雙氫睪酮通過調(diào)控孕酮、雌二醇和細(xì)胞凋亡參與綿羊子宮功能

丁自強(qiáng)，葛聞博，段宏偉，呂建樹，曾建林，王文娟，牛 甜， 張 勇，趙興緒，胡俊杰*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

孕酮(progesterone, P)和雌二醇(oestrogen, E)是妊娠建立和維持所需的重要類固醇激素，同時(shí)P和E也控制著子宮植入窗口期的開始和結(jié)束。在黃體期P分泌增加，能夠抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelium cells, EEC)的增殖，并誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分化并改變其生理形態(tài)和功能。也可調(diào)節(jié)干擾素刺激因子和組織蛋白酶L等下游因子，激活MAPK和PI3K通路，促進(jìn)子宮腺體的發(fā)育。E也是子宮中必需的調(diào)節(jié)激素，E能夠通過胰島素樣生長(zhǎng)因子受體激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，提供營養(yǎng)，調(diào)節(jié)子宮功能。而在敲除雌激素受體(ERα和ERβ)的雌性動(dòng)物中出現(xiàn)卵巢損傷、子宮發(fā)育不良和胚胎植入率下降。

雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)是由睪酮(testosterone, T)在5α-還原酶(5α-red1和5α-red2)不可逆地催化生成的一種重要類固醇激素，具有與雄激素受體(androgen receptor, AR)更高的親和力，因此被認(rèn)為是比T更有效的雄激素。研究表明，DHT增強(qiáng)了P誘導(dǎo)的人類子宮蛻膜化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，并增加了豬卵巢中ERα的表達(dá)和子宮中ERβ的表達(dá)。此外，在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，DHT和P發(fā)揮相似作用，均以濃度依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，并且DHT和P的這種促凋亡反應(yīng)可被E拮抗。細(xì)胞凋亡是由B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B cell lymphoma protein 2, Bcl-2)和半胱天冬酶家族控制，并由Bcl-2相關(guān)X 蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)/ Bcl比率決定細(xì)胞凋亡敏感性。在對(duì)黃體退化的研究中發(fā)現(xiàn)，DHT顯著減少了Bax和半胱天冬酶3(caspase 3, CASP3)的表達(dá)，抑制黃體細(xì)胞凋亡。然而，DHT是否通過影響反芻動(dòng)物EEC的凋亡而影響子宮生理功能，尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)以小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，檢測(cè)不同子宮時(shí)期DHT合成酶及受體表達(dá)，并用不同濃度的DHT(10～10mol·L)和AR抑制劑氟他胺(flutamide, Flu)處理體外培養(yǎng)的綿羊EEC，檢測(cè)P和E水平、合成酶及受體的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)相關(guān)凋亡因子表達(dá)。為闡明DHT是否通過調(diào)節(jié)P、E和細(xì)胞凋亡影響子宮功能提供新數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體

牛血清白蛋白(BSA，SW3015)、TRIzol(R1100)和RIPA裂解液(R0010)均購于Solarbio公司，顯影液、定影液和ECL發(fā)光液均購于Beyotime公司，胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養(yǎng)基(SH30023.01)均購于Hyclone公司，兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司，DHT和Flu標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，P(TY98251)和E(TY98241)ELISA試劑盒購于上海穎心?？贵w：5α-red1(bs-11308R)、5α-red2(bs-6700R)、類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR，bs-3570R)、細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(P450 scc，bs-10099R)、芳香化酶(P450arom，bs-0114M)、孕酮受體(PGR，bs-23376R)、G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER，bs-1380R)、活化半胱天冬酶3(Act-CASP3，bs-0081R)、β-actin(bs-0061R)以及二抗(bs-0295G-HRP和bs-40296G-HRP)均購于北京Bioss；ERα(ab-66102)、ERβ(ab-3576)、AR(ab-3509)均購于英國Abcam；Bax(T40051)、Bcl-2(T45006)均購于上海Abmart。

1.2 樣品收集

小尾寒羊，年齡約1.5歲，體重約25～35 kg。在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)收集卵泡期(=8)、黃體期(=6)和妊娠期(=5)的正常子宮，放置在35～37 ℃含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在冰上用手術(shù)刀分離不同時(shí)期的子宮角，PBS清洗3次，-80 ℃下儲(chǔ)存。

