貓細(xì)小病毒的遺傳演化及分離毒株的致病性分析

程寶鈺，李子荷，崔燕蕾，李嘉慧，楊鑫瑋，于永樂，楊海燕，單 虎，張傳美

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，青島 266109)

貓細(xì)小病毒(feline parvovirus，F(xiàn)PV)又稱貓泛白細(xì)胞減少癥病毒，俗稱貓瘟病毒，是一種侵害貓科動物的重要病原體，幼齡動物更易感，具有分布廣、變異較快的特點。FPV屬于食肉動物、細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，該種屬中其他成員有犬細(xì)小病毒(canine parvovirus, CPV)、浣熊細(xì)小病毒(raccoon parvovirus, RaPV) 以及水貂腸炎病毒(mink enteritis virus, MEV)。FPV可感染貓科、獴科、浣熊科等多種動物。FPV具有高度接觸傳染性，易感動物的發(fā)病率和死亡率高達25%～90%。1928年，由法國人Verge等首次鑒定FPV，1957年，Bilin等首次成功分離出FPV毒株。我國20世紀(jì)50年代初有此病記載，1984年，首次從自然病例分離到FNF8株，以后陸續(xù)有該病毒分離的研究報道。

FPV核酸全長約5 kb，為單股線性負(fù)鏈DNA分子，有兩個主要的開放閱讀框(ORF)。3′端ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，5′端ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白參與 DNA 復(fù)制、組裝和轉(zhuǎn)運，結(jié)構(gòu)蛋白中 VP2含有584個氨基酸，分子量為67 ku，占病毒粒子的 90%，是主要的衣殼蛋白。VP2蛋白可以刺激宿主產(chǎn)生中和抗體，其關(guān)鍵氨基酸位點的突變會影響抗原特性和宿主范圍。FPV凝集細(xì)胞譜較窄，可在4 ℃、pH6.5條件下凝集豬和恒河猴的紅細(xì)胞。FPV對外界環(huán)境有著較強的抵抗能力，常常存在于環(huán)境中長達幾年，不易被殺滅。

由于FPV在貓科動物中危害很大，而我國流行病學(xué)數(shù)據(jù)有限，本研究采集54份貓糞便拭子，PCR方法檢測FPV并進行2基因克隆與測序，測序成功16份。進一步分析山東省FPV的流行和遺傳進化情況。將陽性樣品接種至F81細(xì)胞，對分離獲得的FPV毒株進行電鏡觀察、間接免疫熒光、血凝試驗、TCID測定、全基因分析及動物回歸試驗，旨在闡明我國FPV的分子流行病學(xué)特點、遺傳演化情況及分離毒株的致病特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8周齡健康田園貓6只：貓血清中FPV HI抗體效價<8，F(xiàn)PV、貓冠狀病毒(FCOV)、貓皰疹病毒(FHV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓白血病毒(FeLV)抗原檢測均為陰性。貓腎細(xì)胞系(F81細(xì)胞)由本實驗室保存。Viral RNA/DNA Extraction Kit、Prime STARMax DNA Polymerase購自TaKaRa公司；抗細(xì)小病毒單克隆抗體購自山東綠都生物科技有限公司；Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-FITC購自Affinity公司。1%濃度豬紅細(xì)胞購自廣州洪泉生物科技有限公司。

1.2 臨床樣品的PCR檢測

2018-2020年，于山東省多家動物醫(yī)院采集54份臨床初診疑似的貓糞便拭子，用pH 6.4的PBS稀釋，離心，取上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用TaKaRa公司Viral RNA/DNA Extraction Kit試劑盒提取樣品中的病毒核酸，并進行PCR檢測，引物FPV-559 F/R為自行設(shè)計(表1)，擎科生物科技有限公司合成。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×酶，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

表1 FPV擴增引物Table 1 FPV gene amplification primers

1.3 FPV的VP2基因測序及遺傳進化分析

對PCR檢測為陽性的臨床樣品，進行2基因擴增，引物FPV2 F/R由作者設(shè)計(見表1)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中，12.5 μL 2×Phanta Max Master Mix 酶，模板DNA 2 μL，上下引物各1 μL，ddHO 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。陽性PCR擴增產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司測序。在GenBank中下載24株參考序列(表2)，使用DNAStar軟件對病毒的2基因序列進行同源性分析，并推導(dǎo)其氨基酸序列。用MEGA 7軟件的ClustalW方法比對，使用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值為500。

