克氏原螯蝦源普通變形桿菌分離、鑒定及聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

馬 亮，董 靖，張國(guó)棟，張露珊，劉紹春，艾曉輝

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.岳陽(yáng)漁美康生物科技有限公司，湖南岳陽(yáng) 414100)

克氏原螯蝦()俗稱小龍蝦，在我國(guó)大部分省份均有分布，其中在江蘇、安徽、湖北、湖南、江西等省份產(chǎn)量較大，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。2020年全國(guó)克氏原螯蝦總產(chǎn)量約為239.37萬(wàn)噸，總產(chǎn)值約3 448.46億元。近年來(lái)，克氏原螯蝦養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，病害日趨頻繁和嚴(yán)重，影響了克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了引起克氏原螯蝦疾病的病原有白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、弗氏檸檬酸桿菌()、維氏氣單胞菌()、副溶血弧菌()和螺旋體()等。

克氏原螯蝦養(yǎng)殖進(jìn)入5月份后，隨著水溫升高水體中病原菌的數(shù)量迅速上升，毒力和感染能力增強(qiáng)，極易引起克氏原螯蝦爆發(fā)疾病，俗稱為“五月瘟”?？耸显r爆發(fā)“五月瘟”，發(fā)病速度快且死亡率高，常規(guī)用藥治療效果不顯著。因此，探明克氏原螯蝦“五月瘟”的發(fā)病原因，選擇較為敏感的治療藥物，對(duì)降低患病蝦死亡率具有重要意義。

普通變形桿菌()是腸桿菌科的一種革蘭氏陰性菌，在自然界分布廣泛，水、土壤、腐敗的有機(jī)物以及人或動(dòng)物腸道內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，是一種人畜共患的條件致病菌，此外，該菌也是一種重要的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌，可感染斑點(diǎn)叉尾鮰()、加州鱸()、羅非魚(yú)(spp)、大口鯰(Chen)、中華鱉()、對(duì)蝦()等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，但該菌對(duì)克氏原螯蝦的致病性還未見(jiàn)報(bào)道。2019年湖北省潛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)“五月瘟”，本研究從患病克氏原螯蝦肝胰腺分離純化出一株致病菌，鑒定為普通變形桿菌，通過(guò)藥敏試驗(yàn)測(cè)定了該菌株對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的敏感性。此外，還研究了氟苯尼考與天然化合物聯(lián)用的協(xié)同抑菌作用，以期為普通變形桿菌引發(fā)的克氏原螯蝦細(xì)菌性感染提供治療方案和策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦病蝦來(lái)自潛江市某小龍蝦養(yǎng)殖基地，LB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物公司，藥敏紙片購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，PCR Master MIX購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離及純化

在無(wú)菌條件下，取患病克氏原螯蝦的肝胰腺用無(wú)菌玻璃勻漿器勻漿后，接種至LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取疑似菌落純化3次，純化后的菌落記為QJ201905007，在LB液體培養(yǎng)基中 37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h后，加入無(wú)菌甘油，放至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株鑒定

1.3.1 優(yōu)勢(shì)菌株的理化特性

將革蘭氏染色后的QJ201905007置于光學(xué)顯微鏡下，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒別和觀察。將新鮮菌液在無(wú)菌生理鹽水中重懸后接種于API20E生化鑒定試劑條中，將試劑條放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，在ATB32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中鑒定。

1.3.2 分離菌株的分子鑒定

按TaKaRa MiniBEST Bateria Genomic DNA Extraction Kit操作說(shuō)明提取分離株QJ201905007的基因組DNA，將提取的基因組和16S rRNA通用引物加入到PCR擴(kuò)增體系中，擴(kuò)增16S rRNA的基因片段。引物序列如下，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCA TGGCTC-3′，R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將有目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得到的基因序列提交至BLAST同源性比對(duì)軟件進(jìn)行分析，使用MEGA6軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)分析Bootstraps法檢測(cè)1 000次，分析QJ201905007菌株的分類(lèi)地位。

1.4 分離菌株對(duì)克氏原螯蝦的毒力試驗(yàn)

