CD40LG是與浸潤性乳腺癌腫瘤微環(huán)境中免疫和基質(zhì)相關(guān)的預(yù)后標(biāo)志物

乳腺癌是世界上女性最常見的癌癥類型之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。盡管隨著技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的治療取得了很大的進步，但它仍然是女性惡性腫瘤的常見死因。研究表明僅靠臨床病理特征不能為乳腺癌患者提供準(zhǔn)確的預(yù)后信息，從而導(dǎo)致過度或不充分的治療。新的證據(jù)表明，使用腫瘤微環(huán)境（TME）相關(guān)免疫評分和TME中腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞（TIC）的比例提高了TNM分期系統(tǒng)的預(yù)測效率。TME由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、信號分子和細(xì)胞因子組成，其中免疫細(xì)胞可以影響腫瘤的生長。同時，基因表達(dá)異常與表觀遺傳學(xué)改變顯著相關(guān)，表達(dá)特征可預(yù)測臨床結(jié)果。因此，尋找一種可以預(yù)測癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物成為研究的熱點。

研究顯示目前已有CD2、CD52及ITK等基因被證實是乳腺癌免疫相關(guān)的預(yù)后因子。有研究表明CD40LG修飾的肺癌細(xì)胞外泌體能有效激活樹突狀細(xì)胞，抑制肺癌的進展，延長小鼠的生存時間。通過整合的生物信息學(xué)分析確定了CD40LG是乳腺癌的另一個免疫和TME調(diào)節(jié)密切相關(guān)的預(yù)后基因。但已有的研究缺乏相關(guān)的臨床實驗驗證。

本研究從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，并在臨床收集乳腺癌組織及癌旁組織。通過一系列生物信息學(xué)分析，11 個基因被認(rèn)為是乳腺癌的預(yù)后基因，其中CD40LG對乳腺癌患者的總生存期和臨床預(yù)后具有很大的預(yù)測價值，進一步運用Western blot和qRT-PCR法進行臨床驗證，證實CD40LG 在癌旁組織中高表達(dá)。CD40LG在TME中高表達(dá)與生存呈正相關(guān)，可能成為乳腺癌患者新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與處理

1.1.1 臨床資料 從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院收集2021年1月～2022年1月行乳腺癌改良根治術(shù)患者的癌組織24例和相對應(yīng)的癌旁組織24例為研究對象，患者均為女性，平均年齡51歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診為浸潤性乳腺癌；癌組織和癌旁組織（距腫瘤組織邊緣大于5 cm）均取自同一確診乳腺癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行新輔助治療，如化療、放療等；本研究已通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。

1.1.2 數(shù)據(jù)庫資料 本研究通過從癌癥基因組圖譜（TCGA）(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)下載乳腺癌數(shù)據(jù)集，獲得了1 222個轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)（124個正常樣本和1098個腫瘤樣本）。在排除沒有隨訪信息及隨訪時間較短的患者后，選擇了1046名患者進行進一步分析。應(yīng)用Estimate R軟件包中的Expression Data（Estimate）算法，以免疫評分（Immune Score）、基質(zhì)評分（Stromal Score）和總評分（Estimate Score）3個分?jǐn)?shù)的形式對各樣本的免疫成分和基質(zhì)成分在TME中所占的比例進行估計，得分越高，相應(yīng)成分在TME中所占的比例越大。

1.2 TME相關(guān)性分析

根據(jù)Stromal Score和Immune Score的中位數(shù)，將患者分為高、低基質(zhì)評分組和高、低免疫評分組，以總生存期（OS）為主要終點，用Kaplan-Meier（KM）生存分析判斷高、低基質(zhì)和免疫評分組之間是否存在差異，亞組間比較采用對數(shù)秩檢驗，＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗評價Stromal Score、Immune Score和Estimate Score評分在年齡、性別、病理分期、T分期、N分期和M分期上是否存在差異，＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 鑒定差異表達(dá)基因（DEGs）