表2 24株細(xì)小病毒參考序列Table 2 24 parvovirus reference sequences

1.4 病毒的分離與鑒定

1.4.1 樣品采集 選取1例因自然感染貓瘟病死的青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院臨床病例，取病貓生前新鮮糞便與PBS按照1∶9比例稀釋，12 000 r·min離心10 min。然后將上清液吸出，將上清液與氯仿等比例混合，12 000 r·min離心5 min，取上清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病毒分離 采用吸附接毒的方法，取長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶50%～60%的F81細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS (pH=7.2～7.4) 洗兩遍后，分別接入1 mL細(xì)胞維持液和1 mL處理后的病毒液，細(xì)胞維持液為對照組。37 ℃ 5% CO培養(yǎng)箱中吸附1 h后，將9 mL細(xì)胞維持液加入到細(xì)胞瓶中；每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生明顯病變并且開始脫落時，凍融并離心，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 電鏡觀察 取10 μL病毒液，小心夾取碳包膜銅網(wǎng)，將正面接觸銅網(wǎng)表面10 min后，將多余水分去除，用1%的磷鎢酸染液染色(不超過5 min)，透射電子顯微鏡下觀察。

1.4.4 間接免疫熒光試驗(IFA) 將F81細(xì)胞以2×10cell·mL的密度接入6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)細(xì)胞量至60%，以10%的病毒量感染F81細(xì)胞，48 h見明顯CPE后，固定液固定，加入500 μL以1∶200 稀釋的鼠抗VP2單克隆抗體，37 ℃避光孵育1 h，再加入500 μL以1∶200 稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃避光孵育1 h。熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.4.5 血凝試驗(HA) 按常規(guī)微量HA操作方法在96 V型孔板中進行血凝試驗。

1.4.6 TCID的測定 以1× 10cells·mL細(xì)胞量接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃，5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。病毒液進行10倍連續(xù)梯度稀釋，將稀釋好的病毒液接種入96孔板中(孔板細(xì)胞量為50%～60%)，從病毒稀釋倍數(shù)最高的病毒液由高到低依次接種，各稀釋度病毒液接種8個孔，每孔加入100 μL病毒液。第11、12兩列各加100 μL細(xì)胞維持液作為細(xì)胞對照。觀察細(xì)胞，7 d后用Reed-Muench氏法計算病毒的TCID。

1.5 FPV全基因測序分析

參照文獻[7]合成FPV全基因擴增引物(表1)，并進行PCR擴增。F1、F2、F3引物擴增FPV基因組中間序列，U1、U2、Y1、Y2引物擴增FPV基因組兩端發(fā)卡結(jié)構(gòu)。電泳鑒定正確的PCR產(chǎn)物使用TaKaRa膠回收試劑盒進行膠回收。用5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit將7個片段分別連接載體，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)菌液，將電泳檢測陽性的送擎科生物科技有限公司測序。

1.6 動物回歸試驗

選取3只8周齡的幼貓，以口服方式按2 mL·kg接種病毒滴度為10TCID·mL的 FPV病毒液。接種后每天監(jiān)測體重、體溫，觀察試驗貓狀態(tài)，采集肛拭子檢測感染排毒情況。攻毒后隔天采血，監(jiān)測血常規(guī)，HI試驗檢測抗體水平。動物死亡后，剖檢觀察各組織的病理變化，并用10%福爾馬林固定，HE染色，制作病理切片，顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 FPV VP2測序及遺傳進化分析

將陽性樣品進行2基因擴增，得到約為2 211 bp大小的擴增條帶(圖1)，測序分析得到15株FPV毒株2基因序列和1株CPV毒株2基因序列。

M. DL5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；+. 陽性對照；-. 陰性對照；C20. QDC20毒株M. DL5000 DNA marker; +. Positive control; -. Negative control; C20. QDC20 strain圖1 FPV-QDC20 VP2檢測電泳圖Fig.1 Virus sample QDC20 VP2 PCR detection electropherogram