回歸感染試驗(yàn)在長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所漁藥臨床試驗(yàn)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所用克氏原螯蝦平均約25 g/只暫養(yǎng)于1 m×0.6 m×1 m的水族缸中，以充分曝氣后的井水作為水源，保持水溫(25±2) ℃，溶氧5 mg/L以上，水深4～6 cm，水族箱內(nèi)設(shè)置PVC管和水草等掩蔽物，試驗(yàn)前暫養(yǎng)5～7 d。用接種環(huán)挑取QJ201905007的單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，放置搖床37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。收集菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后重懸，然后用無(wú)菌生理鹽水依次稀釋至濃度為1.5×10、1.5×10、1.5×10、1.5×10和1.5×10CFU/mL。各試驗(yàn)組分別于克氏原螯蝦的關(guān)節(jié)軟膜處注射200 μL的菌液，對(duì)照組注射200 μL的無(wú)菌生理鹽水，30尾為一組。記錄每組死亡狀況，連續(xù)觀察8 d。采用Bliss法計(jì)算其半數(shù)致死濃度(LC)。同時(shí)從瀕死的克氏原螯蝦肝胰腺等組織中分離病原菌并進(jìn)行鑒定。

1.5 患病克氏原螯蝦病理學(xué)觀察

人工感染后，觀察患病的克氏原螯蝦的癥狀，并進(jìn)行剖檢觀察其肝胰腺和腸道內(nèi)變化。取其肝胰腺經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，進(jìn)行石蠟包埋、切片制作、HE染色、切片成像和組織病理學(xué)分析。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn)

通過(guò)K-B法研究QJ201905007菌株對(duì)選取的23種抗菌藥物的敏感性。用接種環(huán)挑取QJ201905007的單菌落，將其接種至LB液體培養(yǎng)基中，放至搖床(37 ℃，180 r/min)培養(yǎng)過(guò)夜，將新鮮菌液收集至離心管中離心后倒掉上清，用無(wú)菌PBS洗三次，再用無(wú)菌PBS將菌體重懸，用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕赫{(diào)至1.5×10CFU/mL，將100 μL菌液均勻涂抹在LB平板上，每個(gè)平板貼4張藥敏片，每種藥物重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后測(cè)定抑菌圈直徑。敏感性結(jié)果判定參照該公司藥敏片試劑盒說(shuō)明書(shū)上提供的判定標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)的研究表明，熊果酸、齊墩果酸具有多種生物活性[28～30]。熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌、美白、抗癌、抗糖尿病、抗?jié)兒徒档脱堑榷喾N功效。齊墩果酸具有消炎、抑菌、降轉(zhuǎn)氨酶、對(duì)四氯化碳引起的大鼠急性損傷有明顯的保護(hù)等作用；此外，齊墩果酸還有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、防止肝硬化、強(qiáng)心、利尿、升白、降血酯、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抑制變態(tài)反應(yīng)等作用。

1.7 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

篩選出天然化合物能夠降低化學(xué)抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，可延長(zhǎng)現(xiàn)有化學(xué)藥物使用壽命。氟苯尼考是受試藥物中敏感性較差且較為常見(jiàn)的國(guó)標(biāo)獸藥。依據(jù)肉湯微量稀釋法測(cè)定了氟苯尼考以及天然化合物白藜蘆醇、二氫辣椒堿、香葉木素、山奈酚、麝香草酚、虎杖苷、木犀草苷和桑色素單獨(dú)使用時(shí)對(duì)QJ201905007菌株的MIC。

采用棋盤(pán)法研究氟苯尼考和另外8種不同天然化合物聯(lián)合后對(duì)QJ201905007分離株的聯(lián)合抑菌作用。向96孔板中注入100 μL LB液體培養(yǎng)基后，再加入氟苯尼考和天然化合物，使氟苯尼考濃度從第2孔到第10孔(從左到右)依次降低，天然化合物從B到H孔(從上到下)依次降低。將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，離心收集菌體，無(wú)菌PBS洗三次，再用無(wú)菌PBS將菌體重懸，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度至5×10CFU/mL，再每孔100 μL加到96孔板中，混勻后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，分別設(shè)置陰性對(duì)照(只含培養(yǎng)基)和陽(yáng)性對(duì)照(菌液和培養(yǎng)基)。聯(lián)合抑菌作用采用抑菌濃度指數(shù)FICI評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下：FICI=MIC/MIC+MIC/MIC，F(xiàn)ICI≤0.5為協(xié)同作用(SYN)；0.54為拮抗作用(ANT)。

2 結(jié)果

2.1 QJ201905007菌株的培養(yǎng)與形態(tài)特性

發(fā)病蝦采食量下降、活動(dòng)力較差，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)其肝胰腺壞死，有積水，腸道中食物殘?jiān)^少、出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象。通過(guò)解剖患病的克氏原螯蝦，在其肝胰腺中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為QJ201905007。該優(yōu)勢(shì)菌在LB平板上呈乳白色菌落，表面光滑濕潤(rùn)。

