冷休克法誘導(dǎo)烏蒙山金線鲃三倍體及其生長分析

華澤祥，郗啟文，陳 俊，陳家磊，武祥偉，黃松茂，趙玉姣，張銘梟

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，昆明 650034)

魚類多倍體育種是細(xì)胞工程育種的重要內(nèi)容，而三倍體育種又是多倍體育種的主要方向。理論上三倍體魚類卵原細(xì)胞不能完成正常的減數(shù)分裂，具有較高的不育性，因而能將更多能量用于個(gè)體生長，具有生長速度快、肉質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外已在鯉()、黃顙魚()、團(tuán)頭魴()、烏鱧()、虹鱒()、大西洋鮭()等40余種淡、海水魚類中成功誘導(dǎo)了三倍體。其中，虹鱒、大西洋鮭等三倍體育種體系最為成熟，已在世界范圍內(nèi)商業(yè)化推廣養(yǎng)殖。國內(nèi)不僅在多種經(jīng)濟(jì)魚類中成功獲得了三倍體，而且開發(fā)了多種三倍體人工誘導(dǎo)技術(shù)，例如異育銀鯽()、湘云鯽()、湘云鯉()等建立了完善的三倍體育種技術(shù)體系，三倍體品種獲得了規(guī)?；茝V養(yǎng)殖。

烏蒙山金線鲃()隸屬于鯉科(Cyprinidae)鲃亞科(Barbinae)金線鲃屬()。金線鲃屬是我國特有鲃亞科魚類，也是鲃亞科的最大屬。云南分布有金線鲃屬魚類30余種，烏蒙山金線鲃即是其中一種，主要分布于云南省烏蒙山主峰地區(qū)的地下暗河與龍?zhí)吨?，目前已在云南曲靖、昆明等地多個(gè)養(yǎng)殖場馴化養(yǎng)殖。金線鲃屬魚類多為小型魚類，其遺傳改良及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展緩慢。烏蒙山金線鲃個(gè)體大，具有較大的開發(fā)利用潛力，烏蒙山金線鲃三倍體的誘導(dǎo)與培育將為其遺傳改良開辟新的途徑。但目前尚無金線鲃屬魚類人工誘導(dǎo)三倍體的報(bào)道，本研究建立了烏蒙山金線鲃三倍體誘導(dǎo)方法，并比較分析了三倍體與二倍體仔稚魚的生長特征，以期為其遺傳改良與倍性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

烏蒙山金線鲃購自云南省尋甸縣金線鲃養(yǎng)殖場，體表無病無傷、體質(zhì)健壯、性成熟的3齡雌、雄親魚各30尾，體重分別為(134.48±21.21) g和(84.77±18.62) g，采用LRH-A2和絨毛膜促性腺激素(寧波第二激素廠，寧波)人工催產(chǎn)促使成熟，并擠取精卵進(jìn)行人工授精，受精卵等分成若干份作為誘導(dǎo)組與對照組，每組200枚受精卵布于直徑15厘米玻璃培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場進(jìn)行。

1.2 冷休克實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究參考文獻(xiàn)[1-4]，設(shè)置2～3 ℃為誘導(dǎo)溫度，起始誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為受精后3、4、5 min起始誘導(dǎo)組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間為10、15、20、25、30 min，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 仔魚培育

將誘導(dǎo)組與對照組置于17～18 ℃的微流水中孵化出膜，每組仔魚置于小型網(wǎng)箱中(網(wǎng)箱網(wǎng)衣為40目，長×寬×高=20 cm×20 cm×30 cm)，所有網(wǎng)箱置于水深50 cm的玻璃鋼養(yǎng)殖槽中室內(nèi)微流水培育；開口餌料為蛋白含量34%的鯉科魚類粉狀開口料，每天投喂3次，投喂及攝食期間停止流水。

1.4 倍性鑒定

每組隨機(jī)取30尾未開口攝食的初孵仔魚制備單細(xì)胞懸液，使用雙蒸水將仔魚清洗2次，移入1.5 mL離心管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)后破碎仔魚，懸液經(jīng)300目細(xì)胞篩過濾至2 mL離心管中，并補(bǔ)加0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，4 ℃下4 000 r/min離心1 min，棄上清1 mL，剩余濃縮液重懸即為單細(xì)胞懸液。使用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,CytoFlex,USA)測定DNA含量。烏蒙山金線鲃二倍體初孵仔魚作為對照，上機(jī)前使用溴化碘碇(PI)對制備的單細(xì)胞染色2 min，當(dāng)誘導(dǎo)組細(xì)胞DNA相對含量是二倍體的1.5倍時(shí)判定為三倍體。

