山羊源3種不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)的多位點(diǎn)序列分析

梁高星，榮詩(shī)琪，王俊偉，李 媛，楊 新，趙光輝，宋軍科

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)()屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬()，是一種寄生性線蟲(chóng)。由于其寄生于牛、羊等反芻動(dòng)物的皺胃中，吸食宿主動(dòng)物血液，而使蟲(chóng)體腸管呈紅色，雌蟲(chóng)白色的生殖管和紅色腸管相互纏繞，使蟲(chóng)體常呈紅白相間的麻花狀外觀，因此又被稱為捻轉(zhuǎn)胃蟲(chóng)或麻花蟲(chóng)。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)生活史簡(jiǎn)單，產(chǎn)卵量大，極易造成環(huán)境嚴(yán)重污染，宿主動(dòng)物常因大量感染而引起嚴(yán)重貧血、高度營(yíng)養(yǎng)不良，以及蟲(chóng)體在發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)和分泌物質(zhì)對(duì)宿主動(dòng)物造成毒害作用，最終常因宿主動(dòng)物極度衰竭而死亡。死亡多發(fā)于春季，是牛羊春乏死亡的主要因素之一，給牛羊健康養(yǎng)殖造成嚴(yán)重威脅。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的種類鑒定，主要以雌性成蟲(chóng)紅白相間的麻花狀外觀，以及在顯微鏡下觀察雌蟲(chóng)陰門(mén)處發(fā)達(dá)的陰門(mén)蓋形態(tài)為依據(jù)，但曾報(bào)道捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋形態(tài)存在多態(tài)性現(xiàn)象。近些年，人們利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，Yin等利用線粒體煙酰胺脫氫酶亞基4(mitochondrial nicotinamide dehydrogenase subunit 4，4)基因作為遺傳標(biāo)記首次對(duì)中國(guó)廣西、云南、陜西、遼寧、黑龍江以及湖北隨州和宜都7個(gè)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明我國(guó)境內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)種群內(nèi)部發(fā)生高度的遺傳變異，種群遺傳分化結(jié)構(gòu)不明顯，種群間存在較高的基因流動(dòng)。Shen等對(duì)賀蘭山地區(qū)同域內(nèi)的野生藍(lán)羊和綿羊體內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株的4、第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer 2，ITS-2)序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同宿主來(lái)源的蟲(chóng)株間存在一定的基因變異，但無(wú)明顯的宿主特異性。Dey等研究了孟加拉國(guó)七個(gè)地形帶捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)種群內(nèi)部及種群間的遺傳變異，分析發(fā)現(xiàn)不同宿主和地理位置的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株共享一個(gè)基因庫(kù)，種群內(nèi)部發(fā)生高度的遺傳變異，但種群之間的遺傳差異不明顯。Sallé等采用單個(gè)蟲(chóng)體全基因組測(cè)序法對(duì)來(lái)自五大洲19個(gè)分離株的223個(gè)個(gè)體進(jìn)行研究分析，闡述了氣候及人類活動(dòng)與全球范圍內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的種群遺傳進(jìn)化關(guān)系之間的關(guān)聯(lián)性。Hunt等通過(guò)蟲(chóng)體表型變化和微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記對(duì)來(lái)自澳大利亞不同地理來(lái)源的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果顯示，不同地理位置的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)在種群結(jié)構(gòu)及表型上均存在差異性。

本研究通過(guò)對(duì)山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)臨床樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)的陰門(mén)蓋具有舌瓣形、亞球形和舌-球混合形三種形態(tài)，但鮮有基于形態(tài)學(xué)差異性并結(jié)合遺傳進(jìn)化差異進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。本研究基于在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋形態(tài)學(xué)差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選ITS-1、ITS-2及4三個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，探究不同陰門(mén)蓋形態(tài)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化差異，以期為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的種類鑒定和分子流行病學(xué)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用71條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)蟲(chóng)體樣本由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室保存，均分離自陜西關(guān)中地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)山羊的皺胃內(nèi)，采集時(shí)間為2019年9月。本試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院畜禽重要寄生蟲(chóng)致病機(jī)制與防控技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 標(biāo)本制作及雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋形態(tài)學(xué)觀察

