胞的IL-2通路的下游胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為證實此推測，本研究進一步檢測了IL-2刺激后Tr1細胞內(nèi)p-STAT5變化，發(fā)現(xiàn)KO小鼠Tr1細胞p-STAT5表達水平低于WT小鼠Tr1細胞。由上述結(jié)果分析可知DNAM-1通過調(diào)控IL-2/STAT5通路參與Tr1細胞分化和功能，但其分子水平調(diào)控機制和交互作用尚需進一步研究和明確。

綜上所述，DNAM-1分子參與Tr1細胞的活化、增殖和抑制功能，敲除DNAM-1分子影響Tr1細胞的活化水平、抑制體外增殖能力和分泌效應(yīng)性免疫分子的能力，此調(diào)控作用可能是通過參與IL-2/STAT-5信號通路來實現(xiàn)的。在后期實驗中，我們將繼續(xù)探明DNAM-1分子參與Tr1細胞增殖和功能相關(guān)分子機制，為靶向DNAM-1分子治療自身免疫性疾病等臨床疾病提供理論與實驗依據(jù)。