2.2 QJ201905007菌株的生化特征

該優(yōu)勢(shì)菌經(jīng)革蘭氏染色后為短桿狀的革蘭氏陰性菌，菌株QJ201905007的生化鑒定結(jié)果如表1所示。將結(jié)果輸入至ATB鑒定系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)QJ201905007的生化特征符合普通變形桿菌的特征。

表1 QJ201905007生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical characterization of the QJ201905007

2.3 QJ201905007菌株分子鑒定結(jié)果

通過(guò)BLSAT軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，菌株QJ201905007分子鑒定的序列(OK217109)與GenBank中已報(bào)道的普通變形桿菌序列相似度為99%，通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1所示，可發(fā)現(xiàn)分離菌株QJ201905007與普通變形桿菌聚為一支。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判定QJ201905007為普通變形桿菌。

圖1 QJ201905007菌株16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of QJ201905007 based on 16S rRNA gene sequence

2.4 QJ201905007菌株回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

不同劑量的QJ201905007菌株感染健康的克氏原螯蝦，連續(xù)觀察8 d。結(jié)果如表2所示，各劑量組感染后，克氏原螯蝦出現(xiàn)了不同程度死亡現(xiàn)象，隨著濃度下降，死亡率也隨之下降。1.5×10CFU/mL高濃度感染組，在4 d后的死亡率為100%。死亡后的克氏原螯蝦經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)其肝胰腺有積水且有部分壞死，細(xì)菌分離再次發(fā)現(xiàn)了與原菌株形態(tài)相同的菌落，經(jīng)測(cè)序和比對(duì)發(fā)現(xiàn)分離到的細(xì)菌16s rRNA序列與QJ201905007序列同源性為100%。通過(guò)Bliss法計(jì)算，可得出菌株QJ201905007對(duì)克氏原螯蝦的LC為5.04×10CFU/mL。

表2 QJ201905007菌株感染健康克氏原螯蝦的死亡情況Tab.2 Deaths of healthy P.clarkia infected with QJ201905007

2.5 QJ201905007菌株感染克氏原螯蝦的病理學(xué)觀察

圖2 克氏原螯蝦主要組織病理變化Fig.2 Pathological changes of P.clarkii infected with QJ201905007a為正常蝦的解剖圖；b為病蝦的腸道解剖圖；c為病蝦的鰓部解刨圖；d-f為病蝦的肝胰腺病理切片

2.6 QJ201905007菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，QJ201905007菌株對(duì)亞胺培南、頭孢噻肟、恩諾沙星和頭孢吡肟4種藥物敏感；對(duì)新霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素等5種藥物中度敏感；對(duì)氟苯尼考、鏈霉素和丁胺卡那等14種藥物耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of the drug sensitivity test

2.7 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，氟苯尼考對(duì)QJ201905007菌株的MIC為64 μg/mL。受試的8種天然化合物中，白藜蘆醇和二氫辣椒堿對(duì)QJ201905007有一定的抑制作用，MIC分別為32和64 μg/mL。當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)，僅有白藜蘆醇與氟苯尼考具有協(xié)同作用，并且白藜蘆醇與氟苯尼考MIC均下降了87.5%，其FICI為0.25。

表4 氟苯尼考與天然化合物(單獨(dú)或聯(lián)合)對(duì)QJ201905007分離株的最小抑菌濃度Tab.4 The MICs of florfenicol and natural compounds(alone or combination) against QJ201905007 isolate

3 討論

普通變形桿菌是一種條件致病菌，廣泛存在于土壤和污水等自然環(huán)境中，以及人和動(dòng)物的腸道中，可引起人類(lèi)疾病的報(bào)道較多，主要有食物中毒、創(chuàng)傷性感染，顱骨骨髓炎和尿道感染等，對(duì)人類(lèi)健康危害較大。其致病機(jī)理是通過(guò)菌毛黏附到宿主細(xì)胞上，并快速滋生鞭毛及形成生物膜，在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多種毒力因子，從而引起宿主發(fā)病。

