唾液乳桿菌對(duì)雞毒支原體感染肉雞生長(zhǎng)性能及肺損傷的影響

王 劍，陳雪蘋(píng)，李繼昌

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，晉中 030801； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

雞毒支原體(，MG)是養(yǎng)雞場(chǎng)中最為常見(jiàn)的呼吸道病原體之一。雞單純感染MG后死亡率較低，但會(huì)顯著降低雞的生產(chǎn)性能，例如肉雞增重減緩、蛋雞產(chǎn)蛋率下降及雛雞弱雛率增高，這會(huì)給養(yǎng)殖戶造成比較大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，MG感染還會(huì)造成免疫抑制，這會(huì)給其他病原體(例如流感病毒、大腸桿菌等)以可乘之機(jī)，一旦發(fā)生混合感染或者繼發(fā)感染，雞群死亡率會(huì)顯著提高，進(jìn)一步加大養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。從成本方面考慮，目前，養(yǎng)殖戶主要是使用四環(huán)素類(lèi)或大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素預(yù)防和控制MG感染，但隨著抗生素耐藥問(wèn)題的日益嚴(yán)重，使得家禽生產(chǎn)過(guò)程中抗生素的使用受到限制。因此，有必要開(kāi)發(fā)抗生素替代的預(yù)防和控制MG感染方法以滿足生產(chǎn)需要。本課題組前期從健康雞腸道內(nèi)分離鑒定了1株唾液乳桿菌()，并證實(shí)這株唾液乳桿菌具有促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)、抗應(yīng)激、提高抗病力及改善共生菌群組成等多種益生性能。但是該株唾液乳桿菌是否可以緩解MG感染所致肉雞生長(zhǎng)性能下降及肺損傷還未可知，因此，本研究在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量該株唾液乳桿菌，通過(guò)分析各組雞的體重、飼料轉(zhuǎn)化率、肺部MG定植量、肺部病理?yè)p傷、肺部炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)量及促炎性細(xì)胞因子含量來(lái)評(píng)價(jià)唾液乳桿菌緩解MG感染所致肉雞生產(chǎn)性能下降及肺損傷效果，以期為肉雞預(yù)防MG感染提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

240只1日齡健康A(chǔ)A肉雞購(gòu)自哈爾濱光大養(yǎng)雞場(chǎng)(經(jīng)MG血清學(xué)檢測(cè)為陰性)，飼養(yǎng)于經(jīng)甲醛熏蒸消毒的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由采食和飲水。全部AA肉雞使用2層的層疊式雞籠進(jìn)行籠養(yǎng)(100 cm×80 cm×50 cm)，每籠10只雞。動(dòng)物房?jī)?nèi)第1周溫度設(shè)置為32 ℃±2 ℃，然后逐漸降至25 ℃±2 ℃。

1.2 MG及唾液乳桿菌培養(yǎng)

MG株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶研究員饋贈(zèng)，將MG株凍干粉置于支原體完全培養(yǎng)基，復(fù)蘇1次后，將MG培養(yǎng)至1×10CCU·mL；唾液乳桿菌由本課題組分離鑒定并保存(GenBank登錄號(hào)：MT378407)，將唾液乳桿菌凍干粉置于MRS培養(yǎng)基，復(fù)蘇1次后，將唾液乳桿菌按照10CFU·kg、10CFU·kg添加至基礎(chǔ)飼料中。支原體完全培養(yǎng)基組分為支原體無(wú)血清培養(yǎng)基80 mL(上海源培生物科技股份有限公司)，無(wú)菌胎牛血清20 mL(美國(guó)Gibco公司)，尼克酰胺二嘌呤核苷酸100 μL(北京索萊寶生物科技有限公司)，青霉素溶液100 μL(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。MRS培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將體重相近、健康狀態(tài)良好的240只1日齡AA肉雞隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，包括對(duì)照組(Con)、低劑量唾液乳桿菌組(L)、高劑量唾液乳桿菌組(H)、MG感染組(MG)、MG感染+低劑量唾液乳桿菌組(MG+L)和MG感染+高劑量唾液乳桿菌組(MG+H)。Con組、MG組飼喂基礎(chǔ)飼料，L組、MG+L組飼喂添加10CFU· kg唾液乳桿菌的基礎(chǔ)飼料，H組、MG+H組飼喂添加10CFU·kg唾液乳桿菌的基礎(chǔ)飼料，7日齡時(shí)給與MG組、MG+L組和MG+H組進(jìn)行氣囊注射2×10CCU MG，飼養(yǎng)42 d后記錄雞的體重、飼料消耗情況，脫頸處死后，收集肺組織，用于組織病理學(xué)檢測(cè)、炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)及促炎性因子含量檢測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能 在1日齡和42日齡時(shí)準(zhǔn)確記錄各只雞體重。飼養(yǎng)期間，準(zhǔn)確記錄飼料消耗情況，飼料轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式：飼料總消耗量/(42日齡體重-1日齡體重)。

