TRAF6通過(guò)內(nèi)源性凋亡通路促進(jìn)卡介苗誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

結(jié)核分枝桿菌（Mtb）是引起結(jié)核病的單一傳染性致病菌。Mtb入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞通過(guò)募集溶酶體水解酶、產(chǎn)生氮物質(zhì)和活性氧、促進(jìn)吞噬體與溶酶體融合、表達(dá)和運(yùn)輸主要組織相容性復(fù)合物II類（MHC II），促進(jìn)自噬和細(xì)胞凋亡等多種方式阻止Mtb在胞內(nèi)增殖。細(xì)胞凋亡作為感染早期巨噬細(xì)胞對(duì)抗Mtb的主要防御機(jī)制，除消除有利于Mtb增殖的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境外，其還會(huì)通過(guò)將凋亡小體遞送至樹突狀細(xì)胞促進(jìn)Mtb抗原交叉呈遞觸發(fā)免疫反應(yīng)。然而，Mtb 分泌的毒力因子Rv3654c和Rv3655c可通過(guò)調(diào)節(jié)NO和促炎因子抑制巨噬細(xì)胞凋亡。因此，全面了解Mtb與細(xì)胞凋亡之間的博弈過(guò)程對(duì)了解Mtb與宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)拮抗作用至關(guān)重要。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）作為一種銜接蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、凋亡和Mtb感染中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在TLR2參與誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)Mtb的炎癥/免疫抑制反應(yīng)中，Mtb 抑制TRAF6 蛋白水平的同時(shí)顯著增強(qiáng)TRAF6在mRNA水平的表達(dá)。也有研究表明，Mtb Rv2626c與TRAF6相互作用抑制巨噬細(xì)胞中TLR4炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)。但是目前，Mtb感染巨噬細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TRAF6是否參與其中有待闡明。本研究采用牛分枝桿菌疫苗株卡介苗（BCG）感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，觀察敲低TRAF6對(duì)BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制，為深入探討調(diào)控RAW264.7細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制和靶向凋亡協(xié)助結(jié)核病治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。在37 ℃，5%CO的培養(yǎng)條件下，將RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇在含有90%DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）、10%胎牛血清（Gibco）的細(xì)胞培養(yǎng)基中。

1.2 菌株

牛分枝桿菌疫苗株卡介苗（BCG）（上海生物制品研究所有限公司）。在添加OADC的7H9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后感染細(xì)胞。

1.3 臨床樣品收集

50例活動(dòng)性結(jié)核患者以及50例健康對(duì)照人群的外周血標(biāo)本均收集自寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院。研究獲寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 活動(dòng)性結(jié)核患者的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

時(shí)間梯度：利用BCG感染RAW264.7細(xì)胞，根據(jù)感染時(shí)間的不同，將處理組分為5組，分別是：對(duì)照組（C）、BCG感染6 h組、BCG感染12 h組、BCG感染18 h組和BCG感染24 h組；濃度梯度：利用BCG感染RAW264.7細(xì)胞，根據(jù)感染復(fù)數(shù)的不同，將處理組分為5組，分別是：對(duì)照組（C）、5 MOI組、10 MOI組、15 MOI組和20 MOI組；小干擾RNA篩選：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將設(shè)計(jì)合成的3 條小干擾RNA 和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞。根據(jù)干擾位點(diǎn)分別將其命名為：陰性對(duì)照組（NC）、1153組、1810組和4524組；干擾試驗(yàn)共分為4 組：分別為陰性對(duì)照組（NC）、BCG 單獨(dú)感染組（BCG）、TRAF6 小干擾RNA 單獨(dú)處理組（siRNA）和TRAF6小干擾RNA與BCG共處理組（siRNA+BCG）；NC 組和BCG 單獨(dú)感染組均轉(zhuǎn)染小干擾RNA NC，siRNA 組和siRNA+BCG 組分別轉(zhuǎn)染TRAF6 小干擾RNA，轉(zhuǎn)染24 h 后，BCG 組和siRNA+BCG 組感染BCG（MOI=15）18 h。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者患有免疫缺陷類疾病或其它免疫系統(tǒng)疾??；（2）患者合并有肺癌、慢性阻塞性肺病或其它肺部疾??；（3）受到乙型肝炎病毒或其他細(xì)菌、病毒感染的患者；（4）患者合并有其它部位的結(jié)核、合并心臟疾病或組織器官的衰竭。

