姜黃素通過AMPK/FUNDC1緩解LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

楊 帆 武菲菲 蘇 潔 蔣書云 謝文靜 金 屏

膿毒癥(sepsis)導(dǎo)致的循環(huán)和細(xì)胞/代謝功能障礙及隨之引發(fā)的心功能不全，目前仍無有效治療策略[1,2]。膿毒癥引起的病理性損傷主要包括氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡及線粒體功能異常等[3]。FUNDC1(FUN14domain containing 1)作為受損線粒體清除的核心調(diào)節(jié)受體之一，對心肌損傷具有重要的保護(hù)作用[4]。AMPK/FUNDC1信號通路的激活可通過改善線粒體功能障礙，進(jìn)而緩解高血糖癥導(dǎo)致的心肌損傷，且FUNDC1對于LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠心肌組織具有顯著的保護(hù)作用[5]。然而，AMPK/FUNDC1信號通路在膿毒癥導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷的病理進(jìn)程中的作用機(jī)制尚未闡明。

姜黃素是姜黃根莖的重要生物活性成分，對心肌梗死等心血管疾病具有顯著的保護(hù)作用[6]。Zhang等研究證實(shí)，姜黃素可通過激活A(yù)MPK并保護(hù)線粒體功能，進(jìn)而緩解高糖引起的心功能損傷[7]。此外，姜黃素對膿毒癥誘導(dǎo)的心功能不全具有明確的保護(hù)作用[8]。然而，這種保護(hù)作用是否通過保護(hù)線粒體功能及是否通過AMPK/FUNDC1信號通路，尚未明確。

本研究擬建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷模型，探究姜黃素對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用，及在膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的重要作用，并進(jìn)一步明確AMPK/FUNDC1信號通路在這種調(diào)節(jié)作用中的關(guān)鍵機(jī)制。

對象與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物：所有涉及動物實(shí)驗(yàn)部分均遵循美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物使用指南，按照3R原則，并由中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)福利與倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20200447)。

2.試劑：姜黃素、線粒體自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)及線粒體自噬激動劑SB-203580購自美國Med Chem Express公司；LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；JC-1檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA檢測試劑盒購自美國Cloud-Clone公司；一抗購自美國Cell Signaling公司及英國Abcam公司；二抗購自北京中山金橋公司；DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：1～3天齡的C57BL/6J乳鼠原代細(xì)胞以Pierce原代心肌細(xì)胞分離試劑盒分離(美國Thermo Fisher Scientific公司)，并轉(zhuǎn)移至高糖DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基中[9]。之后，混合細(xì)胞懸液并收集非貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)與10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中，孵育培養(yǎng)備用。

4.LPS細(xì)胞損傷模型建立及分組：①對照(Con)組：NMCMS以高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；②curcumin處理(Cur)組：NMCMS以10nmol/L的Cur處理10h[10]；③LPS組：NMCMS以100ng/ml的LPS處理12h[11]；④Cur保護(hù)(LPS-Cur)組：NMCMS以100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑤LPS-scramble siAMPK(LPS-Scr)組：NMCMS用AMPK scramble siRNA處理36h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h；⑥LPS-scramble siAMPK-Cur(LPS-Cur-Scr)組：NMCMS用AMPK scramble siRNA處理36h，再加入100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑦LPS-siAMPK-Cur(LPS-siAMPK-Cur)組：NMCMS用AMPK siRNA處理36h，再加入100ng/ml的LPS處理2h，隨后加入10nmol/L的Cur共同處理10h；⑧LPS-siAMPK組：NMCMS用AMPK siRNA處理36h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h；⑨LPS-Cur-3-MA處理(LPS-Cur-3-MA)組：NMCMS以10nmol/L 3-MA處理60h，隨后加入100ng/ml的LPS處理2h，再加入10mmol/L的Cur共同處理10h；LPS-rapamycin組：NMCMS以100nmol/L 3-MA處理60h，隨后加入100ng/ml的LPS共同處理12h[12]。

