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    基于SIRT1信號通路探究電針對腸易激綜合征伴抑郁情緒的作用機制

    2022-10-01 12:46:34馮袁輝楊易辰周子嫻張麗萍任曉暄陳俊陶馬惠芳
    針灸臨床雜志 2022年9期
    關鍵詞:可塑性造模電針

    馮袁輝,楊易辰,周子嫻,張麗萍,張 鵬,任曉暄,陳俊陶,馬惠芳△

    (1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029;2.唐山市豐南區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,河北 唐山 063000;3.北京市朝陽區(qū)東風社區(qū)衛(wèi)生服務中心,北京 100025;4.北京市朝陽區(qū)望京社區(qū)衛(wèi)生服務中心,北京 100025)

    腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一種慢性的功能性胃腸疾病,伴隨著腸道習慣的改變而出現(xiàn)腹痛,IBS在全球的患病率約為10%~25%[1],我國的IBS患病率約為5%~7%[2]。IBS發(fā)病機制復雜,其病理生理學范圍廣泛,包括運動、內臟感覺和心理社會困擾等異常[3]。研究表明IBS患者常伴有抑郁障礙[4]。而IBS患者伴隨的抑郁情緒可因胃腸道癥狀的緩解而隨之改善[5]。但IBS伴抑郁情緒作用機制尚不明確,仍需要進一步探討。

    Sirtuins蛋白家族(SIRT)是一類具有NAD+依賴性脫乙酰酶活性或 ADP-核糖基轉移酶活性的蛋白,屬于第三類組蛋白去乙?;?。沉默信息調節(jié)因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)是研究最廣泛的sirtuin,存在于細胞核和細胞質中[6-7]。SIRT1不僅與IBS內臟痛密切相關[8],SIRT1缺失會抑制環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB) mRNA的翻譯,從而下調腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)[9-10],影響海馬神經元突觸的形態(tài)和功能,與抑郁情緒同樣密切相關。小鼠經過慢性變化壓力(Chronic variable stress,CVS)后,給予SIRT1抑制劑會導致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為[11]。SIRT1信號通路的異??赡苁荌BS伴抑郁狀態(tài)的病理基礎之一。因此,本實驗電針“天樞”“上巨虛”,觀察其對IBS伴抑郁情緒大鼠胃腸癥狀和抑郁情緒的影響,并通過檢測結腸組織SIRT1和海馬組織中SIRT1、CREB及BDNF蛋白表達,探討針刺對IBS伴抑郁情緒的作用機制,為針灸治療IBS伴抑郁情緒的遠端配穴提供實驗依據。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    SPF級SD大鼠36只,8周齡,雄性,體質量220~250 g,由北京斯貝福生物技術有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學良鄉(xiāng)校區(qū)動物房,飼養(yǎng)條件:光照周期12 h/12 h,光照 8:00—20:00,黑暗 20:00—8:00,室溫23 ℃,濕度(55±5)%,每日定時清潔通風,每籠 3 只,動物可自由活動、進食水。大鼠隨機分為空白組、模型組、電針組與西藥組。實驗開始前適應性喂養(yǎng) 7 d。實驗中對動物的處置遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。

    1.2 主要儀器及試劑

    1.2.1 試劑 二硝基苯磺酸(Dinitrobenzenesulfonic acid,上海晨易生物有限公司);毫針0.25 mm×13 mm(北京中研太和科技有限公司);直腸給藥管(7號,四川益泰醫(yī)療器械有限公司);匹維溴銨片(北京萬生藥業(yè)有限責任公司);重組Anti-SIRT1抗體(ab189494,英國abcam公司);重組Anti-CREB抗體(ab32515,英國abcam公司);重組Anti-BDNF抗體 (ab108319,英國abcam公司)。

    1.2.2 儀器 電針儀(長城牌KWD-808I,常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司);包埋機(TB718,湖北泰維科技實業(yè)有限公司);切片機(RM2235,德國Leica);組織脫水機(ST5020,德國Leica);顯微鏡(Olympus×51,日本Olympus公司)。

    1.3 造模方法

    造模方法選擇二硝基苯磺酸(DNBS)灌腸結合慢性束縛應激方法,創(chuàng)建IBS伴抑郁情緒大鼠模型。

    1.3.1 DNBS灌腸 除空白組外,第7天禁食24 h,用棉棒輕觸大鼠尾根部刺激排便,腹腔注射 7%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,滴有石蠟油的8 F 導尿管緩慢插入肛門8 cm,緩慢注入DNBS溶液(50 mg/kg,混入50%乙醇溶液1 mL中)于結腸,完成后保持大鼠頭低位3 min,避免從肛門回流??瞻捉M用等體積0.9%生理鹽水灌腸,灌腸操作與造模組方法相同,常規(guī)喂養(yǎng)7 d以保證炎癥形成。