其次，高校文書檔案是總結(jié)管理得失、開展科學(xué)管理的重要依據(jù)。文書檔案是在學(xué)校發(fā)展建設(shè)中形成的，記錄了學(xué)校管理的得與失、好與壞、利與弊，這些都為科學(xué)管理提供了資料參考，為科學(xué)決策提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

1.5 健康對(duì)照人群的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上。每孔加入1 mLTrizol反復(fù)吹打后轉(zhuǎn)移至EP管中，靜置10 min。按照5∶1的比例在1 mL Triozl中加入200 μL氯仿，上下顛倒混勻后靜置2～3 min，12 000 r/min離心15 min。吸取最上層的透明液體約400 μL加入等體積的異丙醇，靜置30 min，12 000 r/min離心10 min。盡可能吸取上清后，每個(gè)樣品加入1 mL 75%乙醇，混勻后靜置10 min，12 000 r/min離心5 min。棄乙醇，每管加入100 μL 無(wú)核酶水，65 ℃水浴鍋助溶5 min。利用Nanodrop 8000檢測(cè)RNA濃度與純度。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）調(diào)查對(duì)象有乙肝、丙肝、艾滋等病毒或其他細(xì)菌感染；（2）調(diào)查對(duì)象為孕婦或哺乳期婦女；（3）調(diào)查對(duì)象近期有手術(shù)史；（4）調(diào)查對(duì)象近期有服用免疫類藥物、激素類藥物的經(jīng)歷；（5）調(diào)查對(duì)象不全或拒絕參與調(diào)查研究。

1.6 外周血樣本RNA的提取

調(diào)查對(duì)象于空腹?fàn)顟B(tài)下，采用EDTA抗凝管抽取外周血4～5 mL。將全血與RNA保護(hù)劑以3∶7的比例混合利用血液離心柱型總RNA提取試劑盒（無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司）提取全周血內(nèi)總RNA。

1.7 RAW264.7細(xì)胞RNA提取

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）調(diào)查對(duì)象既往身體健康，無(wú)高血壓等慢性疾病，無(wú)糖尿病、惡性腫瘤、結(jié)核病病史、近1月內(nèi)未使用免疫激活或抑制類藥物；（2）調(diào)查對(duì)象近兩周內(nèi)未有病毒、細(xì)菌感染病史；（3）調(diào)查對(duì)象體檢無(wú)異常表現(xiàn)，血液常規(guī)檢測(cè)顯示巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等指標(biāo)在正常范圍內(nèi)。

1.8 Q-PCR檢測(cè)TRAF6的表達(dá)

使用TransStart Tip Green Q-PCR Super Mix 對(duì)TRAF6進(jìn)行檢測(cè)。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍后備用，依次加入F引物、R引物、cDNA模板和ddHO（總體系20 μL）；隨后，采用Quant Studio 5 Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；程序運(yùn)行結(jié)束后，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（表1）。

1.9 TRAF6小干擾RNA設(shè)計(jì)

為探討敲減TRAF6對(duì)BCG感染的巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，流式細(xì)胞術(shù)被利用檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示：BCG感染RAW264.7后巨噬細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比顯著上調(diào)（＜0.001），但敲減TRAF6顯著抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡率（＜0.001，圖4）。

1.10 平板涂布法檢測(cè)巨噬細(xì)胞菌載量變化

由于BCG感染后TRAF6表達(dá)發(fā)生上調(diào)，本研究設(shè)計(jì)合成了3個(gè)TRAF6的小干擾RNA敲減RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TRAF6的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖2A），siRNA-1810的干擾效果最佳（=0.004），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用1810號(hào)小干擾RNA。通過(guò)Western blot檢測(cè)不同處理組中TRAF6的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，siRNA-TRAF6顯著下調(diào)BCG 感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)TRAF6 的表達(dá)（=0.002，圖2B）。隨后，進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光檢測(cè)TRAF6的表達(dá)，BCG感染顯著增加巨噬細(xì)胞內(nèi)TRAF6的綠色熒光斑點(diǎn)，而TRAF6小干擾RNA處理后，BCG感染巨噬細(xì)胞造成的熒光強(qiáng)度顯著減少（圖2C）。

