恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥代動力學研究

張國棟，劉永濤，艾曉輝，孫如玉，杜香璇

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141；4.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223)

異育銀鯽()是一種利用天然雌核發(fā)育的方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經(jīng)人工授精繁育子代的鯽養(yǎng)殖新對象，具有生長快、個體大、抗逆性強等特點，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中顯示出良好的經(jīng)濟性狀。斑點叉尾鮰()，屬鯰形目鮰科，是我國1984年從美國引進的一種具有食性雜、生長快、適應(yīng)性廣、抗病力強、肉質(zhì)上乘等優(yōu)點的淡水養(yǎng)殖魚類。隨著高密度養(yǎng)殖和集約化程度的加劇，水產(chǎn)動物的各類暴發(fā)性疾病相繼發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的危害，其中各種細菌性疾病尤為突出，而抗菌藥物被廣泛用于治療和預(yù)防這些細菌性疾病。

恩諾沙星是化學合成的第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用來治療細菌性疾病。目前，臨床中常用的恩諾沙星劑型主要有粉劑、注射劑、溶液劑和混懸劑等。由于水溶性低，使其粉劑和溶液劑在動物口服給藥中的應(yīng)用和療效受到了很大限制；而其注射劑在使用時需多次重復(fù)給藥，對動物應(yīng)激大，且注射給藥也增加了集約化養(yǎng)殖場的勞動量；混懸劑不利于群體給藥，增加了飼養(yǎng)管理成本等。本實驗室研制的恩諾沙星乳具有溶解度高、穩(wěn)定性好和抗菌活性強等特點，其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝規(guī)律是制定給藥方案的理論基礎(chǔ)。恩諾沙星在水產(chǎn)動物體內(nèi)藥代動力學的研究較多，但有關(guān)恩諾沙星乳藥代動力學的研究僅見羅非魚()。因此，本研究旨在探討恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)動力學與生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，并結(jié)合恩諾沙星藥效學規(guī)律為恩諾沙星乳的安全合理用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

恩諾沙星標準品(純度>99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氘代恩諾沙星(恩諾沙星-D)標準品(純度>99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；環(huán)丙沙星標準品(純度>95.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氘代環(huán)丙沙星(環(huán)丙沙星-D)標準品(純度>95.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；恩諾沙星粉(純度≥98.0%，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；乙腈、甲酸、水、正己烷、甲醇(色譜純，美國J.T.Baker公司)；鹽酸(優(yōu)級純，東大化工股份有限公司)；無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；肝素鈉(生物級，上海源葉生物科技有限公司)。恩諾沙星乳(5 mg/mL)是將0.5 g恩諾沙星粉溶解在5 mL的聚氧乙烯蓖麻油-40和1 mL的肉豆蔻酸異丙酯中，然后用蒸餾水稀釋至100 mL，混合均勻至清澈透明。

1.2 儀器設(shè)備

TSQ Quantum Access Max高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher scientific公司)；AE-240精密電子天平(美國METTLE-TOLEDO公司)；20PR-520自動高速冷凍離心機(日本Hitachi公司)；SK40-120DJ超聲儀(張家港市神科超聲電子有限公司)；HQ-60渦旋混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；KD200氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

異育銀鯽，平均體重為(127.56±14.25) g和斑點叉尾鮰，平均體重為(147.17±23.58) g均采購自湖北荊州某養(yǎng)殖場，在長江水產(chǎn)研究所窯灣試驗基地室內(nèi)暫養(yǎng)并進行試驗。將魚放置于已清洗并用高錳酸鉀消毒的玻璃水族箱(規(guī)格1 000 mm×578 mm×690 mm)中，試驗用水為充分曝氣的自來水，24 h不間斷充氣增氧，并用加熱棒調(diào)節(jié)水溫，控制水溫在(25±1) ℃，及時清除水體殘餌和排泄物，試驗期間魚成活率在99%以上。

1.4 給藥及樣品采集

異育銀鯽和斑點叉尾鮰單劑量口灌恩諾沙星乳(10 mg/kg bw)，并在給藥后的0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h自尾靜脈采血樣，每個時間點采樣6尾，從尾靜脈采集血液樣品，裝于用1%肝素鈉溶液潤洗的離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清液-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品前處理

在室溫下，將冷凍樣品自然解凍。準確量取血漿1 mL于10 mL離心管中，加入濃度為1 μg/mL的恩諾沙星-D和環(huán)丙沙星-D溶液各25 μL。然后在樣品中加入4 mL酸化乙腈(乙腈∶鹽酸∶水=2 500∶10∶10)，渦旋混合30 s，再加入0.5 g無水硫酸鎂，渦旋混合30 s，8 000 r/min離心5 min，將上層提取液吸至另一10 mL離心管中。重新加入4 mL酸化乙腈提取殘液，將提取液合并在一起。50 ℃氮氣吹干，用1 mL 20%甲醇水溶液復(fù)溶，加入1 mL正己烷旋渦混合30 s去脂，8 000 r/min離心5 min，取1 mL下層溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