將本試驗獲得的序列與表2中的24株已發(fā)表的細(xì)小病毒參考序列進行比較與分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明，除QNBL2、QNBL3 2株以外，另外13株FPV毒株處于同一個大的分支上，與20世紀(jì)末美國發(fā)表的FPV-377毒株以及20世紀(jì)末到21世紀(jì)初中國上海、長春、山東、桂林等地分離的FPV和MEV毒株親緣關(guān)系較近，與輝瑞公司疫苗株Felocell以及芬蘭、加拿大、葡萄牙等地分離的一些毒株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。QDC20毒株與1986―2017年在中國山東、長春、上海、桂林等地分離到的FPV和MEV親緣關(guān)系較近，可以認(rèn)為是1株在中國境內(nèi)有廣泛分布的經(jīng)典FPV毒株(圖2)。通過比對16株毒株的VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點80、93、103、232、305、323、375、564、568，確定15株為FPV毒株，1株為CPV毒株。以Felocell疫苗株為參考毒株進行氨基酸位點分析比對發(fā)現(xiàn)，15株FPV在16、31、80、91、93、101、103、232、267、300、322、440、562等多個氨基酸位點有變異，其中，91、232、562 3個位點變異毒株較多(表3)。

表3 VP2蛋白氨基酸位點變異分析Table 3 VP2 Protein amino acid position variation comparison

▲.本實驗室分離測序毒株；△.美國輝瑞公司疫苗毒株▲. Isolate sequencing virus strains in this study; △. Pfizer vaccine strain圖2 FPV VP2基因的遺傳進化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of FPV VP2 gene

2.2 病毒分離鑒定結(jié)果

將處理后的臨床樣品接種F81細(xì)胞48 h后，在顯微鏡觀察下出現(xiàn)細(xì)胞伸長、拉絲、結(jié)網(wǎng)、脫落等典型的細(xì)胞病變，盲傳3代獲得1株FPV毒株，命名為FPV-QDC20。電鏡觀察病毒粒子為無囊膜、二十面體立體對稱，直徑約22 nm(圖3)，病毒樣顆粒與細(xì)小病毒的典型形態(tài)相符合。間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定為FPV陽性(圖4)，其第3代細(xì)胞毒HA效價為2，病毒滴度為10TCID·mL。擴增QDC20的2基因后，分析VP2蛋白上15個關(guān)鍵氨基酸位點(Lys-80、Met-87、Lys-93、Ile-101、Val-103、Val-232、Ser-297、ALA-300、ASP305、Asp-323、Asp-375、ASN-426、VAL-555、ASN-564和ALA-568)，確定該毒株為FPV。

圖3 FPV-QDC20的電鏡觀察結(jié)果(25 000×)Fig.3 Electron microscope observation of virus strain QDC20 (25 000×)

圖4 FPV-QDC20的IFA鑒定結(jié)果(200×)Fig.4 Fluorescence identification of FPV-QDC20(200×)

2.3 全基因測序分析

測序并分析全基因序列，F(xiàn)PV-QDC20全基因長5 123 bp，其中3′Y型結(jié)構(gòu)全長125 bp，5′U型結(jié)構(gòu)全長188 bp；ORF1全長2 007 bp，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2； ORF2全長2 157 bp，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2(圖5)。

圖5 FPV-QDC20的全基因擴增電泳圖Fig.5 Feline parvovirus strain QDC20 complete gene PCR electrophoresis

2.4 動物回歸試驗

2.4.1 臨床癥狀 幼貓于攻毒后第3天開始持續(xù)排毒直至死亡。攻毒初期被毛雜亂，精神沉郁，食欲減退，輕微腹瀉，攻毒后5 d體重開始下降；攻毒后7 d開始體溫有升高，9 d開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，體溫明顯升高，食欲減退至廢絕，嘔吐，腹瀉，脫水，病程持續(xù)3～4 d后，3只貓全部死亡。

2.4.2 血常規(guī)檢查結(jié)果 在攻毒后1、3、5、7、9、11、13 d給試驗貓采血，進行血常規(guī)檢查。結(jié)果表明，攻毒組的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)明顯下降(圖6)。

圖6 試驗組貓血常規(guī)結(jié)果Fig.6 Blood routine data of infected cats

2.4.3 抗體檢測結(jié)果 攻毒貓于0、1、3、5、7、9、11、13 d分別采血，分離血清，HI檢測抗體，結(jié)果顯示，抗體在5 d明顯變高，9 d抗體效價<8，低抗體狀態(tài)一直持續(xù)到貓死亡(圖7)。