1.4.2 肺部MG定植量檢測(cè) MG體外分離培養(yǎng)困難，不利于開(kāi)展定量研究。因此，本試驗(yàn)采用前期已經(jīng)建立的基于MG特異性基因2單拷貝質(zhì)粒qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行肺部MG定植量檢測(cè)。具體方法：首先嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組提取試劑盒[購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司]操作說(shuō)明提取MG基因組，通過(guò)引物(F:5′-TTGGGTTTAGGGATTGGGATT -3′;R:5′-CCAAGGGATTCAACCATCTT -3′)進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10×PCR buffer 5 μL，正反引物各1 μmol·L，DNA模板0.1 μg，DNA聚合酶0.25 μL，補(bǔ)加水至50 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，38個(gè)循環(huán)。將2單拷貝質(zhì)粒10倍梯度稀釋作為模板進(jìn)行上述PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，2基因拷貝數(shù)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量；DNA分子量=DNA堿基×324.5；DNA質(zhì)量濃度=260 nm吸收值×50 μg·mL×稀釋倍數(shù)×6.02×10。使用上述公式計(jì)算2基因拷貝數(shù)來(lái)判斷MG肺部定植情況。

1.4.3 肺部組織病理學(xué)檢測(cè) 脫頸處死雞后，迅速收集各組新鮮肺組織。生理鹽水沖洗肺組織，盡可能去除血污。將肺組織修剪成適宜大小的組織塊，室溫固定于10%中性福爾馬林溶液中。將固定好的肺組織經(jīng)流水沖洗過(guò)夜、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯透明、梯度酒精脫水、蒸餾水脫蠟水化后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，染色后的切片經(jīng)無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明后使用中性樹(shù)脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.4.4 肺部炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 通過(guò)Western blot法檢測(cè)肺組織炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)。準(zhǔn)確稱量20 mg肺組織置于EP管中，加入250 μL含1 mmol·LPMSF的RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)后充分勻漿，充分裂解后，12 000 r·min離心5 min后收集上清。提取的蛋白經(jīng)高溫變性后進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜后，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(武漢博士德生物工程有限公司)在高靈敏化學(xué)熒光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)下觀察圖像，并進(jìn)行分析。一抗(TLR2、p-p65、p65、β-actin)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，一抗(HMGB1、NLRP3、Caspase-1)購(gòu)自武漢艾博泰克生物科技有限公司，二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4.5 肺部促炎性細(xì)胞因子含量檢測(cè) ELISA法檢測(cè)肺組織中促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)含量。ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響

相較于Con組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(L組)和高劑量唾液乳桿菌(H組)均極顯著提高肉雞42日齡體重(圖1A，<0.01)、極顯著降低飼料轉(zhuǎn)化率(圖1B，<0.01)。相較于Con組，MG感染(MG組)極顯著降低肉雞42日齡體重(圖1A，<0.01)、極顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率(圖1B，<0.01)。相較于MG組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(MG+L組)和高劑量唾液乳桿菌(MG+H組)均極顯著緩解MG感染導(dǎo)致的肉雞體重下降(圖1A，<0.01)、極顯著降低飼料轉(zhuǎn)化率(圖1B，<0.01)。這些結(jié)果表明，唾液乳桿菌可以有效緩解MG感染造成的肉雞生長(zhǎng)性能下降。