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，普通變形桿菌引發(fā)細(xì)菌性疾病的報(bào)道逐漸增多。楊移斌等的研究中發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰感染普通變形桿菌后，魚(yú)體表輕微潰爛，肛門(mén)有淡黃色液體流出，脾腎輕微充血，腸道嚴(yán)重糜爛壞死等癥狀。普通變形桿菌感染可引起加州鱸肝臟充血、腸道潰爛。羅氏沼蝦()感染普通變形桿菌后，病蝦軀體與附肢變紅，鰓部變黃且出現(xiàn)大水泡，眼睛凹陷或脫落。本試驗(yàn)中克氏原螯蝦感染普通變形桿菌后，其主要癥狀表現(xiàn)在肝胰腺和腸道等器官。此外，普通變形桿菌是一種人-獸-魚(yú)共患病原菌，盡管目前尚無(wú)普通變形桿菌通過(guò)水產(chǎn)品感染人類(lèi)的報(bào)道，但隨著水產(chǎn)動(dòng)物普通變形桿菌感染報(bào)道的增多和人類(lèi)消費(fèi)水產(chǎn)品的增多，水產(chǎn)品中存在的普通變形桿菌可能在流通和加工等過(guò)程感染人類(lèi)。因此，加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物普通變形桿菌的控制不僅可降低該菌感染導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，還可提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全，減少對(duì)人類(lèi)健康的威脅。

目前對(duì)于防控普通變形桿菌引起的細(xì)菌性疾病，主要還是以抗生素為主。羅珊等研究表明，臨床分離的人源68株普通變形桿菌對(duì)頭孢唑林、復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥率高。路振香等從牛和豬體內(nèi)分離出兩株普通變形桿菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)藥物高度耐藥。以上研究表明，臨床分離的普通變形桿菌對(duì)某些藥物具有一定的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)菌株QJ201905007對(duì)多種抗菌藥物耐藥，與以往的報(bào)道具有相似性；但其敏感性又有一定差異，可能與用藥習(xí)慣有關(guān)，因此在用藥過(guò)程中建議及時(shí)開(kāi)展藥敏試驗(yàn)，選擇較為敏感的藥物進(jìn)行治療，嚴(yán)格按照劑量和療程使用藥物。

“五月瘟”是克氏原螯蝦在5月份爆發(fā)性疾病的一個(gè)俗稱，其發(fā)病原因可能與多個(gè)因素相關(guān)，如病原菌、病毒、水質(zhì)等，但目前沒(méi)有統(tǒng)一的定論。陳昌福等認(rèn)為，可能是致病性病毒和細(xì)菌共同感染的感染結(jié)果。蘭江風(fēng)等對(duì)湖北省5個(gè)主養(yǎng)區(qū)克氏原螯蝦WSSV的感染率進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)外表無(wú)明顯病變克氏原螯蝦進(jìn)行采集，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%以上克氏原螯蝦都攜帶有WSSV，提出克氏原螯蝦是WSSV的重要攜帶者。本課題組前期通過(guò)ELISA法對(duì)采集的發(fā)病小龍蝦樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，未在發(fā)病蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)WSSV存在。已有研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌等均能導(dǎo)致克氏原螯蝦發(fā)病，并引起嚴(yán)重的死亡，提示病原菌可能為“五月瘟”的發(fā)病因素之一。本試驗(yàn)中普通變形桿菌感染克氏原螯蝦發(fā)生于5月份，是“五月瘟”的暴發(fā)季節(jié)，而且感染該病原的蝦發(fā)病嚴(yán)重，死亡率極高。因此，推斷該菌是克氏原螯蝦“五月瘟”的病原菌之一。

本試驗(yàn)所分離的普通變形桿菌QJ201905007對(duì)23種抗生素敏感特性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株QJ201905007對(duì)亞胺培南、頭孢噻肟、恩諾沙星和頭孢吡肟4種抗生素高度敏感，對(duì)氟苯尼考、多粘菌素B、阿莫西林等14種抗生素耐藥。對(duì)恩諾沙星高度敏感，這與黃杰等研究一致；對(duì)氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素耐藥，與柯文杰等研究相反。根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8種天然化合物，僅有白藜蘆醇與氟苯尼考有協(xié)同抑菌作用。小龍蝦養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)遵循“預(yù)防為主，治療為輔”的疾病防控策略，日常調(diào)控好水質(zhì)，減少應(yīng)激，一旦發(fā)生細(xì)菌感染應(yīng)首先消毒并輔以微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)，若以上措施無(wú)效再選擇適當(dāng)?shù)目咕幬镏委?。但小龍蝦的養(yǎng)殖周期較短，在選擇藥物時(shí)要慎重，除了考察藥物敏感性以外還應(yīng)注意其休藥期，用藥后的小龍蝦在休藥期結(jié)束后再捕撈上市。本試驗(yàn)中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果可為防治克氏原螯蝦普通變形桿菌病提供理論依據(jù)。