采集到的蟲(chóng)體樣本清洗干凈后，放入0.85% NaCl溶液中，置于4 ℃使蟲(chóng)體自然松弛，待死亡后，再移入加熱至70 ℃左右的70%酒精中，使蟲(chóng)體充分伸展固定。最后將固定后的蟲(chóng)體保存于70%酒精中，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察時(shí)將蟲(chóng)體從保存液中取出，蒸餾水沖洗后置于乳酸透明液中透明蟲(chóng)體5 min。將透明后的蟲(chóng)體置于載玻片上進(jìn)行顯微觀察，并利用測(cè)微尺測(cè)量蟲(chóng)體全長(zhǎng)和陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS26.0進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3 蟲(chóng)體DNA的提取

不同陰門(mén)蓋形態(tài)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)各3條，蒸餾水洗凈蟲(chóng)體后，將蟲(chóng)體放入1.5 mL離心管中(1條·管)，加入150 μL蛋白酶K溶液(20 mg·mL)，56 ℃過(guò)夜放置14 h以上，取出震碎混勻后，根據(jù)TIANamp Genomic DNA Kit組織基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，從不同陰門(mén)蓋形態(tài)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)體樣品中分別提取基因組DNA，將提取的DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

參照嚴(yán)若峰等文獻(xiàn)中的正向引物P18S和反向引物P5.8SDW擴(kuò)增捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-1基因的部分片段，PCR反應(yīng)體系總體系為25 μL，包括15.1 μL雙蒸水、2.5 μL10×ExBuffer(不含Mg)、0.9 μL MgCl(2.5 mmol·L)、2 μL dNTPs(2.5 mmol·L)、0.5 μL Ex酶(5 U·μL)、上下游引物(25 pmol·μL)各1 μL、2 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，46 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，降至16 ℃結(jié)束。

參照Stevenson等的通用正向引物NC1和反向引物NC2擴(kuò)增ITS-2基因，PCR反應(yīng)體系總體系為25 μL，包括14.25 μL雙蒸水、2.5 μL 10×ExBuffer(不含Mg)、2 μL MgCl(2.5 mmol·L)、2 μL dNTPs(2.5 mmol·L)、0.25 μL Ex酶(5 U·μL)、上下游引物(25 pmol·μL)各1 μL、2 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性2 min，46 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，降至16 ℃結(jié)束。

參照Troell等文獻(xiàn)中的正向引物NAD4-F和反向引物NAD4-R擴(kuò)增線粒體4基因的部分片段。PCR反應(yīng)體系總體系為25 μL，包括15.1 μL雙蒸水、2.5 μL10×ExBuffer(不含Mg)、0.9 μL MgCl(2.5 mmol·L)、2 μL dNTPs(2.5 mmol·L)、0.5 μL Ex酶(5 U·μL)、上下游引物(25 pmol·μL)各1 μL、2 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，降至16 ℃結(jié)束。引物序列見(jiàn)表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果后，利用DNA純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，然后將純化產(chǎn)物連接至pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆，克隆菌液經(jīng)PCR鑒定后，將陽(yáng)性菌液送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 序列分析和構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)

將測(cè)得的基因序列使用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，并參考圖譜校準(zhǔn)，將校準(zhǔn)后的序列上傳至NCBI使用BLAST進(jìn)行比對(duì)，下載匹配度較高的蟲(chóng)種序列作為參考序列，最后采用MEGA6.06中的Neighbor-Joining (N-J)法評(píng)估序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用Kimura 2-parameter參數(shù)模型，引導(dǎo)分析使用1 000個(gè)重復(fù)/樹(shù)進(jìn)行，序列的比對(duì)分析使用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，并利用軟件DnaSP v6分析變異位點(diǎn)，核苷酸多樣性指數(shù)，基因型多樣性，單倍型多樣性。