Con. 對(duì)照組；L. 低劑量唾液乳桿菌組；H. 高劑量唾液乳桿菌組；MG. 雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)感染組；MG+L. MG感染+低劑量唾液乳桿菌組；MG+H. MG感染+高劑量唾液乳桿菌組。與Con組相比，**.P<0.01；與MG組相比，##.P<0.01。下同Con.The control group; L. The low dose Lactobacillus salivarius group; H. The high dose Lactobacillus salivarius group; MG. The MG infection group; MG+L. The MG infection+low dose Lactobacillus salivarius group; MG+H. The MG infection+high dose Lactobacillus salivarius group. Compared with the Con group, **.P<0.01; Compared with the MG group, ##.P<0.01. The same as below圖1 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞體重(A)及飼料轉(zhuǎn)化率(B)的影響(n=40)Fig.1 Effects of Lactobacillus salivarius on body weight (A) and feed conversion ratio (B) of broilers challenged with MG (n=40)

2.2 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部MG定植的影響

相較于Con組，MG感染(MG組)后肺部MG定植量極顯著升高(圖2，<0.01)。相較于MG組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(MG+L組)和高劑量唾液乳桿菌(MG+H組)均極顯著降低肺部MG定植量(圖2，<0.01)。這些結(jié)果表明，唾液乳桿菌可以有效促進(jìn)肺部MG清除。

圖2 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部MG定植影響(n=10)Fig.2 Effects of Lactobacillus salivarius on MG colonization in broilers lung challenged with MG (n=10)

2.3 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部病理變化的影響

相較于Con組，MG感染(MG組)后肺泡壁增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。相較于MG組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(MG + L組)和高劑量唾液乳桿菌(MG + H組)肺部病理?yè)p傷均明顯緩解(圖3)。這些結(jié)果表明唾液乳桿菌可以有效緩解MG感染所致肉雞肺部病理?yè)p傷。

黑色箭頭示肺泡壁增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Black arrows pointed alveolar wall thickening and inflammatory cell infiltration圖3 肺部組織病理學(xué)對(duì)比Fig.3 Histopathological comparison of lung tissues

2.4 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

相較于Con組，MG感染(MG組)極顯著促進(jìn)肺部促炎蛋白TLR2、HMGB1、p-p65/p65、NLRP3、Pro-Caspase-1/Caspase-1表達(dá)(圖4和圖5，<0.01)。相較于MG組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(MG+L組)和高劑量唾液乳桿菌(MG+H組)均極顯著降低促炎蛋白TLR2、HMGB1、p-p65/p65、NLRP3、Pro-Caspase-1/Caspase-1表達(dá)(圖4和圖5，<0.01)。這些結(jié)果表明唾液乳桿菌可以有效抑制MG感染所致肉雞肺部炎性損傷相關(guān)蛋白表達(dá)。

圖4 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部TLR2、HMGB1及p-p65/p65蛋白表達(dá)影響(n=3)Fig.4 Effects of Lactobacillus salivarius on the protein expression of TLR2, HMGB1 and p-p65/p65 in lungs of broilers challenged with MG (n=3)

圖5 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部NLRP3、Pro-Caspase-1及Caspase-1蛋白表達(dá)影響(n=3)Fig.5 Effects of Lactobacillus salivarius on the protein expression of NLRP3, Pro-Caspase-1 and Caspase-1 in lungs of broilers challenged with MG (n=3)