按高分和低分分組，采用“LIMMA”軟件包進行篩查。篩選條件設(shè)置：|log2(FC)|＞1和調(diào)整后的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05。用R 語言的pheatmap 軟件包繪制DEGs 的熱圖。用clusterProfile、richlot和ggplot2R軟件包對DEGs進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）的富集分析并作圖，＜0.05和Q＜0.05的富集項目具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果用氣泡圖和圓圈圖可視化。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）使用交互置信度大于0.95的節(jié)點來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，利用Cytoscape中的CytosHubba插件進行模塊分析，根據(jù)多網(wǎng)絡(luò)聚類（MNC）的方法篩選出前30個有意義的基因。

1.4 單因素COX回歸分析

為了確定哪些DEGs 與OS 相關(guān)，我們使用“survival”R包進行單變量COX回歸分析，確定與總生存期相關(guān)的基因（＜0.05）。

1.5 CD40LG差異表達(dá)及生存分析

采用GSEAv4.1.0 軟件進行基因集富集分析（GSEA），確定CD40LG 高、低表達(dá)的相關(guān)生物學(xué)通路。當(dāng)＜0.05時，認(rèn)為該通路顯著富集。

1.6 GSEA（Gene Set EnrichmentAnalysis）分析

通過“bee colony”和“ggpubr”R 軟件包，采用Wilcoxon 秩和檢驗比較腫瘤組織和正常組織中CD40LG mRNA的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)中位數(shù)將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，兩組均采用“survival”R包進行生存分析。通過“ggpubr”R軟件包采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行臨床相關(guān)性分析，評價CD40LG表達(dá)與病理分期、T分期、M分期、N分期的關(guān)系。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤的計算

玉米膜下滴灌高產(chǎn)栽培技術(shù)是覆蓋、灌溉、高產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合的綜合技術(shù)。為了合理實施該技術(shù)，需要在種植初期進行一系列的前期準(zhǔn)備工作，在正式實施中，中后期滴灌管網(wǎng)的布設(shè)和田間管理尤為重要，加強灌區(qū)灌溉管理。積極開展化肥和施肥管理，從多個方面進行病蟲害防治，提高玉米產(chǎn)量。

1.8 Western blot實驗

主要試劑：乳腺細(xì)胞（MCF10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SK-BR-3、BT-474）（賽庫生物），液氮保存。兔抗人CD40LG單克隆抗體及山羊抗兔二抗（Proteintech）；蛋白總濃度測定（BCA法）蛋白定量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE 凝膠試劑盒均（南京凱基生物）。

使用CIBERSORT計算方法來估計腫瘤免疫細(xì)胞（即TICs）在所有腫瘤樣本中豐度分布的比例，并使用柱狀圖可視化。采用Wilcoxon 秩和檢驗比較CD40LG高、低表達(dá)腫瘤組織中CD40LG 表達(dá)的比例，并評價CD40LG表達(dá)與腫瘤組織比例之間的Pearson相關(guān)性。使用“violot”、“ggplot22”和“ggpubr”R軟件包制作散點圖和小提琴圖。

初中階段的學(xué)生在個性和思維等方面有著一定的獨特性，在教學(xué)過程中他們常常會脫離教學(xué)本質(zhì)，并且有著好動的特征。教師要正確引導(dǎo)，善于運用合適的方法和手段吸引學(xué)生注意力，從而達(dá)到預(yù)期的效果。更重要的是，教師應(yīng)該積極探索，結(jié)合實際，找出適合自己的一套教學(xué)方法，因材施教，形成優(yōu)秀的教學(xué)能力，培養(yǎng)更多的人才。

首先進行試劑配置及器皿處理，細(xì)胞處理同上；分別提取乳腺正常細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞和癌組織及癌旁組織中總RNA，并對提取的RNA 進行質(zhì)量檢測；根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，按照公司說明書操作配制反應(yīng)體系，將U6作為內(nèi)參，實驗結(jié)果采用2法進行表達(dá)量相對定量分析。qRT-PCR 引物序列：CD40LG 上游引物：5'-AATACCCACAGTTCCGCCAAACC-3'；下游引物：5'-CATTGACAAACACCGAAGCACCTG-3'；U6 上游引物：5'-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3'，下游引物:5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計中，模型的準(zhǔn)確性直接影響實驗的真實誤差以及最終結(jié)論。利用方差分析回歸方程中系數(shù)的顯著性可以進一步判斷模型的有效性[12]，模型可信度及方差分析結(jié)果分別見表3和表4。