5.細(xì)胞活力檢測：將分離培養(yǎng)的NMCMS以5×103個/孔接種于96孔板中，以前述方法分別對細(xì)胞進(jìn)行處理后，避光條件下向每孔中加入10μl CCK-8溶液，并于37℃水浴中孵育90min，結(jié)束后在450nm波長以分光光度計(jì)測量各孔吸光度(A)值。細(xì)胞活力=(處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。

6.線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)：將細(xì)胞以不同方式處理后，以陽離子熒光染料JC-1對線粒體膜電位進(jìn)行檢測。按照操作說明將JC-1工作液加入細(xì)胞中并在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育30min，隨后以PBS清洗3次，每次5min。結(jié)束后采用日本Olympus熒光顯微鏡對各組細(xì)胞進(jìn)行觀察。數(shù)據(jù)以藥物處理組與對照組各自的熒光強(qiáng)度表示。

7.NMCMS細(xì)胞線粒體分離：NMCMS線粒體按照操作說明，以線粒體分離試劑盒(英國Abcam公司)分離。以預(yù)冷的PBS緩沖液清洗NMCMS，并以1000×g離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中。以12000×g再次離心20min，收集上清液。隨后以添加蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液中清洗，最終以12000×g離心20min收集備用。

8.Western blot法檢測：以上述方式處理NMCMS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗以去除培養(yǎng)基殘留，使用預(yù)冷的中效RIPA裂解緩沖液(美國Santa Cruz公司)處理細(xì)胞。于冰上反應(yīng)15min，隨后12000×g離心25min，隨后加入5×loading buffer，并煮沸7min，進(jìn)行蛋白定量。將提取的細(xì)胞蛋白以SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5g/100ml脫脂牛奶在25℃孵育1.5h，加入相應(yīng)一抗在4℃孵育過夜，清洗后再加入對應(yīng)二抗緩慢搖晃，反應(yīng)2h，再次清洗后采用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測，之后使用Image Lab(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行蛋白定量分析。

9.ATP含量：使用ATP檢測試劑盒，對分離得到的NMCMS細(xì)胞線粒體進(jìn)行定量分析(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP檢測裂解液稀釋成不同濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并按照每個樣品100μl配置適當(dāng)?shù)腁TP檢測工作液，隨后采用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

結(jié) 果

1.細(xì)胞模型評價：如圖1A所示，與Con組比較，NMCMS中加入100ng/ml的LPS處理12h可顯著降低心肌細(xì)胞活力至50%左右。與Con組比較，以LPS處理NMCMS 12h后可顯著增加LDH活力并降低MMP的含量(圖1中B、C)。同時，ROS生成也顯著增加，且線粒體ATP含量顯著降低(圖1中D、E)。此外，對蛋白的Western blot法檢測結(jié)果顯示，p-AMPK及線粒體自噬標(biāo)志蛋白FUNDC1的表達(dá)也顯著降低(圖1中F、G)。

圖1 LPS處理組與對照組細(xì)胞活力、損傷標(biāo)志物及ROS生成等的檢測結(jié)果(n=6)A.細(xì)胞活力；B.LDH活力；C.MMP；D.ROS水平；E.ATP含量;F、G.Western blot法檢測

2.Cur對NMCMS線粒體膜電位影響：如圖2中A、B所示，相對于Con組，LPS處理可顯著增加ROS活力并降低線粒體ATP含量，而這一改變可被Cur顯著逆轉(zhuǎn)。此外，定量分析顯示，相對于Con組，LPS可顯著降低JC-1比值，提示Δψm顯著降低并線粒體損傷，而Cur可通過顯著增加JC-1比值，從而改善線粒體損傷(圖2中C、D)。

圖2 Cur處理對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS生成、ATP含量及線粒體膜電位的影響(n=6)A.ROS水平；B. ATP含量；C、D.JC-1熒光染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果與Con組比較, *P<0.05；與LPS組比較, #P<0.05