1.11 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

例如：在設(shè)計(jì)三維目標(biāo)時(shí)，教師在確定了教學(xué)目標(biāo)之后，可以將其轉(zhuǎn)化為教學(xué)策略與教學(xué)手段，同時(shí)，結(jié)合教學(xué)目標(biāo)，教師更能明確學(xué)生所需掌握的知識(shí)與技能，從而在課堂教學(xué)過(guò)程中更具目的性，教學(xué)效率也會(huì)更高。

1.12 免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)

細(xì)胞在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。用4%多聚甲醛固定RAW264.7巨噬細(xì)胞，隨后用0.5%Triton X-100通透30 min并用3%BSA封閉細(xì)胞1 h。在37 ℃下將細(xì)胞與包括抗TRAF6（1∶200，Abcam）或Caspase 3（1∶200,Protein tech）在內(nèi)的一抗抗體孵育2 h。用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞與Alexa Fluor 488/555偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。然后用DAPI（中山金橋生物技術(shù)有限公司）封片。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡測(cè)定熒光強(qiáng)度。

我第一次見到朱炳仁，是在他的作品在北京展出的時(shí)候。我對(duì)他展示的各種各樣的作品感到有點(diǎn)困惑。我意識(shí)到，如果你想了解這種藝術(shù)手法，就需要從多方面了解這個(gè)藝術(shù)家。我們開始交談，很快就開始談?wù)摷夹g(shù)和技巧，我們倆都被技巧所吸引。他邀請(qǐng)我去吃晚飯，在那里我們聊得更久更深入。

1.13 Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

用BCG 和/或TRAF6 小干擾RNA 處理后，收集RAW264.7細(xì)胞并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司）評(píng)估細(xì)胞凋亡。在1×Binding buffer中重懸細(xì)胞后，使用PI 和Annexin V-FITC 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光以評(píng)估細(xì)胞凋亡的百分比。

2.2 兩組患兒治療前后呼吸指數(shù)指標(biāo)比較 治療前兩組患兒呼吸指數(shù)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，治療后患兒心率、呼吸顯著降低，氧合指數(shù)顯著升高，且觀察組患兒心率、呼吸顯著低于對(duì)照組,氧合指數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

1.14 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7 細(xì)胞線粒體膜電位

根據(jù)制造商的說(shuō)明，增強(qiáng)型線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）被利用檢測(cè)線粒體膜電位變化。收集RAW264.7細(xì)胞后取500 μL JC-1染色液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)20 min。染色后，將細(xì)胞用PBS洗滌2次，并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.15 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

納入標(biāo)準(zhǔn)：活動(dòng)性結(jié)核診斷參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺結(jié)核基層診療指南（2018年）以及肺結(jié)核診斷和治療指南（2001年）。納入研究的患者標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）患者痰液中檢出Mtb或Mtb體外培養(yǎng)為陽(yáng)性；（2）患者的痰涂片為陰性，但影像學(xué)、臨床癥狀及相關(guān)檢查確診為肺結(jié)核。

1.16 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCG感染RAW264.7巨噬細(xì)胞促進(jìn)TRAF6與凋亡標(biāo)志蛋白Caspase 3的表達(dá)

Mtb感染會(huì)導(dǎo)致宿主外周血、外周血單核/巨噬細(xì)胞中的多種蛋白差異表達(dá)。因此，本研究分別收集了50例活動(dòng)性結(jié)核患者和50例健康人群的外周血并利用QPCR對(duì)TRAF6的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與健康人群相比，TRAF6在活動(dòng)性結(jié)核患者外周血中高表達(dá)（＜0.001，圖1A）。為進(jìn)一步明確BCG感染RAW264.7細(xì)胞對(duì)TRAF6表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)首先利用Q-PCR對(duì)不同處理時(shí)間與不同感染復(fù)數(shù)下TRAF6 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著BCG感染時(shí)間與感染復(fù)數(shù)的不斷增加，細(xì)胞內(nèi)TRAF6 mRNA水平表達(dá)量逐漸上調(diào)，且在感染時(shí)間為18 h（＜0.001），感染復(fù)數(shù)為15（＜0.001，圖1B）時(shí)，TRAF6表達(dá)量達(dá)到最高。隨后，我們?cè)俅卫肳estern blot檢測(cè)BCG不同感染時(shí)間對(duì)TRAF6與凋亡標(biāo)志蛋白Caspase 3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示BCG感染18 h時(shí)TRAF6（=0.03）和Caspase 3的表達(dá)量達(dá)到最高（=0.04，圖1C），而24 h時(shí)兩者的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。由此可見，BCG感染RAW264.7細(xì)胞18 h可顯著上調(diào)TRAF6和Caspase 3蛋白的表達(dá)。隨后，以18 h作為BCG的感染時(shí)間，設(shè)置BCG不同感染復(fù)數(shù)感染RAW264.7細(xì)胞。結(jié)果顯示在感染復(fù)數(shù)為15時(shí)TRAF6（＜0.001）和Caspase 3的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（＜0.001，圖1D）。綜上，我們確定TRAF6在活動(dòng)性結(jié)核患者外周血中表達(dá)上調(diào)并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上明確了BCG誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡和TRAF6表達(dá)的最佳感染條件，即感染時(shí)間為18 h，感染復(fù)數(shù)為15。