圖7 試驗組貓抗體效價Fig.7 Antibody titer of infected cats

2.4.4 剖檢及病理組織學(xué)觀察結(jié)果 攻毒貓均在攻毒后14～15 d死亡，剖檢可見肛門周圍有糞便，小腸黏膜充血水腫，以十二指腸和直腸病變最為突出，腸道內(nèi)容物有血絲。肝腫大呈暗紅色，脾腫大，充血出血，脾邊緣出現(xiàn)梗死性病灶(圖8)。心肌組織間隙增寬，心肌纖維出血，橫紋肌斷裂，心肌細(xì)胞變性；肝血管壁通透性增加，出血，部分細(xì)胞變性壞死，肝索細(xì)胞變性；肺泡腔空隙間小，肺泡壁增厚，出現(xiàn)肺實變。肺出血、淤血，炎性細(xì)胞浸潤；腎小管閉鎖，腎小球略有萎縮，變性壞死；脾出現(xiàn)部分壞死，局部有充血，出血現(xiàn)象。十二指腸腸壁水腫，出血、淤血?？漳c腸壁水腫，出血、淤血。回腸壁水腫，紅細(xì)胞少量彌漫在組織間隙(圖9)。

圖8 攻毒組貓腸、肝病變Fig.8 Intestinal and liver pathological changes in challenged cats

(圖9)(Fig.9 Continued on the next page)

A、B. 心肌組織間隙明顯增寬，心肌纖維出血，橫紋肌斷裂；C、D. 肝血管壁通透性增加，出血，肝細(xì)胞變性；E、F. 肺泡壁增厚，上皮細(xì)胞變性，肺出血、淤血，部分肺泡壁斷裂，炎性細(xì)胞浸潤；G、H. 部分腎小球壞死變小，局部出血；I、J. 脾出血嚴(yán)重，出現(xiàn)干酪樣壞死；K、L. 回腸腸壁出血，水腫；M、N. 空腸壁出血，水腫，上皮細(xì)胞變性。左側(cè)圖片放大倍數(shù)為100×，右側(cè)圖片放大倍數(shù)為400×A, B. Myocardial tissue gap widened significantly, myocardial fiber bleeding, striated muscle rupture; C, D. Hepatic vascular wall permeability increased, bleeding, hepatocyte degeneration; E, F. Alveolar wall thickening, epithelial cell degeneration, pulmonary bleeding, congestion, part of alveolar wall fracture, inflammatory cell infiltration; G, H. Partial glomerulus necrosis became smaller, local hemorrhage; I, J. The spleen is hemorrhaging badly, showing caseous necrosis; K, L. Ileum wall hemorrhage, edema; M, N. Jejunum wall hemorrhage, edema, epithelial cell degeneration. The magnification of the picture on the left is 100×, and that on the right is 400×圖9 攻毒貓各組織病理切片F(xiàn)ig.9 Pathological section of infected cats

3 討 論

本研究于2018—2020年采集山東省多家動物醫(yī)院疑似貓瘟樣本54份，PCR擴增2基因并進行測序，成功對16株病毒株的2基因全長進行測序，推導(dǎo)出氨基酸序列，與NCBI中的參考序列進行比對和分析。通過比對關(guān)鍵氨基酸位點15株為FPV，1株為貓源CPV。除QNBL2、QNBL3兩株外，本實驗室獲得的山東地區(qū)FPV毒株序列在進化樹上處于一個大的分支上，與20世紀(jì)末的美國毒株以及20世紀(jì)末到21世紀(jì)初中國上海、長春、山東、桂林等地分離的FPV和MEV毒株親緣關(guān)系較近，與輝瑞公司疫苗株、芬蘭、加拿大、葡萄牙等地分離的一些毒株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，本研究分離的所有毒株都與歐洲毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。QDC20毒株與20世紀(jì)末到21世紀(jì)初在中國各地分離到的FPV和MEV親緣關(guān)系較近，可以認(rèn)為是一株在中國境內(nèi)有廣泛分布的經(jīng)典型FPV毒株。