3.Cur可緩解LPS誘導(dǎo)的NMCMS毒性：如圖3A所示，相對于LPS處理組，培養(yǎng)的NMCMS中加入10nmol/L的Cur后可顯著增加細(xì)胞活力，然而隨著Cur濃度進(jìn)一步增加，細(xì)胞活力無顯著改善。對培養(yǎng)細(xì)胞離心后的上清液檢測發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，LPS處理可顯著增加LDH活力并顯著降低MMP含量，而Cur處理可顯著減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(圖3中B、C)。對不同處理組的細(xì)胞蛋白的進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，Cur處理可顯著緩解LPS對p-AMPK及線粒體自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的抑制作用(圖3中D、E)。

圖3 Cur處理對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、LDH、MMP及AMPK與FUNDC1蛋白表達(dá)的影響(n=6)A.細(xì)胞活力；B.LDH活力；C.MMP；D.p-AMPK及AMPK蛋白表達(dá)；E.FUNDC1蛋白表達(dá)與Con組比較, *P<0.05；與LPS組比較, #P<0.05

4.siAMPK對Cur及LPS處理的NMCMS線粒體的影響：對Cur及LPS處理的NMCMS中加入siAMPK的結(jié)果顯示，Cur可顯著降低LPS損傷引起的ROS水平增加及促進(jìn)ATP生成，而siAMPK處理則降低了Cur對細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(圖4中A、B)。此外，以JC-1陽離子探針檢測Cur及siAMPK對LPS誘導(dǎo)的NMCMS毒性的影響，定量分析結(jié)果顯示，加入scramble RNA后線粒體膜電位無顯著改變。相對于LPS-Cur-Scr組，加入siAMPK后則顯著降低JC-1比值，提示線粒體損傷加劇(圖4中C、D)。

圖4 Cur與siAMPK處理對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(n=6)A.ROS水平；B.ATP含量；C.JC-1熒光染色；D.線粒體膜電位熒光染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果與LPS-Scr組比較, *P<0.05；與LPS-Cur-Scr組比較, #P<0.05；與LPS-siAMPK-Cur組比較, ΔP<0.05

5.抑制AMPK的表達(dá)可降低Cur對LPS誘導(dǎo)的NMCMS的保護(hù)作用：如圖5中A、B所示，對于LPS處理的NMCMS，與LPS-Scr組比較，Cur可顯著降低LDH活性并增加MMP含量，而siAMPK可通過逆轉(zhuǎn)這一趨勢增加LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。與LPS組比較，Cur可顯著增加p-AMPK及FUNDC1蛋白的表達(dá)，而siAMPK處理后，隨著p-AMPK表達(dá)量的降低，F(xiàn)UNDC1蛋白表達(dá)量也顯著降低(圖5中C、D)。提示FUNDC1可能作為重要的調(diào)節(jié)因子，參與Cur對LPS誘導(dǎo)的NMCMS的保護(hù)作用。

圖5 Cur與siAMPK處理對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH、MMP及AMPK與FUNDC1蛋白表達(dá)的影響(n=6)A.LDH活力；B.MMP；C.p-AMPK及AMPK蛋白表達(dá)；D.FUNDC1蛋白表達(dá)與LPS-Scr組比較, *P<0.05；與LPS-Cur-Scr組比較, #P<0.05；與LPS-siAMPK-Cur組比較, ΔP<0.05

6.AMPK/FUNDC1信號通路對Cur抵抗LPS誘導(dǎo)的NMCMS損傷具有重要的調(diào)節(jié)作用：如圖6中A、B所示，對于LPS處理的NMCMS，加入Cur或線粒體自噬激活劑rapamycin均可顯著降低LDH活性并增加MMP含量，而加入線粒體自噬抑制劑3-MA后，這種保護(hù)作用被部分抵消。此外，Cur或rapamycin均可顯著降低LPS誘導(dǎo)的NMCMS的ROS生成并促進(jìn)ATP合成，而3-MA則可顯著增加ROS生成及抑制ATP合成(圖6中C、D)。對不同處理組NMCMS蛋白的進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，Cur及rapamycin可顯著改善LPS誘導(dǎo)的NMCMS線粒體自噬標(biāo)志蛋白降解，而3-MA處理則通過降低FUNDC1蛋白表達(dá)而部分抵消Cur對細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，而并未改變p-AMPK的蛋白表達(dá)(圖6中E、F)。提示，F(xiàn)UNDC1可能作為AMPK下游分子，參與調(diào)控Cur對LPS誘導(dǎo)的NMCMS的保護(hù)作用。