我們的研究顯示，CD40LG在正常組織和配對組織中的表達(dá)明顯高于腫瘤樣本（＜0.05，圖6A、B）。根據(jù)CD40LG中位表達(dá)情況，將腫瘤標(biāo)本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。與CD40LG低表達(dá)組相比，BRCA患者高表達(dá)組OS顯著延長（圖6C）。在臨床病理分析中，CD40LG表達(dá)與病理分期、T分期顯著相關(guān)。CD40LG在TNMⅣ期的表達(dá)低于其他分期（Ⅳ期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，值分別為0.021、0.046、0.021)（圖6D）。同樣，CD40LG的表達(dá)也與T分期呈負(fù)相關(guān)（T4T1、T2、T3，值分別為0.0024、0.01、0.0037）（圖6E）。但在N分期和M分期兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖6F、G）。

1.9 qRT-PCR 法

從液氮罐中取出BRCA患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，手工充分磨碎后離心取上清液，通過蛋白總濃度測定（BCA法）測蛋白濃度。8%SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min；放入一抗工作液，4℃孵育過夜；TBST洗膜，5 min×5次；放入相應(yīng)二抗工作液中，室溫60 min；TBST洗膜，5 min×5次；通過ECL顯影，用Image J軟件對條帶進行灰度值檢測，結(jié)果用計算公式：目的蛋白的相對表達(dá)量＝目的蛋白吸光度值/β-Actin吸光度值。從液氮中取出細(xì)胞，解凍后進行離心、培養(yǎng)，將收取的細(xì)胞用蛋白裂解液充分裂解提取細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按照全蛋白提取試劑盒操作，后續(xù)操作同上。

2 結(jié)果

為了確定TME中免疫成分和基質(zhì)成分之間的差異，我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中1046例BRCA患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并比較了ImmuneScore 高低組和StromalScore組之間的基因表達(dá)，ImmuneScore高組和低組之間有1446 個DEGs（1256 個上調(diào)，190 個下調(diào)）（圖4A、B），StromalScore高、低組之間有1330個DEGs（1118個上調(diào)，212個下調(diào)）（圖4C、D）。分別于兩組中上調(diào)（圖4E）和下調(diào)（圖4F）基因取交集，最終獲得487個共享DEGs（其中447個上調(diào)，40個下調(diào)）。

團員青年代表黃捷、勞動模范代表黃紅雄、科技人員代表李雪梅在發(fā)言中表示，將繼承老一輩人的優(yōu)秀傳統(tǒng)，承擔(dān)起集團未來發(fā)展的重任，用自己的努力創(chuàng)造華誼新的輝煌。

2.1 ImmuneScore與乳腺癌患者生存率相關(guān)

根據(jù)各評分中位數(shù)（ImmuneScore、StromalScore、EstimatScore）將1046 份BRCA 樣本分為高、低評分組。采用Kaplan-Meier生存分析，探討各評分與總生存率的相關(guān)性。結(jié)果顯示，免疫評分與OS顯著相關(guān)，評分高的患者生存率高于評分低的患者（=0.011，圖2A）。然而，患者的StromalScore、EstimatScore和OS之間無顯著差異（圖2B、C）。

2.2 ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore與臨床病理特征的關(guān)系

為了確定免疫成分和基質(zhì)成分的比例與臨床病理特征之間的關(guān)系，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了BRCA樣本的臨床信息，包括年齡、性別、原發(fā)腫瘤大?。═分期）、區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)（N分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）和病理分期。ImmuneScore 與年齡、性別顯著相關(guān)（=0.048；=0.014），但在T分期、N分期、M分期及病理分期中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖3A）。StromalScore與年齡（=0.033）、T 分期、N 分期、II 期與I 期（=0.0082）、II期與III期（=0.0077）相關(guān)，但與性別和M期無顯著相關(guān)性（＞0.05，圖3B）。EstimateScore與N分期、M分期、病理分期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），與年齡、性別、T分期相關(guān)性顯著（圖3C）。