1.5 受精、孵化及生長數(shù)據(jù)收集與處理

統(tǒng)計(jì)每組200枚卵的受精率、孵化率、畸形率及三倍體率。受精后12 h統(tǒng)計(jì)各組受精率(原腸中后期胚胎占總卵數(shù)的比例)，全部出膜孵化后統(tǒng)計(jì)各組孵化率(孵化出膜的受精卵數(shù)占總受精卵數(shù)的比例)；孵化出膜7 d后計(jì)算畸形率(畸形個(gè)體數(shù)占孵化仔魚總數(shù)的比例)；開口攝食前計(jì)算各組三倍體率(即三倍體個(gè)體的比例)，并計(jì)算孵化時(shí)間(第一個(gè)仔魚孵化出膜的時(shí)間)。

初孵仔魚開口攝食前測量體長(精確至0.01 mm)，在60日齡與180日齡測量體長與體重(精確至0.01g)，每組每次隨機(jī)測量30尾個(gè)體。使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同一因素下不同水平采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著水平為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)條件

受精3 min起始誘導(dǎo)組(圖1A)，三倍體率為4.17%～31.50%，受精率為56.05%～68.38%、孵化率為40.33%～47.08%，畸形率為41.66%～71.25%，20 min時(shí)三倍體率(31.50%)最高。

受精4 min起始誘導(dǎo)組(圖1B)，三倍體率為10.00%～75.00%，誘導(dǎo)25 min時(shí)三倍體率最高，畸形率(41.07%)較高，孵化率(41.52%)最低，受精率(74.64%)較高。

受精5 min起始誘導(dǎo)組(圖1C)，三倍體率分別為15.00%、87.50%、85.50%、100%、100%，誘導(dǎo)25 min時(shí)三倍體率為100%，受精率(64.55%)與孵化率(60.61%)最高，而畸形率(26.54%)最低。

圖1 烏蒙山金線鲃三倍體誘導(dǎo)的受精率、孵化率、畸形率與三倍體率Fig.1 Fertility rate,hatching rate,aberration rate,and triploid rate in the triploid-induced S.wumengshanensisA、B、C.誘導(dǎo)起始時(shí)間受精后3、4、5 min；同組立柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；下圖同

5 min起始誘導(dǎo)組仔魚死亡率隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長呈增加趨勢，最大死亡率為39.38%(誘導(dǎo)30 min)；3 min與4 min起始誘導(dǎo)組的死亡率先增加，最大死亡率分別為26.88%(誘導(dǎo)20 min)與33.65%(誘導(dǎo)15 min)，之后逐漸降低(圖2)。

圖2 烏蒙山金線鲃三倍體不同誘導(dǎo)組仔魚孵化7 d的死亡率Fig.2 Fries mortality of the different triploid-induced groups at the post-hatching seven days in S.wumengshanensis

誘導(dǎo)組平均孵化時(shí)間為4 d 14 h～6 d 19 h，均少于對照組(7 d 2 h)，并且隨著持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間的增加，誘導(dǎo)組平均孵化時(shí)間呈遞減趨勢(表1)。因此，受精后5 min起始誘導(dǎo)，持續(xù)誘導(dǎo)25 min是烏蒙山金線鲃三倍體最佳的誘導(dǎo)條件。

表1 烏蒙山金線鲃三倍體誘導(dǎo)孵化時(shí)間Tab.1 Hatching time of the triploid-induced S.wumengshanensis

2.2 三倍體與二倍體仔稚魚的生長差異

3日齡烏蒙山金線鲃三倍體與二倍體的體長分別為(5.67±0.23) mm、(5.36±0.29) mm，無顯著差異，至180日齡三倍體的體長與體重分別為(74.00±1.58) mm、(4.46±0.30) g，分別是二倍體的1.09倍、1.27倍，并且體重顯著大于二倍體個(gè)體。3～60日齡三倍體與二倍體個(gè)體的體重、體長均無顯著性差異。

表3 烏蒙山金線鲃三倍體與二倍體的生長Tab.3 Growth of the triploids and diploids of S.wumengshanensis