圖6 Cur、3-MA及rapamycin處理對心肌細(xì)胞的影響(n=6)A.LDH活力；B.MMP；C.ROS水平；D.ATP含量；E.p-AMPK及AMPK蛋白表達(dá)；F.FUNDC1蛋白表達(dá)與LPS組比較, *P<0.05； 與LPS-Cur組比較, #P<0.05

討 論

本研究通過離體建立LPS誘導(dǎo)的NMCMS損傷模型并發(fā)現(xiàn)，Cur可通過激活抑制LDH活力及ROS生成并增加MMP與ATP的含量，減輕線粒體損傷，保護(hù)NMCMS抵抗LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性。其作用機(jī)制主要是通過激活A(yù)MPK/FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬并降低ROS生成及維持線粒體膜電位實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果提示，Cur及AMPK/FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬對于保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體功能，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有重要作用。

膿毒癥期間的心血管系統(tǒng)及其功能障礙不容忽視[13]。研究表明，線粒體功能障礙，在膿毒癥誘導(dǎo)的器官衰竭的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[14]。LPS可以誘導(dǎo)選擇性的線粒體自噬過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與Con組比較，LPS處理的NMCMS細(xì)胞活力顯著降低，同時細(xì)胞損傷增加(LDH活性增加與MMP含量降低)與ROS水平升高及線粒體ATP生成降低。研究表明，F(xiàn)UNDC1依賴的線粒體自噬在通過緩解炎性反應(yīng)，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[5,15]。本研究證實(shí)，LPS處理的NMCMS與對照組比較，p-AMPK及線粒體自噬標(biāo)志蛋白FUNDC1顯著激活，與既往研究結(jié)果一致[5]。

Cur是從姜黃根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)。姜黃素具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎等功效[16,17]。研究表明，Cur對心肌缺血再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用，其主要作用機(jī)制是通過抑制ROS生成并促進(jìn)ATP合成，從而減輕線粒體功能損傷，進(jìn)而緩解缺血再灌注引起的心肌損傷[18]。此外，姜黃素通過調(diào)控自噬和減輕細(xì)胞凋亡來預(yù)防心肌損傷[19]。本研究證實(shí)，相對于LPS誘導(dǎo)的NMCMS，Cur可顯著降低ROS生成并促進(jìn)ATP合成，并促進(jìn)AMPK的磷酸化與線粒體自噬標(biāo)志蛋白FUNDC1的表達(dá)，同時通過增加JC-1的比值維持線粒體膜電位穩(wěn)定，緩解LPS誘導(dǎo)的NMCMS損傷。

既往研究表明，AMPK/FUNDC1信號通路的激活可緩解高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞線粒體功能障礙，且FUNDC1在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠心肌組織中也具有調(diào)節(jié)作用[5,20]。本研究通過對NMCMS給予siAMPK證實(shí)，Cur對LPS誘導(dǎo)的NMCMS損傷的保護(hù)作用可被AMPK的抑制而抵消，提示AMPK/FUNDC1信號通路可能是Cur抵抗LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子。進(jìn)一步的體外研究表明，NMCMS以線粒體自噬抑制劑3-MA處理后，Cur對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用被部分抵消，而AMPK的磷酸化未見顯著改變，提示FUNDC1可能作為AMPK的下游關(guān)鍵分子，參與調(diào)控Cur對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)，Cur可顯著緩解LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。其潛在的保護(hù)機(jī)制是通過激活A(yù)MPK/FUNDC1信號通路，抑制ROS生成與促進(jìn)ATP合成，減輕心肌細(xì)胞線粒體損傷。而抑制AMPK的磷酸化或降低FUNDC1的蛋白表達(dá)，可加劇LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。因此，激活A(yù)MPK/FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬是Cur緩解LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性的潛在治療策略。