2 結(jié) 果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋形態(tài)學(xué)觀察

71條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其陰門(mén)蓋存在3種形態(tài)，分別為舌瓣形、亞球形和舌-球混合形(圖1)，所占比例分別為45.07%(32/71)、50.70%(36/71)和4.23%(3/71)。

A. 亞球形陰門(mén)蓋；B. 舌瓣形陰門(mén)蓋；C. 舌-球混合形陰門(mén)蓋A. Spheroidal type vulval flap; B. Linguiform type vulval flap; C. Ligule-spheroid mixed type vulval flap圖1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋的不同形態(tài)特征(100×)Fig.1 Morphological characteristics of the vulval flap of female H. contortus (100×)

2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)測(cè)量

利用測(cè)微尺在光學(xué)顯微鏡下測(cè)量挑選出的43條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)體的全長(zhǎng)和陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度，其中20條舌瓣形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體的平均全長(zhǎng)及陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度分別為25.47和4.47 mm；20條亞球形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體的平均全長(zhǎng)及陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度分別為24.80和3.96 mm；3條舌-球混合形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體的平均全長(zhǎng)及陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度分別為26.66和4.64 mm。3種不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的全長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(>0.05)，而亞球形陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度與其他兩種陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(<0.05)。

2.3 不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)PCR擴(kuò)增

基于ITS-1、TIS-2和4基因，分別對(duì)3種不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均成功擴(kuò)增出目的條帶，其中，ITS-1擴(kuò)增出大小約為500 bp的目的條帶(圖2A)，ITS-2擴(kuò)增出大小約為321 bp的目的條帶(圖2B)，4擴(kuò)增出大小約為800 bp的目的條帶(圖2C)。

表2 不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)全長(zhǎng)及陰門(mén)至蟲(chóng)體末端長(zhǎng)度的長(zhǎng)度范圍和平均值Table 2 The range and average value of the body length and the length from the vulva to the posterior of H. contortus with different vulval flap

A. ITS-1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；B. ITS-2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；C. nad4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；M. DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 舌瓣形陰門(mén)蓋；2. 亞球形陰門(mén)蓋；3. 舌-球混合形陰門(mén)蓋；4. 陰性對(duì)照A. PCR amplification results of ITS-1; B. PCR amplification results of ITS-2; C.PCR amplification results of nad4; M. DL2000 DNA marker; 1. Spheroidal type vulval flap; 2. Linguiform type vulval flap; 3. Ligule-spheroid mixed type vulval flap; 4. Negative control圖2 不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的3個(gè)基因位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of three gene of H. contortus with different vulval flap

2.4 不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-1、TIS-2和nad4基因序列比對(duì)分析

對(duì)具有不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的ITS-1、ITS-2及4基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆及測(cè)序，去除兩端模糊序列后，獲得約404 bp的ITS-1基因序列、231 bp的ITS-2基因序列以及730 bp的4基因序列?；贗TS-1基因序列的分析顯示，3種陰門(mén)蓋形態(tài)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的9個(gè)樣品存在7個(gè)基因型，它們彼此之間的相似性均達(dá)97.3%以上，與GenBank上的相應(yīng)參考序列(AF04492)一致性為97.5%～100%(圖3A)；本研究中ITS-1的7個(gè)基因型中共發(fā)現(xiàn)10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別在68、69、87、125、137、157、225、252、318和333，其中，簡(jiǎn)約型位點(diǎn)有4個(gè)，分別在69、137、225和318；此外，有5個(gè)位點(diǎn)存在堿基缺失，ITS1-S3序列在305位缺失1個(gè)堿基，ITS1-S1、ITS1-S2、ITS1-Q1、ITS1-Q2和ITS1-SQ1在270至273位連續(xù)缺失4個(gè)堿基；核苷酸多態(tài)性為0.85%。ITS-2基因序列的分析顯示9個(gè)樣品存在6個(gè)基因型，它們彼此之間的相似性均達(dá)95.7%以上，與GenBank上的相應(yīng)參考序列(KX534104)一致性為97.0%～100%，其中,3個(gè)亞球形樣品的ITS-2基因序列一致性均達(dá)100%(圖3B)；6個(gè)基因型中共有13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別在18、21、22、28、29、59、63、115、123、139、146、196和219，無(wú)簡(jiǎn)約型位點(diǎn)，沒(méi)有堿基缺失或插入現(xiàn)象，核苷酸多態(tài)性為1.34%。而基于4基因序列的分析結(jié)果表明，9個(gè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)樣品共存在9個(gè)單倍型，各單倍型之間的相似性為97.3%～98.9%，與GenBank上的相應(yīng)參考序列(KJ724441)一致性為97.8%～99.2%(圖3C)；9個(gè)單倍型中共有43個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，19個(gè)簡(jiǎn)約型位點(diǎn)，核苷酸多態(tài)性為1.97%。