    1.3.2 慢性束縛應激 DNBS處理完成后,于第16天進行慢性束縛應激方法。將大鼠仰面置于鼠板上,用扎帶固定頸下、腋下和盆骨上3個部位,并固定上肢,以“大”字形束縛,持續(xù)3 h。束縛結束后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng),持續(xù)7 d。

    1.4 干預方法

    干預操作在第24天進行??瞻捉M:黑布包裹固定,20 min/d,不予其他處理。模型組:同空白組。電針組:黑布包裹固定后進行針刺。選擇雙側“天樞” “上巨虛”。穴位定位參照《實驗針灸學》(中國中醫(yī)藥出版社出版)。穴位定位:“天樞”位于大鼠腹部,臍中旁開5 mm,直刺4 mm;“上巨虛”位于腓骨小頭下10 mm處,直刺7 mm。同側天樞和上巨虛連接電針儀,疏密波,頻率2/100 Hz, 強度以局部肌肉顫動為準,留針20 min。 西藥組:匹維溴銨片(18 mg/kg,溶于1 mL 0.9%NaCl溶液中)灌胃處理。 以上處理方法1次/d,持續(xù)7 d。

    1.5 取材及指標檢測

    1.5.1 大鼠一般情況觀察 實驗過程中,于造模前、造模后和干預后記錄大鼠的狀態(tài)及日常行為,每周測量1次大鼠體質量和24 h進食量。

    1.5.2 內臟敏感性測試 分別于造模前、造模后與干預后進行內臟敏感性測試,選擇腹壁撤退反射[12](Abdominal Withdrawal Reflex,AWR)檢測進行評估。固定大鼠,球囊頭端涂抹石蠟油后緩慢插入肛門約 8 cm,用膠布帶與鼠尾固定,向自制直結腸擴張球囊中持續(xù)90 s注水使球囊擴張。標記起始收縮波的潛伏期和收縮波個數(shù)。每只30 min以上重復檢測3次,取其平均值。

    1.5.3 曠場實驗(Open Field Test,OFT) 分別于造模前、造模后與干預后進行曠場實驗[13],測定大鼠在5 min內的中央區(qū)活動時間、中央區(qū)活動距離與總距離。

    1.5.4 組織取材 行為學檢測結束后立即取材。隨機每組取6只大鼠,10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,取結腸及海馬組織,4%多聚甲醛固定12~24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋,切片(厚度為4 μm);另一部分保存于-80 ℃冰箱待蛋白檢測。

    1.5.5 Western Blot檢測大鼠結腸SIRT1及海馬SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表達情況 將結腸及海馬組織用冷TBS洗滌,去血,剪碎置于勻漿器,RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿,將勻漿液轉移至1.5 mL離心管中,振蕩,冰浴30 min,裂解,12 000 r/min離心5 min,提取蛋白。制備SDS-PAGE凝膠,上樣、電泳和轉膜,5%脫脂牛奶封閉2~3 h,孵育一抗(SIRT1蛋白1∶300,CREB蛋白1∶300,BDNF蛋白1∶300,GAPDH 1∶2 000)洗膜,孵育二抗,ECL化學發(fā)光檢測。

    1.5.6 免疫組化法檢測大鼠結腸SIRT1及海馬SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表達情況 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后行抗原修復(具體操作嚴格按照試劑盒進行),光學顯微鏡下觀察,計算陽性表達平均吸光度值(AOD=IOD/A)。

    1.6 統(tǒng)計學處理

    2 結果

    2.1 一般情況

    2.1.1 空白組 大鼠毛色光滑,整體狀態(tài)良好,動作迅速,反應敏捷,肛周潔凈,糞便成型呈顆粒狀。

    2.1.2 模型組 造模前一般情況與空白組相同,造模后,大鼠毛色逐漸發(fā)黃,且1周后出現(xiàn)干枯現(xiàn)象,精神狀態(tài)一般,糞便尚可成型,無穢臭味,黃色較軟便,大鼠間偶有攻擊及撕咬;DNBS 造模完成后,大鼠狀態(tài)疲憊,毛發(fā)枯燥黃干,糞便稀溏,不成型,沾染肛周;慢性束縛應激方法造模后,大鼠精神萎靡不振,毛色焦黃易脫,反應不靈活,糞便稀溏,臭味濃,附著肛周,鼠間有撕咬現(xiàn)象,偶有舔舐腹部,畏懼實驗人員,甚有抓咬現(xiàn)象。