2.2 小干擾RNA下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)TRAF6表達(dá)

實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，利用0.1%TritonX-100裂解細(xì)胞并收集上清，5000 r/min，離心5 min。棄掉上清后，用PBS將沉淀梯度稀釋涂布于7H10平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)14 d后計(jì)數(shù)。

2.3 敲減TRAF6促進(jìn)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞菌載量

將BCG感染后的RAW264.7細(xì)胞裂解后利用平板涂布法梯度稀釋于7H10平板上，37 ℃恒溫培育后檢測(cè)敲減TRAF6對(duì)巨噬細(xì)胞菌載量的影響。結(jié)果顯示：與BCG單獨(dú)處理組相比，敲減TRAF6顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞菌載量（=0.04，圖3）。

結(jié)束實(shí)驗(yàn)處理后，將貼壁生長(zhǎng)在6 孔板的RAW264.7細(xì)胞用PBS洗滌3次。細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解以提取總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒（Thermo fisher）測(cè)定蛋白濃度。隨后，用SDS-PAGE電泳緩沖液分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜與TRAF6（Abcam）、Caspase 3（Protein tech）、PARP（Cell Signal Technology）、Bcl-2（Protein tech）、BAX（Protein tech）以及β-actin（Protein tech）蛋白抗體一起4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后，將膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶，條帶密度通過(guò)Image J進(jìn)行量化的同時(shí)利用β-actin作為樣品標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。

2.4 敲減TRAF6抑制BCG感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7的凋亡率

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢鼠源TRAF6 mRNA的全長(zhǎng)序列，找到其蛋白編碼區(qū)（CDS），將該CDS區(qū)序列復(fù)制粘貼到在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（httPs://www.invivogen.com/sirnawizard/design.PhP）中，將符合設(shè)計(jì)條件的多條小干擾RNA置于NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)后將3條條件最佳的TRAF6小干擾RNA送至上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。具體序列如下（表2）。

2.5 敲減TRAF6下調(diào)BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

TRAF6 小干擾RNA 顯著抑制BCG 感染的RAW264.7巨噬細(xì)胞中Caspase 3（=0.002）和PARP的表達(dá)（＜0.001，圖5A）。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示（圖5B），BCG感染誘導(dǎo)了Caspase 3的表達(dá)，而TRAF6小干擾RNA顯著抑制BCG感染誘導(dǎo)的Caspase 3的表達(dá)，這與Western blot結(jié)果一致。

口腔種植系統(tǒng)能否種植成功主要取決于牙槽骨和種植體之間的結(jié)合度,這種結(jié)合稱之為骨性結(jié)合,而這種結(jié)合程度主要受種植材料以及表面處理技術(shù)的影響。種植體表面需要更好的生物活性,對(duì)血液中的蛋白成分有一定的吸附作用,進(jìn)而才能加快骨結(jié)合速度,這種方法充分利用了化學(xué)技術(shù),使植入體材料表面變得粗糙,同時(shí)也具備良好的親水性能。不但如此,醫(yī)療人員還考慮通過(guò)納米結(jié)構(gòu)加快骨結(jié)合[3]。