VP2蛋白形成FPV病毒的大部分衣殼結(jié)構(gòu)，決定病毒株的抗原特性與宿主范圍。VP2 蛋白氨基酸中 Loop 1 ～ Loop 5 構(gòu)成5個主要環(huán)狀三級結(jié)構(gòu)區(qū)域。Loop 1、2、4 既構(gòu)成 VP2 蛋白質(zhì)折疊單元纖突頂端部分，又與第93、222、224和426位氨基酸位點共同構(gòu)成抗原位點A(site A)； Loop 3不但構(gòu)成蛋白質(zhì)折疊單元的肩部，而且還與第 299、300和302位氨基酸位點共同形成抗原位點B (site B)。研究表明，F(xiàn)PV是CPV和MEV的共同的祖先，決定FPV的宿主范圍氨基酸位點為80、93、103、323、564、568位點。以Felocell疫苗株為參考毒株進行氨基酸位點分析比對發(fā)現(xiàn)，本研究的15株FPV序列在16、31、80、91、93、101、103、232、267、300、322、440、562共13個氨基酸位點有變異，其中在91、232、562三個位點有變異的毒株較多，其他變異位點較為分散。

第91位氨基酸位點突變位于 Loop 1中，第232位氨基酸位點突變位于Loop 2中，這些位點的突變可能改變VP2 蛋白折疊構(gòu)象，也可能改變抗原位點A的特性，從而影響傳統(tǒng)疫苗株產(chǎn)生的中和抗體對抗原A位點的識別，逃避免疫監(jiān)視；第562位氨基酸位點不位于已知的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，其功能還需要進一步探究。這些變異數(shù)量較多的突變位點有可能是在疫苗壓力下產(chǎn)生的，可能導(dǎo)致免疫失敗，需要有針對性的進行下一步研究。第93位氨基酸殘基是抗原位點A(site A)中的一個關(guān)鍵位點，它的突變可能會改變病毒粒子的抗原性和宿主范圍。出現(xiàn)此變異可能提高FPV毒株在犬細(xì)胞中的感染性，降低毒株在貓細(xì)胞上的感染性。有研究表明VP2蛋白93位氨基酸殘基對CPV與犬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)結(jié)合能力及感染宿主細(xì)胞有影響，對宿主范圍起重要作用。第300位氨基酸殘基是抗原位點B(site B)中的一個關(guān)鍵位點，可能與中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)，此突變有可能使疫苗株產(chǎn)生的中和抗體效力降低。有研究表明第300位氨基酸的變化可能改變宿主范圍，還能協(xié)調(diào)其他變異位點改變病毒與TfR受體的結(jié)合從而改變感染效率。

有研究表明在貓科動物的體內(nèi)有多種細(xì)小病毒共感染的病例，不同的細(xì)小病毒共感染貓科動物可能導(dǎo)致病毒基因重組，使宿主范圍進一步擴大。本研究中發(fā)現(xiàn)QDBL2毒株中出現(xiàn)了80、93、103三個氨基酸位點變異，一般認(rèn)為這些位點在FPV上是保守的，這些變異通常出現(xiàn)在CPV中，這3個變異位點的出現(xiàn)，或許跟CPV與FPV的重組有關(guān)。FPV自1928年被發(fā)現(xiàn)以來，一直是貓科動物危害最大的傳染病病原之一，進一步監(jiān)測細(xì)小病毒的變異情況對細(xì)小病毒傳染病的預(yù)防十分重要。

本研究的分離株FPV-QDC20動物回歸試驗結(jié)果顯示，該分離株可以感染貓并引起顯著的臨床癥狀，最終導(dǎo)致試驗貓死亡。未來還需要進行進一步的廣泛的流行病學(xué)調(diào)查，監(jiān)測FPV的遺傳變異情況及目前使用的FPV疫苗的有效性。

4 結(jié) 論

本研究得到15株FPV2基因序列，遺傳進化樹顯示，與20世紀(jì)末的美國毒株以及20世紀(jì)末以來中國內(nèi)地分離毒株親緣關(guān)系較近，與歐洲毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以Felocell疫苗株為參考毒株進行氨基酸位點分析比對發(fā)現(xiàn)，本研究的15株FPV序列在13個氨基酸位點有變異。成功分離1株FPV，命名為QDC20。該毒株滴度為10TCID·mL；動物回歸試驗結(jié)果顯示，該分離株有顯著的致病性，最終導(dǎo)致試驗貓死亡。