    2.1.3 電針組 造模前與空白組相似;造模期間,與模型組相似;造模及干預7 d后,大鼠反應速度尚可,毛發(fā)光澤度變亮,干枯改善,畏懼及撕咬現(xiàn)象減輕,肛周附著少量黃色物,糞便基本成型,無臭穢氣味。

    2.1.4 西藥組 造模前與空白組相似;造模期間,與模型組相似;造模及干預7 d后,大鼠反應速度尚可,毛發(fā)光澤度變亮,干枯改善,畏懼及撕咬現(xiàn)象減輕,肛周附著少量黃色物,糞便基本成型,個別大鼠排出稀便,無臭穢氣味。

    2.2 各組大鼠體質量及 24 h進食量比較

    與空白組比較,模型組體質量、24 h進食量降低(P<0.01或P<0.05),而電針組、西藥組可有效增加體質量及進食量(P<0.01或P<0.05)。電針組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1~2。

    表1 各組大鼠體質量結果

    表2 各組大鼠24 h進食量比較

    2.3 各組大鼠AWR實驗結果比較

    干預后,模型組的第1次收縮波潛伏期明顯低于空白組(P<0.01),電針組和西藥組明顯高于模型組(P<0.01);90 s內收縮波個數(shù)比較,模型組明顯高于空白組(P<0.01),電針組與西藥組低于模型組(P<0.05)。見表3~4。

    表3 各組大鼠第1次收縮波潛伏期比較

    表4 各組大鼠90 s內收縮波個數(shù)比較

    2.4 各組大鼠曠場實驗結果

    干預后,模型組中央區(qū)活動時間、中央區(qū)活動距離和總距離皆明顯低于空白組(P<0.01),電針組及西藥組高于模型組(P<0.05或P<0.01)。見表5。

    表5 干預后各組大鼠曠場實驗結果

    2.5 結腸組織SIRT1蛋白表達量

    Western blot法檢測顯示,干預后,模型組結腸組織中SIRT1蛋白表達量明顯低于空白組(P<0.01),電針組及西藥組結腸組織中SIRT1蛋白表達量與模型組比升高(P<0.01)。見圖1、表6。

    表6 各組大鼠結腸SIRT1蛋白表達量

    免疫組織化學法檢測示,陽性表達呈棕褐色,與空白組比較,模型組 SIRT1陽性表達減弱;與模型組比較,電針組及西藥組陽性表達增強。SIRT1平均吸光度值,與空白組比較,模型組明顯降低(P<0.01);與模型組比較,電針組及西藥組明顯增加(P<0.01)。見圖2、表7。

    表7 各組大鼠結腸SIRT1平均吸光度比較

    2.6 海馬組織SIRT1、CREB和BDNF蛋白表達量

    Western blot法檢測顯示,與空白組比較,模型組海馬組織SIRT1、CREB及BDNF蛋白的表達減少(P<0.01);與模型組比較,電針組及西藥組升高(P<0.05或P<0.01)。見圖3、表8。

    表8 各組大鼠海馬SIRT1、BDNF及CREB蛋白相對表達量

    免疫組織化學法檢測示,陽性表達呈棕褐色,與空白組比較,模型組SIRT1、CREB及BDNF陽性表達減弱;與模型組比較,電針組及西藥組SIRT1、CREB及BDNF陽性表達增強。平均吸光度值,與空白組比較,模型組明顯降低(P<0.01);與模型組比較,電針組及西藥組明顯增加(P<0.01或P<0.05)。見圖4、表9。

    表9 各組大鼠海馬組SIRT1、BDNF及CREB平均吸光度比較

    3 討論

    目前現(xiàn)代醫(yī)學認為腸易激綜合征的病因尚未明了,病因學的研究主要涉及飲食因素、精神心理因素、遺傳因素、感染因素及免疫因素等,腸易激綜合征是一種多因素異質性疾病,其機制與胃腸動力學異常、內臟高敏感性與腦-腸軸異常等有關[14]。一項為期 12 年的研究顯示,基線時無精神心理異常的IBS 患者在隨訪期發(fā)展為抑郁的風險是無任何功能性胃腸病健康對照組的1.10倍[15]。其主要機制可以用“腦-腸軸”學說來解釋,“腦-腸軸”學說是指腸道與大腦之間的雙向溝通,負性情緒通過“腦-腸軸”在腸道功能中起著重要作用[16-17]。當嚙齒類動物受到慢性壓力等負向情緒時,海馬體是大腦中最敏感的區(qū)域之一,慢性應激暴露的嚙齒動物的海馬結構可塑性損傷[18-19],神經元負責整合和傳遞信號,響應內在和外在的信息[20],影響突觸連接的神經可塑性,以平衡腦功能。研究表明,神經可塑性功能障礙是抑郁癥的基本發(fā)病機制[21]。因此,海馬結構可塑性功能障礙可能參與IBS 伴抑郁情緒發(fā)病。