2.3 共享DEGs主要富含免疫相關(guān)功能

圖1是本研究的流程圖。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)（表1），包括124個正常樣本和1098個腫瘤樣本。臨床數(shù)據(jù)包括年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期、M分期及總生存期和生存狀態(tài)。利用ESTIMATE和CIBERSORT算法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。通過在高、低Immune Score組和Stromal Score組之間取交集獲得了DEGs。建立PPI網(wǎng)絡(luò)，進行單因素COX回歸分析，并對網(wǎng)絡(luò)核心基因和存活相關(guān)基因取交集，共獲得了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52、CD27 等11 個預(yù)后基因。我們選擇CD40LG進行了進一步的分析，包括差異表達(dá)分析、生存分析、臨床相關(guān)性分析和GSEA富集分析。最后運用Western blot實驗和qRT-PCR法分別驗證CD40LG在乳腺正常細(xì)胞及不同乳腺癌細(xì)胞和BRCA組織及癌旁組織中的表達(dá)水平。

利用GO和KEGG對這些共享基因進行分析，預(yù)測其功能。GO富集分析結(jié)果表明，DEGs主要富集在免疫應(yīng)答激活細(xì)胞表面受體和淋巴細(xì)胞免疫等免疫相關(guān)信號通路中（圖4G）。KEGG富集分析表明，DEGs富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、造血細(xì)胞系等（圖4H）。

從圖2看出，受成土母質(zhì)、風(fēng)化條件等因素的影響,臺子村農(nóng)田土壤中富含鈣質(zhì),所有樣點的鈣質(zhì)含量均處于高水平梯度，74.9%的樣點土壤鎂含量居中等水平,23.4%的樣點處于高水平,但臺子村亦存在少量的土壤低鎂區(qū)。硫作為一種主要的中量營養(yǎng)元素,在干旱的石灰性土壤中主要以無機硫形態(tài)存在，相對于南方,北方土壤更易產(chǎn)生缺硫現(xiàn)象,臺子村75.4%的樣點處于缺硫狀態(tài),處于中等水平的樣點占總樣點數(shù)的15.6%(圖2)。加強作物硫營養(yǎng)與改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì),如提高氨基酸、蛋白質(zhì)及油料作物油分含量,充足的硫營養(yǎng)有利于作物對水分的高效利用。因此,臺子村在施肥時應(yīng)著重考慮加大硫肥的施用,以防出現(xiàn)缺硫病征。

2.4 通過PPI 網(wǎng)絡(luò)和單變量COX 回歸分析獲得預(yù)后基因

利用487個DEGs通過STRING數(shù)據(jù)庫建立PPI網(wǎng)絡(luò)，最小置信值為0.9，由Cytoscape軟件顯示（圖5A）。然后按照節(jié)點數(shù)的順序得到前30 個網(wǎng)絡(luò)核心基因（5B）。為了確定提取的基因是否為影響乳腺癌預(yù)后的關(guān)鍵基因，對487個DEGs進行單因素COX回歸分析，截斷值＜0.05（圖5C）。最后，通過對PPI網(wǎng)絡(luò)中前30個網(wǎng)絡(luò)核心基因和單變量COX回歸分析的結(jié)果取交集（圖5D），獲得了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52、CD27共11個預(yù)后基因。

2.5 CD40LG的差異表達(dá)、生存分析及臨床病理特征分析

我國非常重視農(nóng)業(yè)的發(fā)展，出臺了一系列惠民政策。農(nóng)業(yè)節(jié)水灌溉技術(shù)的出現(xiàn)，使這些惠民政策減少了在灌溉方面的幫扶，增加了農(nóng)業(yè)其他方面的幫扶，推動了農(nóng)業(yè)的發(fā)展，促進了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的增長。

2.6 CD40LG相關(guān)的生物學(xué)途徑

GSEA 用于研究CD40LG 表達(dá)的生物學(xué)途徑，CD40LG的高表達(dá)主要集中在免疫相關(guān)通路（圖7），如B細(xì)胞受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路等。