2.5 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部促炎性細(xì)胞因子含量的影響

相較于Con組，MG感染(MG組)極顯著提高肺部促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量(圖6，< 0.01)。相較于MG組，飼料中添加低劑量唾液乳桿菌(MG+L組)和高劑量唾液乳桿菌(MG+H組)均極顯著降低肺部促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量(圖6，<0.01)。這些結(jié)果表明，唾液乳桿菌可以有效抑制MG感染所致肉雞肺部促炎性細(xì)胞因子生成。

圖6 唾液乳桿菌對(duì)MG感染肉雞肺部促炎性細(xì)胞因子含量影響(n=6)Fig.6 Effects of Lactobacillus salivarius on the pro-inflammatory cytokines content in lungs of broilers challenged with MG (n=6)

3 討 論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)養(yǎng)雞場(chǎng)中MG感染陽(yáng)性率為20%～80%。各個(gè)日齡雞對(duì)MG均易感，且一旦感染會(huì)終身攜帶MG，難以清除。目前主要是使用四環(huán)素類(lèi)或大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素預(yù)防或治療MG感染，但隨著多重耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，有必要開(kāi)發(fā)抗生素替代且低成本的MG防控方法，這一方面有助于降低多重耐藥細(xì)菌出現(xiàn)的概率，另一方面也對(duì)豐富現(xiàn)有MG防控策略有著重要意義。乳桿菌是首個(gè)被批準(zhǔn)可以作為飼料添加劑的益生菌，具有生產(chǎn)成本低、可利用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期從健康雞腸道中分離鑒定了一株唾液乳桿菌，已證實(shí)每千克飼料中添加10CFU及10CFU該株唾液乳桿菌均能顯著促進(jìn)蛋雞體重增加、脛骨生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，每千克飼料中添加10CFU及10CFU該株唾液乳桿菌也顯著促進(jìn)了肉雞42日齡體重增加，這些結(jié)果表明這株唾液乳桿菌作為飼料添加劑具有良好的促生長(zhǎng)效果。乳桿菌本身可以分泌蛋白酶促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，這直接促進(jìn)了肉雞生長(zhǎng)性能的提高。此外，乳桿菌作為益生菌可以改善腸道菌群組成，降低腸道內(nèi)有害菌豐度，這大大降低了因激活免疫而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)消耗，間接改善了飼料轉(zhuǎn)化率。

MG定植于雞呼吸道并誘發(fā)呼吸道炎性損傷是其致病的主要原因。在本試驗(yàn)中，唾液乳桿菌顯著降低了雞肺部MG定植、顯著緩解了MG感染導(dǎo)致的肺部炎性損傷。MG感染可以激活肺部TLR-2/MyD88/NF-κB炎癥信號(hào)通路，也可以激活Caspase-1形成炎癥小體，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子大量生成，引發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)肺組織炎性損傷。本試驗(yàn)所用的唾液乳桿菌已被證實(shí)具有良好的抗炎效果，能夠有效緩解大腸桿菌O及雞白痢沙門(mén)菌造成的腸道炎性損傷。這一方面是因?yàn)橥僖喝闂U菌對(duì)大腸桿菌O及雞白痢沙門(mén)菌有直接抑制作用，另一方面由于唾液乳桿菌可以改善腸道菌群，進(jìn)而改善腸道菌群代謝譜，特別是可以顯著提高腸道內(nèi)及循環(huán)血液中短鏈不飽和脂肪酸豐度。短鏈不飽和脂肪酸可以直接抑制病原體增殖，也可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺菌能力促進(jìn)病原體清除。因此，本試驗(yàn)所用唾液乳桿菌可能是通過(guò)改善腸道菌群增強(qiáng)肺部抵抗MG感染能力，但更深入的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)所用唾液乳桿菌可有效緩解MG感染肉雞生長(zhǎng)性能下降，此外，該株唾液乳桿菌可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR2、HMGB1、p-p65/p65、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)緩解MG感染肉雞肺部炎性損傷。綜上，本試驗(yàn)所用唾液乳桿菌對(duì)肉雞抵抗MG感染具有較好作用，可減少M(fèi)G感染帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失，在肉雞生產(chǎn)中具有較大應(yīng)用前景。