    Caruso R等[22]研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者的結腸活檢中,SIRT1表達量下調。SIRT1在老年小鼠腸上皮特異性敲除后會引起自發(fā)炎癥和結腸組織損傷,增加其對結腸炎的易感性[23]。白藜蘆醇誘導大鼠產生的SIRT1通過NF-κB下調炎癥,對急性腸道炎癥有保護作用[24-25]。大建中湯對IBS能通過在基因及蛋白水平上促進SIRT1表達,激活SIRT1/NF-κB p65信號通路以達到治療IBS內臟痛的目的[26]。SIRT1信號通路是治療IBS一條潛在的通絡。

    本研究使用聯(lián)合造模法[27-28],腹壁撤退反射以示大鼠腸道對壓力刺激的痛覺敏感度,是 IBS模型制備成功的標準[29]。在本實驗中,AWR潛伏期明顯縮短、收縮波個數(shù)明顯增多,說明IBS造模成功。IBS 中醫(yī)中屬“腹痛”“泄瀉”等疾病范疇,中醫(yī)認為其病位在腸。天樞穴,大腸經募穴,具有疏調腸腑、導滯通便的功效[30]。上巨虛,大腸經的下合穴,善理氣化滯、通調腸腑。經研究“合募配穴”治療腸易激綜合征療效顯著[31]。因此,本實驗選用電針大腸經“合募配穴”,即“天樞”“上巨虛”,電針治療后,AWR收縮波潛伏期增長,收縮個數(shù)降低,說明IBS大鼠內臟敏感性降低。而IBS大鼠結腸SIRT1表達量降低,電針治療后SIRT1表達量增高,說明電針可調控結腸SIRT1表達量,激活了結腸SIRT1信號。

    SIRT1也是大腦中一種重要的調節(jié)因子,特別是在海馬體、基底神經節(jié)和前額葉皮質中[32]。既往研究[33]表明,SIRT1調節(jié)神經元分化、保護和突觸可塑性,這些功能與認知功能主要相關。海馬中 SIRT1具有抗抑郁的作用,慢性不可預測溫和應激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)建模的抑郁大鼠海馬齒狀回的SIRT1活性降低[34]。既往研究發(fā)現(xiàn),SIRT1缺失會導致突觸可塑性損傷,BDNF和CREB表達降低[35]。而腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF是神經元活動和突觸可塑性之間的調節(jié)器[33],BDNF的改變是神經可塑性受損的基礎[36],CREB又是調節(jié)BDNF和記憶形成的重要轉錄因子[37],CUMS暴露降低CREB/BDNF的表達,而電針及西藥上調CREB磷酸化,促進CREB下游靶基因BDNF的轉錄[38],調節(jié)神經可塑性損傷。

    本實驗電針治療后,中央區(qū)活動時間、中央區(qū)活動距離與總距離皆明顯增加,說明經過電針干預后,IBS 大鼠抑郁情緒得到一定的緩解。檢測海馬組織SIRT1、BDNF及CREB結果表明其表達量均降低,即IBS伴抑郁情緒大鼠海馬組織SIRT1、 BDNF及CREB表達下調。以往研究[10]表明 SIRT1可介導CREB和BDNF表達,SIRT1缺失導致miR-134表達上調,抑制CREB mRNA翻譯,下調CREB和BDNF,導致突觸可塑性和記憶受損。近期研究[39-41]發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥治療抑郁小鼠,可能是通過 cAMP/CREB/BDNF信號通路,上調海馬CREB、p CREB及BDNF水平,修復突觸可塑性,保護神經可塑性,進而改善抑郁小鼠的認知行為。本實驗結果表明電針上調了大鼠海馬SIRT1、BDNF及CREB蛋白的表達,抑郁情緒得以改善,這與以往的研究相符。由此,筆者認為電針可調控結腸SIRT1表達量,可能通過腸道與大腦之間的雙向溝通,激活了海馬組織 SIRT1/CREB/BDNF信號通路,這可能是電針對腸易激綜合征伴抑郁情緒的潛在作用機制。

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