A. ITS-1基因; B. ITS-2基因; C. nad4基因; S1-3. 舌瓣形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體；Q1-3. 亞球形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體；SQ1-3. 舌-球混合形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體A. ITS-1 gene; B. ITS-2 gene; C. nad4 gene; S1-3. Nematodes with linguiform vulval flap；Q1-3. Nematodes with spheroid-shaped vulval flap；SQ1-3. Nematodes with ligule-spheroid form vulval flap圖3 不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-1、ITS-2和nad4基因序列比對(duì)分析Fig.3 Sequence analysis of ITS-1, ITS-2 and nad4 gene of H. contortus with different vulval flap

2.5 不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-1、TIS-2基因遺傳進(jìn)化分析

分別利用ITS-1和ITS-2基因位點(diǎn)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，并以指形長(zhǎng)刺線蟲(chóng)(AB222060)作為外群?；贗TS-1基因序列構(gòu)建的N-J進(jìn)化樹(shù)顯示，本研究中分離的3種不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)相應(yīng)基因序列均處于同一進(jìn)化支，基于ITS-2基因序列構(gòu)建的N-J進(jìn)化樹(shù)顯示相似的結(jié)果，本研究中分離的3種不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)相應(yīng)基因序列均處于同一進(jìn)化支，而與柏氏血矛線蟲(chóng)()和似血矛線蟲(chóng)()分屬不同的進(jìn)化支(圖4)。

A. ITS-1基因; B. ITS-2基因; S1-3. 舌瓣形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體；Q1-3. 亞球形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體；SQ1-3. 舌-球混合形陰門(mén)蓋蟲(chóng)體A. ITS-1 gene; B. ITS-2 gene; S1-3. Nematodes with linguiform vulval flap；Q1-3. Nematodes with spheroid-shaped vulval flap；SQ1-3. Nematodes with ligule-spheroid form vulval flap圖4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株ITS-1和ITS-2基因位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Neighbor-Joining法)Fig.4 The phylogenetic tree based on ITS-1 and ITS-2 loci for isolations of H. contortus (Neighbor-Joining method)