1.6 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；流動相為0.1%甲酸水溶液∶乙腈=80∶20(V∶V)；流速為0.2 mL/min；進樣量10 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：加熱電噴霧電離子源(HESI)；離子化模式：正離子模式；掃描方式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)；噴霧電壓：3 500 V；蒸發(fā)器溫度：350 ℃；鞘氣(高純氮氣)壓力：40 kPa；輔助氣(高純氮氣)壓力：8 kPa；離子傳輸毛細管溫度：330 ℃；恩諾沙星、恩諾沙星-D、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星-D質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

表1 恩諾沙星、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星-D8質(zhì)譜條件Tab.1 Mass spectrometry parameters of enrofloxacin，enrofloxacin-D5，ciprofloxacin，and ciprofloxacin-D8

1.7 標準曲線的制備

標準儲備液的制備：分別準確稱取10 mg的恩諾沙星標準品、恩諾沙星-D標準品、環(huán)丙沙星標準品和環(huán)丙沙星-D標準品，以適量色譜純乙腈溶解并定容至100 mL，配制成濃度均為100 mg/L的標準儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標準曲線的制備：以標準儲備液為基礎(chǔ)，配制含恩諾沙星-D內(nèi)標和環(huán)丙沙星-D內(nèi)標均為25 μg/L，恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度均為1、5、10、50、250、500和1 000 μg/L的標準曲線，作HPLC-MS/MS分析，分別以測得的恩諾沙星與恩諾沙星-D和環(huán)丙沙星與環(huán)丙沙星-D峰面積的比值為縱坐標，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的濃度為橫坐標，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.8 回收率、精密度和檢出限

在異育銀鯽和斑點叉尾鮰空白血漿中分別添加4個濃度水平的標準溶液，使血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度分別為2、5、50和500 μg/L，恩諾沙星-D和環(huán)丙沙星-D的質(zhì)量濃度分別25 μg/L，每個濃度6個平行，并設(shè)1個空白對照，按樣品前處理過程處理后測定回收率。每個濃度的樣品，一天內(nèi)重復(fù)測5次，并一周內(nèi)重復(fù)測5次，計算日內(nèi)及日間精密度。根據(jù)6個空白樣品基線噪聲的平均值和S/N=3、S/N=10分別計算方法的檢出限和定量限。

1.9 數(shù)據(jù)處理

標準曲線采用Microsoft Excel 2019進行計算；恩諾沙星和環(huán)丙沙星的藥-時曲線采用Prism 8.0進行繪制；動力學參數(shù)采用WinNonlin 8.1軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法驗證

在1～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標準曲線方程分別為=0019+0040和=0021+0090，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3和0.999 5。血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測限為1.0 μg/L，定量限為2.0 μg/L。在本實驗條件下，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在血漿中的回收率在94.23%～117.47%。日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%，見表2。本方法可用于測定異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的濃度。

表2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的回收率和精密度(n=6)Tab.2 Recovery and precision for enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus(n=6)

2.2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥-時變化規(guī)律

恩諾沙星和環(huán)丙沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥-時曲線分別見圖1和圖2。給藥0.5 h后，恩諾沙星的血藥濃度分別為1.20 μg/mL和1.01 μg/mL。隨后藥物濃度逐漸上升，直至6 h和8 h血藥濃度達到峰值4.66 μg/mL和3.95 μg/mL。達峰之后藥物濃度逐漸下降，168 h后仍能檢測到，濃度分別為0.048 μg/mL和0.054 μg/mL。血漿中環(huán)丙沙星水平在給藥后呈快速上升，異育銀鯽和斑點叉尾鮰的血藥濃度都在12 h達到峰值53.17ng/mL和32.24 ng/mL。值得注意的是，環(huán)丙沙星在給藥后的48 h和96 h出現(xiàn)了一個小的上升，即雙峰現(xiàn)象。隨后又繼續(xù)迅速下降，168 h后仍能檢測到，濃度分別為8.06 ng/mL和2.87 ng/mL。

圖1 恩諾沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的藥-時曲線Fig.1 Concentration-time curve of enrofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus

圖2 環(huán)丙沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的藥-時曲線Fig.2 Concentration-time curve of ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus

2.3 恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥動學規(guī)律

采用WinNonlin軟件的非房室模型的統(tǒng)計矩原理分析異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥物動力學特征，藥代動力學參數(shù)見表3。恩諾沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的達峰濃度()分別為4.66 μg/mL和3.95 μg/mL；相應(yīng)的達峰時間()分別為6 h和8 h；分布容積()分別為1.27 L/kg和1.68 L/kg；消除半衰期(1/2)分別為20.05 h和22.06 h；藥時曲線下面積()分別為228.26 μg·h/mL和189.55 μg·h/mL；平均駐留時間()分別為42.87 h和43.48 h；消除速率()分別為0.035 h和0.031 h。其主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的分別為0.053 μg/mL和0.043 μg/mL；相應(yīng)的均為12 h；分別為125.95 L/kg和134.00 L/kg；1/2分別為45.79 h和31.66 h；分別為5.24 μg·h/mL和3.40 μg·h/mL；分別為78.17 h和63.66 h；分別為0.015 h和0.022 h。