2.7 CD40LG表達(dá)與TICs的關(guān)系

CD40LG高表達(dá)組和低表達(dá)組共獲得22種免疫細(xì)胞（圖8A）。通過差異分析和相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)14種免疫細(xì)胞與CD40LG的表達(dá)有關(guān)，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞CD8、T細(xì)胞CD4記憶靜息、T細(xì)胞CD4記憶激活、T細(xì)胞濾泡輔助細(xì)胞、T細(xì)胞調(diào)節(jié)因子（Tregs）、T細(xì)胞γδ、NK細(xì)胞靜息、巨噬細(xì)胞M0、M1、M2、樹突狀細(xì)胞靜息、肥大細(xì)胞靜息、中性粒細(xì)胞。

1.4.3 血脂相關(guān)指標(biāo) 比較兩組治療前后總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL‐C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL‐C）的變化，以上血脂相關(guān)指標(biāo)使用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定。

2.8 實驗測定CD40LG在細(xì)胞及臨床標(biāo)本中的表達(dá)

qRT-PCR顯示，CD40LG在BRCA組織中mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（＜0.05，圖9A）；同時，Western blot結(jié)果顯示，CD40LG在BRCA組織中蛋白表達(dá)水平也顯著低于癌旁組織（＜0.05，圖9B、C）。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，分子靶向治療是腫瘤治療的一個很有前途的研究方向，因此迫切需要探索乳腺癌發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)分子機制。目前，TME的研究因其在治療和預(yù)后方面的重要意義而成為研究熱點，乳腺癌的TME也引起了許多專家的關(guān)注。

本研究的目的是基于CIBERSORT和ESTIMATE兩種算法，試圖確定與BRCA 患者腫瘤發(fā)生相關(guān)的TME核心基因，并可能成為臨床治療的靶點。通過綜合生物信息學(xué)分析，我們得到了以下結(jié)果：ImmuneScore與BRCA患者的OS顯著相關(guān)，評分高的患者生存率高于評分低的患者；StromalScore與T分期、N 分期及病理分期有關(guān)，ImmuneScore 及ESTIMATEScore與年齡、性別相關(guān)；DEGs主要富集在免疫相關(guān)的信號通路中；CD40LG在正常及配對組織中的表達(dá)高于腫瘤組織；高表達(dá)組患者的OS優(yōu)于低表達(dá)組，且CD40LG在TNM Ⅳ期和T分期T4期的表達(dá)均低于其他各分期；通過差異分析及相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)14種免疫細(xì)胞與CD40LG表達(dá)相關(guān)。

盡管已有的研究表明CD40LG是BRCA患者有價值的預(yù)后分子標(biāo)志物，其低表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，但缺乏相關(guān)的臨床實驗驗證，我們的研究從細(xì)胞和組織兩個層面驗證了CD40LG在BRCA中的表達(dá)水平；其次，Yuan等只關(guān)注了免疫成分在乳腺癌中的作用，而忽視了基質(zhì)成分，本研究發(fā)現(xiàn)StromalScore與BRCA患者的臨床病理特征也具有相關(guān)性。

綜放工作面過渡液壓支架增高裝置分兩部分：底座和頂梁。兩部分結(jié)構(gòu)采用光銷和D型銷進行連接，組裝好后以“戴帽子”的形式安裝到工作面上端頭過渡液壓支架上增高，因此命名為增高裝置。其中底座的主要作用是和過渡液壓支架連接，并為頂梁提供連接和支撐，因此底座的形狀和過渡液壓支架頂部的形狀幾乎完全相同，規(guī)格比支架頂部略大，保證支架可以將“帽子”戴上，通過預(yù)留的孔眼使用鐵鏈螺栓等固定牢固；頂梁的形狀類似一個小支架，以方便將頂板支護完全，可使支架的支護高度由原來的最大2.8m提高到4.3m。具體參數(shù)如下：