3 討 論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病是一種呈世界性分布的牛羊等反芻動(dòng)物寄生蟲(chóng)病，對(duì)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。世界范圍內(nèi)，有關(guān)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)遺傳多樣性的報(bào)道較多，但基于形態(tài)學(xué)差異結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行序列分析的研究報(bào)道尚較少。在我國(guó)，Yin等對(duì)廣西、云南、陜西、遼寧、黑龍江以及湖北隨州和宜都7個(gè)地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)體進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，除云南地區(qū)部分標(biāo)本外，其他地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)均未表現(xiàn)出與地理位置相關(guān)的遺傳多樣性。Shen等對(duì)賀蘭山地區(qū)同域內(nèi)的野生藍(lán)羊和綿羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的遺傳多樣性進(jìn)行了報(bào)道，顯示了相似的結(jié)果，表明來(lái)自不同地區(qū)的群體之間有較高的基因流動(dòng)，但卻沒(méi)有明確的地理障礙。Dey等對(duì)來(lái)自孟加拉國(guó)7個(gè)地形帶不同宿主(山羊和綿羊)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)種群進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹(shù)顯示了兩個(gè)主要的簇，表明孟加拉國(guó)存在兩個(gè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株種群，但簇既不是由地理來(lái)源形成的，也不是由宿主來(lái)源形成的。Kandil等對(duì)來(lái)自埃及3個(gè)地理區(qū)域綿羊源的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)的遺傳多樣性進(jìn)行了報(bào)道，結(jié)果顯示，源自埃及的序列彼此之間的差異很小，并且顯示出與源自其他國(guó)家序列的巨大差異。本研究基于形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果分析和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋存在舌瓣?duì)?、亞球形和?球混合形3種不同形態(tài)，且不形陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的蟲(chóng)體全長(zhǎng)差異不顯著(>0.05)，而亞球形陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)與其他兩種蟲(chóng)體陰門(mén)到蟲(chóng)體末端的長(zhǎng)度存在顯著差異性(<0.05)。

此外，基因序列比對(duì)分析結(jié)果表明，本研究中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的ITS-1、ITS-2和4基因序列與GenBank上的參考序列相似性為均在97%以上?；贗TS-1和ITS-2兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示，本研究所得基因序列與GenBank上的參考序列處于同一進(jìn)化支，提示本研究所分離到的蟲(chóng)體均屬捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)。進(jìn)一步對(duì)ITS-2序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，本研究中9個(gè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)分離株ITS-2共存在13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，個(gè)體間的遺傳差異達(dá)5.6%，高于中國(guó)其他不同地理區(qū)域(2.6%)、孟加拉國(guó)(3.1%)以及澳大利亞等7個(gè)國(guó)家(5.2%)地理源的分離株，同時(shí)也高于我國(guó)賀蘭山地區(qū)野生藍(lán)羊源和綿羊源捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-2的序列差異(4.8%，3.5%)。相較于地理及宿主動(dòng)物源的分離株，本研究中基于形態(tài)學(xué)差異獲得的分離株樣品在ITS-2基因序列中存在更高的差異程度以及更多的多態(tài)性位點(diǎn)，但本研究中3個(gè)亞球形樣品間的ITS-2基因序列卻具有高度一致性，均達(dá)100%(圖4)。此外，本研究中分離株的4基因核苷酸多態(tài)性(1.97%)與中國(guó)其他地理區(qū)域(1.8%～3.7%)，賀蘭山野生藍(lán)羊源(2.1%)和綿羊源(2.0%)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)核苷酸多態(tài)性相近，但本研究中9個(gè)分離株的多態(tài)性位點(diǎn)和簡(jiǎn)約性位點(diǎn)少于前者。綜上所述，本研究初步解析了基于不同形態(tài)陰門(mén)蓋捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)在多個(gè)基因位點(diǎn)上的序列差異性，這為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的種類鑒定和分子流行病學(xué)研究提供了參考數(shù)據(jù)，但要深入闡明其形態(tài)多樣性與遺傳進(jìn)化的關(guān)系，需要進(jìn)行更加深入的研究。

4 結(jié) 論

本研究基于形態(tài)學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)成蟲(chóng)陰門(mén)蓋存在舌瓣形、亞球形和舌-球混合形3種形態(tài)，并進(jìn)一步對(duì)不同形態(tài)陰門(mén)蓋的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-1、ITS-2和4 3個(gè)基因位點(diǎn)的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)陰門(mén)蓋蟲(chóng)體在3個(gè)基因位點(diǎn)上均存在不同程度的堿基差異。而且相較于其他地理源及宿主動(dòng)物源的分離株，本研究中的分離株在ITS-2基因序列中的差異程度更高，多態(tài)性位點(diǎn)更豐富。