3 討論

3.1 三倍體的誘導(dǎo)條件

烏蒙山金線鲃屬溫水性魚類，本研究采用冷休克溫度2～3 ℃誘導(dǎo)其三倍體，可獲得較高的三倍體率(100%)與較低的畸形率(26.54%)，而溫水性魚類鱖()和黃顙魚()冷休克誘導(dǎo)三倍體的最佳溫度分別為0～1 ℃與3～5 ℃，亦與本研究的結(jié)果相一致。有學(xué)者認(rèn)為不同魚類的遺傳背景及繁殖生物學(xué)不同，它們對溫度的敏感度也不同，暖水性或溫水性魚類誘導(dǎo)三倍體宜用冷休克法，休克溫度約0～5 ℃，冷水性魚類則宜用熱休克法，休克溫度為28～36 ℃，本研究也呈現(xiàn)相似的規(guī)律。

不同魚類受精卵第二極體排出時(shí)間各異，三倍體起始誘導(dǎo)時(shí)間也不同，一般而言暖水性與溫水性魚類較早，冷水性魚類則較晚。例如暖水性魚類斗魚()、奧里亞羅非魚()的起始誘導(dǎo)時(shí)間為受精后2～3min，誘導(dǎo)率分別為86%與100%；而溫水性性魚類如鯉()、團(tuán)頭魴()、烏鱧()等的誘導(dǎo)起始時(shí)間多為受精后3～5 min，可獲得60%～100%的誘導(dǎo)率；冷水性魚類虹鱒()、大西洋鮭()、細(xì)鱗鮭()、馬蘇大馬哈魚()等則需受精后10～25 min，可獲得90%以上的誘導(dǎo)率。由此可知，起始誘導(dǎo)時(shí)間是范圍值，即使同一種魚類受精卵發(fā)育速度也并非一致，較難確定第二極體排放的統(tǒng)一時(shí)間點(diǎn)。烏蒙山金線鲃為偏冷水性魚類，受精后5 min的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，高于受精后3 min與4 min的誘導(dǎo)率，這與溫水性魚類三倍體誘導(dǎo)規(guī)律相符。

持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間太短則無法完全抑制第二極體排放，降低誘導(dǎo)率。已有研究顯示熱休克法需時(shí)較短，多數(shù)為2～5 min，而冷休克法需時(shí)較長，多數(shù)為15～30 min，并且需時(shí)長短與魚類種類及其適溫范圍無關(guān)聯(lián)。本研究采用冷休克法誘導(dǎo)烏蒙山金線鲃三倍體，誘導(dǎo)時(shí)間為25 min與30 min時(shí)均可獲得100%的誘導(dǎo)率，這與已報(bào)道的冷休克法時(shí)間規(guī)律相一致。此外，烏蒙山金線鲃三倍體誘導(dǎo)10～30 min時(shí)三倍體率逐漸增加，表明一定范圍內(nèi)魚類三倍體誘導(dǎo)時(shí)間越長誘導(dǎo)率越高。

3.2 三倍體生長優(yōu)勢

三倍體魚類可以提高生長速度、養(yǎng)殖產(chǎn)量、肉質(zhì)等，然而并非所有三倍體魚類的生長都優(yōu)于二倍體，尤其在幼魚期或性成熟前三倍體個(gè)體常無生長優(yōu)勢。CAL等報(bào)道大菱鲆()三倍體個(gè)體性成熟前無生長優(yōu)勢，但初次性成熟后其生長速度顯著快于二倍體。本研究中3～60日齡烏蒙山金線鲃三倍體與二倍體的體長、體重均無顯著差異，而180日齡后三倍體體重顯著大于二倍體，但體長仍無顯著差異。本研究結(jié)果與鱖()三倍體生長相似，10～40日齡鱖三倍體生長速度與二倍體無顯著差異，而60～150日齡三倍體生長速度顯著快于二倍體。

綜上所述，本研究采用冷休克法誘導(dǎo)了烏蒙山金線鲃三倍體，最佳誘導(dǎo)條件為2～3 ℃，受精后5 min起始誘導(dǎo)，持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間25 min，可獲得最大受精率與孵化率，最小畸形率及100%誘導(dǎo)率；60日齡前三倍體與二倍體的生長無顯著性差異，而180日齡三倍體的體重顯著大于二倍體。