ESTIMATE 算法可以預(yù)測腫瘤純度并使用ImmuneScore和StromalScore描述腫瘤組織中浸潤的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的比例?；赥CGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們觀察到高ImmuneScore組患者的OS顯著延長，這表明免疫成分是預(yù)測預(yù)后的潛在因素。這與以往的研究一致。已發(fā)表的研究表明，在結(jié)腸癌中ImmuneScore是預(yù)測結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險的可靠、有效的臨床方法，其對預(yù)后的評估優(yōu)于包括TNM、MSI在內(nèi)的其他預(yù)后因素。在臨床相關(guān)性方面，本研究顯示StromalScore與T分期、N分期及TNM分期有關(guān)，這提示基質(zhì)細(xì)胞含量在一定程度上影響著乳腺癌的侵襲、遷移等方面的病程發(fā)展。在乳腺癌的小鼠模型中，基質(zhì)細(xì)胞的生長促進作用因糖酵解抑制而受損，表明基質(zhì)通過分泌乳酸鹽為惡性細(xì)胞提供營養(yǎng)支持。但值得注意的是ImmuneScore與患者的各分期并不相關(guān)，考慮可能是由不同腫瘤階段免疫細(xì)胞浸潤類型的差異導(dǎo)致的。

通過GO及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在免疫相關(guān)的途徑中。為了進一步研究預(yù)后基因，我們建立了PPI網(wǎng)絡(luò)，并用DEGs進行了單變量COX回歸分析，在此基礎(chǔ)上確定了CD40LG、ITK、CD5、CD3E、SPN、IL7R、CD48、CCL19、CD2、CD52和CD2711個預(yù)后基因。因CD40LG的HR最小，提示可能是更好的保護因素，所以選擇該基因作進一步分析。

植物誘抗劑-IR-18對向日葵列當(dāng)?shù)囊种菩Ч皯?yīng)用…………… 云曉鵬，杜 磊，白全江，孫 濤，田曉燕，蘇雅杰，張 光（77）

CD40LG是與CD40結(jié)合的細(xì)胞因子，一種Ⅱ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）基因超家族。CD40-CD40LG相互作用是B細(xì)胞增殖、活化標(biāo)志物表達(dá)、免疫球蛋白產(chǎn)生和同型轉(zhuǎn)換的重要信號，可直接抑制CD40陽性癌細(xì)胞的生長，并可能通過協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)間接抑制腫瘤的生長。本研究中CD40LG在正常及配對組織中的表達(dá)高于腫瘤組織，且其高表達(dá)BRCA患者的OS顯著延長；通過qRT-PCR和Western blot實驗也證實了癌組織中的CD40LG在mRNA和蛋白水平的表達(dá)低于癌旁組織。有研究報道了一種利用神經(jīng)干細(xì)胞的腫瘤歸巢特性將CD40LG分子運送到腫瘤組織中的治療方法，即用編碼CD40LG的桿狀病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，靜脈注射到免疫活性良好的原位乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)治療阻礙了腫瘤的生長，使荷瘤小鼠的存活時間延長。在臨床病理特征方面，CD40LG在TNM Ⅳ期和T分期T4期的表達(dá)均低于其他各期，表明CD40LG的低表達(dá)可能與BRCA的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，導(dǎo)致預(yù)后不良。

為了探討CD40LG表達(dá)與BRCA患者TME的關(guān)系，我們進行了GSEA富集分析。分析發(fā)現(xiàn)CD40LG高表達(dá)主要涉及免疫相關(guān)信號通路，如B細(xì)胞受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路等。這些結(jié)果證實了CD40LG 可以通過不同的途徑調(diào)控BRCA 的免疫細(xì)胞。此后，通過CIBERSORT計算方法從BRCA樣本中獲得了22種免疫細(xì)胞，其中14種與CD40LG的表達(dá)相關(guān)。這表明CD40LG的生物學(xué)行為取決于表達(dá)水平和TIC表型，這可能為靶向治療和分子生物學(xué)進展提供新的見解。但具體的作用機制目前并不清楚，有待進一步的研究。

綜上所述，本研究采用多種算法證實TME中免疫成分高的BRCA患者具有更好的總生存期。此外，我們還篩選出了一個免疫相關(guān)基因CD40LG，該基因在TME中高表達(dá)與BRCA患者的生存呈正相關(guān)，且臨床實驗證實與癌組織相比，CD40LG在正常組織中高表達(dá)。因此，CD40LG可能是一種新的用于預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物。另外，CD40LG主要富集在免疫相關(guān)的信號通路中，有望成為免疫治療的靶點。