鋰電池隔膜生產(chǎn)線工藝運(yùn)行對(duì)環(huán)境溫度要求較嚴(yán)，大部分工段全年要求恒溫恒濕且工藝設(shè)備表面不得結(jié)露，否則會(huì)直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，保證空調(diào)系統(tǒng)冷凍水的溫度也是保證工藝生產(chǎn)出合格產(chǎn)品的重要條件。鑒于工藝?yán)鋬鏊彝獠糠至啃∏乙蟛桓?，在設(shè)計(jì)中將工藝與空調(diào)冷凍2個(gè)系統(tǒng)合二為一，冷凍水供水溫度按工藝廠房空調(diào)用水要求設(shè)計(jì)，管線設(shè)置按工藝設(shè)備冷凍用水要求設(shè)計(jì)。這樣既保證了廠房空調(diào)溫度要求,也滿足了工藝設(shè)備冷凍水連續(xù)性的要求。同時(shí)工藝和空調(diào)冷凍機(jī)組互為備用，減少了機(jī)器的備用臺(tái)數(shù)，降低了工程投資，簡(jiǎn)化了運(yùn)行操作。

2.6 敲減TRAF6抑制內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的激活

與對(duì)照組相比，BCG感染后巨噬細(xì)胞膜電位顯著上調(diào)（＜0.001），而敲減TRAF6后線粒體膜電位顯著下調(diào)（＜0.001，圖6A）。Western blot被利用檢測(cè)內(nèi)源性凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2與BAX的表達(dá)，結(jié)果顯示，敲減TRAF6顯著下調(diào)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中BAX表達(dá)（=0.005）的同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平（=0.04，圖6B）。

3 討論

作為結(jié)核病的致病菌，由于能夠在免疫功能正常的巨噬細(xì)胞中持續(xù)存活，Mtb被認(rèn)為是侵入機(jī)體最成功的傳染性病原體。一旦進(jìn)入下呼吸道，Mtb主要被巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞吞噬殺滅。然而，分枝桿菌的最新進(jìn)展表明，Mtb可以通過(guò)阻斷巨噬細(xì)胞凋亡幫助病原體在宿主中獲得穩(wěn)定的生存優(yōu)勢(shì)。將受感染巨噬細(xì)胞的“死亡”模式轉(zhuǎn)為壞死就是其中之一。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與分枝桿菌的毒力有關(guān)，研究表明，與H37Rv相比，BCG和H37Ra等弱毒株主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一致的是，我們通過(guò)BCG不同感染時(shí)間與BCG不同感染復(fù)數(shù)檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白Caspase 3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BCG感染后Caspase 3的表達(dá)呈濃度與時(shí)間依賴性。

于治療前與治療后，檢查：（1）牙周袋探診深度。牙周探針探測(cè)從牙周袋底至齦緣距離；（2）臨床附著水平。牙周袋底至釉牙骨質(zhì)界的距離；（3）牙齦指數(shù)。采用文獻(xiàn)[4]中的gingival index法，檢查全口四個(gè)牙面記分平均值，0～3分別表示牙齦健康、牙齦輕度炎癥、牙齦中度炎癥、牙齦嚴(yán)重炎癥；（4）牙槽骨高度。釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂之間距離；（5）牙齒松動(dòng)度。前牙松動(dòng)度：使用牙科鑷夾住前牙切緣，坐唇舌或近遠(yuǎn)中方向搖動(dòng)。后牙松動(dòng)度：閉合鑷子，其尖端抵住面窩，向頰舌或近遠(yuǎn)中方向搖動(dòng)。根據(jù)搖動(dòng)程度分別記錄1度、2度、3度。