表3 異育銀鯽和斑點叉尾鮰單次口灌10 mg/kg體重的恩諾沙星乳后血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的藥代動力學參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameter of enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of C.auratus gibelio and I.punctatus after oral administration(10 mg/kg bw)

3 討論

3.1 恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的動力學參數(shù)

水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學易受機體因素、藥理因素和環(huán)境因素的影響。因此，研究不同條件下的藥動學對藥物的合理使用有重要的指導(dǎo)作用。和是評價藥物在體內(nèi)吸收速率的重要參數(shù)。以10 mg/kg bw的單劑量對羅非魚口灌恩諾沙星乳后，恩諾沙星在體內(nèi)的為4.38 μg/mL，對應(yīng)的為2 h；而4倍給藥劑量造成的恩諾沙星粉在羅非魚體內(nèi)的僅為3.47 μg/mL，對應(yīng)的為1 h。說明恩諾沙星乳在羅非魚體內(nèi)吸收較好，不同可能是溫度和給藥劑量的影響。本試驗條件下，恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的分別為4.66 μg/mL和3.95 μg/mL，對應(yīng)的分別為6 h和8 h。恩諾沙星乳在異育銀鯽血漿中的大于恩諾沙星粉在鯽()血漿中的(3.24 μg/mL)，進一步說明恩諾沙星乳在水產(chǎn)動物體內(nèi)吸收較好。恩諾沙星乳在異育銀鯽血漿中的大于斑點叉尾鮰，且快于斑點叉尾鮰，說明恩諾沙星乳在異育銀鯽體內(nèi)吸收比斑點叉尾鮰好。是表示藥物吸收程度，決定生物利用度的重要參數(shù)。恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的分別為228.26 μg·h/mL和189.55 μg·h/mL，均高于羅非魚(157.21 μg·h/mL)、鯽(162.72 μg·h/mL)和鯉()(45.055 μg·h/mL)。進一步說明恩諾沙星乳在水產(chǎn)動物體內(nèi)吸收好，生物利用度高。是反映藥物在體內(nèi)分布的范圍大小和特性的重要參數(shù)。本試驗條件下，恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的分別為1.27 L/kg和1.68 L/kg，與在羅非魚血漿中的6.53 L/kg差別較大，這可能是因為種屬差異引起的。恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的均大于1.0 L/kg，說明恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)分布廣泛，且在斑點叉尾鮰體內(nèi)分布大于異育銀鯽。1/2和是反映藥物在體內(nèi)消除的主要參數(shù)。恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中的1/2分別為20.05 h和22.06 h，均小于恩諾沙星粉在鯽、羅非魚、大黃魚()體內(nèi)的62.17 h、212.8 h和30.484 h；分別為42.87 h和43.48 h，小于恩諾沙星粉在歐洲鰻鱺()和大西洋鮭()幼魚血漿中的161.1 h和151.7 h。這種差異可能是因為劑型和種屬差異引起的。同時說明了恩諾沙星乳在異育銀鯽體內(nèi)消除比斑點叉尾鮰快。

3.2 恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化

在許多動物物種中，恩諾沙星主要脫乙基化為環(huán)丙沙星。哺乳動物中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的比率為20%～55%。在水生動物中，恩諾沙星轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星的速度明顯低于哺乳動物，這是由于水生動物體內(nèi)溫度較低且易受外界環(huán)境的影響，從而影響了魚類的新陳代謝。羅非魚口灌給藥后血漿中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的比值為5.04%；大口黑鱸()給藥后血漿中的環(huán)丙沙星和恩諾沙星的比值為2.73%；鯽在分別肌肉注射和口灌給藥后，血漿中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的比值分別為2.17%和2.03%。本試驗條件下，異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)檢測到環(huán)丙沙星的分別為0.053 μg/mL和0.043 μg/mL，是恩諾沙星的1.14%和1.09%。異育銀鯽和斑點叉尾鮰血漿中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的比值分別為2.07%和1.74%，均小于鯽、羅非魚和大口黑鱸。說明恩諾沙星在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)代謝成環(huán)丙沙星的量很少，且異育銀鯽將恩諾沙星轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星的能力較斑點叉尾鮰稍強。

3.3 恩諾沙星乳的給藥方案

臨床水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥中的最低有效血藥濃度是指該藥物對常見致病菌的最小抑菌濃度(MIC)。馬寅等測得恩諾沙星對常見的致病弧菌的MIC為0.1～0.8 mg/L。喹諾酮類藥物通常被認為具有濃度依賴性的殺菌活性，/MIC>8和/MIC>125一般被認為是獲得臨床成功和避免細菌耐藥性的關(guān)鍵。SHAN等通過對異育銀鯽分別口灌和注射10 mg/kg bw單劑量的恩諾沙星溶液，發(fā)現(xiàn)其分別對MIC≤0.28 μg/mL和MIC≤0.40 μg/mL的病原菌有較好的治療效果。本實驗中，10 mg/kg bw單劑量的恩諾沙星乳適用于恩諾沙星對異育銀鯽和斑點叉尾鮰病原菌MIC分別小于0.58 μg/mL和0.49 μg/mL的病原菌。