TRAF6作為腫瘤壞死因子受體家族的標(biāo)志蛋白，是Toll樣受體（TLR）家族信號(hào)傳導(dǎo)的下游分子，參與Mtb感染并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程。作為一種銜接蛋白，其主要通過(guò)與TNFR和Toll/IL-1R家族成員的胞質(zhì)尾部結(jié)合，介導(dǎo)TNFR和Toll/IL-1R家族成員參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。通常而言，Mtb感染期間，巨噬細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別入侵的Mtb，信號(hào)經(jīng)TRAF6傳導(dǎo)激活NF-κB以及MAPK（如ERKs、JNKs和P38）信號(hào)通路，最終導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放和抗菌介質(zhì)的產(chǎn)生。研究表明，過(guò)表達(dá)TRAF6導(dǎo)致Mtb感染的巨噬細(xì)胞中促炎因子水平升高。而牛等人的研究表明，抑制TRAF6表達(dá)會(huì)導(dǎo)致NF-κB信號(hào)減弱，從而抑制巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生并促進(jìn)Mtb存活。TRAF6與Mtb之間的復(fù)雜關(guān)系不僅表現(xiàn)為TRAF6通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)Mtb的存活，很多研究也表明，TRAF6與細(xì)胞凋亡間存在復(fù)雜的作用關(guān)系。以結(jié)腸癌樣本為例，過(guò)表達(dá)TRAF6抑制細(xì)胞凋亡率。本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核病人外周血中TRAF6 表達(dá)量顯著上調(diào)，BCG 感染RAW264.7細(xì)胞后TRAF6的表達(dá)與該結(jié)果一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證TRAF6是否參與BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，TRAF6 小干擾RNA 被利用檢測(cè)敲減TRAF6 是否對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與BCG單獨(dú)感染組相比，TRAF6小干擾RNA顯著抑制BCG 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)TRAF6以正調(diào)控方式參與BCG誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑又稱線粒體凋亡通路，是由DNA 損傷引起的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。接收刺激后，BAX和BAK在線粒體外膜打孔降低線粒體外膜通透性，釋放的細(xì)胞色素c與APAF1和Caspase 9形成凋亡小體并激活Caspase 3。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵條件，它被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞死亡的不可逆轉(zhuǎn)點(diǎn)。促凋亡的BCL-2家族成員如BAX、BAK、BIM、BID、PUMA對(duì)細(xì)胞色素c的釋放起正調(diào)節(jié)作用，而抗凋亡的BCL-2家族成員如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、A1和MCL1對(duì)細(xì)胞色素c的釋放起負(fù)調(diào)節(jié)作用。已有文獻(xiàn)表明，穩(wěn)定表達(dá)BAX的新型重組BCG菌株(rBCG::BAX)無(wú)論在體外還是體內(nèi)均能顯著誘導(dǎo)感染rBCG:BAX的巨噬細(xì)胞凋亡。甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖是分支桿菌屬表面主要的糖脂成分，在BCG感染的巨噬細(xì)胞中通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)Bcl-2和下調(diào)BAX表達(dá)來(lái)保護(hù)巨噬細(xì)胞免受凋亡，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞感染。TRAF6作為調(diào)節(jié)免疫和炎癥信號(hào)的重要分子，在黑色素瘤細(xì)胞的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，TRAF6水平的降低直接影響凋亡蛋白BAX和Caspase 3的激活。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)敲減TRAF6后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平升高，最終積聚于線粒體外膜的BAX活性被抑制導(dǎo)致線粒體膜通透性降低，使線粒體內(nèi)膜中的細(xì)胞色素c的表達(dá)被抑制，從而影響Caspase的級(jí)聯(lián)反映。

（1）聚焦課堂。引導(dǎo)教師在教學(xué)中體現(xiàn)“尊重之道、引導(dǎo)之法、激發(fā)之術(shù)”，積極推進(jìn)課堂改革的四個(gè)“化”：一是國(guó)家課程校本化。允許、鼓勵(lì)教師結(jié)合實(shí)際對(duì)國(guó)家課程進(jìn)行校本化處理，如整合教學(xué)內(nèi)容、調(diào)整模塊順序、自編學(xué)習(xí)教材、創(chuàng)新教學(xué)方式。二是課程開發(fā)學(xué)科化。引導(dǎo)教師在教學(xué)中關(guān)注課程內(nèi)容的縱向拓展和橫向整合，關(guān)注對(duì)學(xué)生的生涯指導(dǎo)和知識(shí)的學(xué)以致用。三是優(yōu)質(zhì)課堂多元化。鼓勵(lì)教師不拘泥于固有教學(xué)模式，積極探索基于信息技術(shù)的多元互動(dòng)課堂，著力構(gòu)建問(wèn)題導(dǎo)向、高階思維的高效課堂。四是分層教學(xué)個(gè)性化。學(xué)校率先在廣州市探索高中分層走班教學(xué)改革，根據(jù)學(xué)生的學(xué)習(xí)層次和認(rèn)知水平實(shí)施個(gè)性化分層教學(xué)。

綜上所述，本研究首次探討了TRAF6與BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，并得出TRAF6通過(guò)內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路調(diào)控BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果豐富了BCG 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，也為Mtb致病機(jī)制的解讀提供了新的視角。