1.3 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)與處理

根據(jù)文獻(xiàn)[14]，體外培養(yǎng)卵泡期綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。使用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h更換1次，直到細(xì)胞密度約85%～90%。處理前添加不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基12 h。為研究DHT對(duì)P和E相關(guān)蛋白及子宮凋亡的影響，將終濃度為10～10mol·L的DHT和10mol·LFlu加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中24 h。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

根據(jù) ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)經(jīng)Flu和不同濃度DHT處理的上皮細(xì)胞上清液中P和E的濃度，上清液通過0.45 mm過濾器過濾。試劑盒最低檢測(cè)濃度P小于0.1 ng·mL，E小于1.0 pg·mL，板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%。P含量以ng·mL表示，E含量以pg·mL表示。

1.5 細(xì)胞鑒定與細(xì)胞免疫熒光

用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18、5α-還原酶和AR在綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)。將培養(yǎng)的內(nèi)膜細(xì)胞固定在載玻片上后，PBS洗滌，并用5 mL 4%(V/V)多聚甲醛固定，并在-20 ℃下保存。使用時(shí)，在4 ℃下用PBS洗滌，用0.1%(V/V)曲拉通處理30 min，然后用5%(V/V)BSA孵育30 min。一抗孵育(角蛋白18和5α-還原酶，1∶300；AR，1∶200)。陰性對(duì)照用2%的BSA代替一級(jí)抗體孵育。使用FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)(1∶200)，然后使用1 μg·mL4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行核重復(fù)染色拍照。

1.6 總RNA提取及qRT-PCR

通過TRIzol處理組織和細(xì)胞沉淀樣品，釋放總RNA。用微量核酸分析儀測(cè)定吸光度A/ A值，電泳檢測(cè)RNA純度和完整性。使用prime script RT試劑盒和gDNA橡皮擦反向轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。檢測(cè)不同部位和培養(yǎng)細(xì)胞中5-1、5-2、、、450、3β羥基類固醇脫氫酶(3-)、450、、、、、-2和3，以-為參考基因。設(shè)定條件為95 ℃ 300 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。結(jié)果由2計(jì)算得出。引物序列見表1。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primers sequence of target genes and house-keeping gene

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

向樣品中加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，充分裂解，12 000×，4 ℃離心15 min。提取總蛋白，并使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。然后將收集的蛋白質(zhì)上清液加入5×蛋白上樣緩沖液中，充分混合，在98 ℃變性15 min，-20 ℃儲(chǔ)存。使用實(shí)驗(yàn)室改良的Western blot技術(shù)，該技術(shù)使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用1×TBST沖洗，5%脫脂奶粉的TBST密封1 h。經(jīng)一抗4 ℃孵育24 h，其中5α-red1、5α-red2、StAR、P450 scc、P450arom、PGR、GPER和Act CASP3均為1∶500配制，ERα、ERβ和AR均為1∶1 000配制，Bax和Bcl-2均為1∶1 500配制，以β-actin(1∶4 000)為內(nèi)參，膜與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶4 000)37 ℃共孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液檢測(cè)免疫復(fù)合物，并用ImageJ定量表達(dá)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 24.0軟件(美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示，并進(jìn)行正態(tài)性和同方差檢驗(yàn)、單因素方差分析和鄧肯多重檢驗(yàn)。如果<0.05，則差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)的EEC的鑒定及5α-red1、5α-red2和AR的表達(dá)和定位

如圖1所示，通過免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞角蛋白18在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。5α-red1、5α-red2和AR在EEC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)。

a～c. Cytokeratin 18的表達(dá)；d～i. DHT合成酶5α-red1和5α-red2的表達(dá)；j～l. AR的表達(dá)；m～o.陰性對(duì)照a-c. Expression of cytokeratin 18; d-i. Expression of DHT synthetase 5α-red1 and 5α-red2; j-l. Expression of AR; m-o. Negative control圖1 綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞鑒定及DHT合成酶和雄激素受體AR的免疫熒光分析(200×)Fig.1 Sheep EEC identification and DHT synthetase and AR immunofluorescence analysis(200×)

2.2 不同時(shí)期綿羊子宮中5α-red1、5α-red2和AR的表達(dá)變化

DHT合成酶5α-red1、5α-red2和AR在子宮不同階段的表達(dá)水平如圖2A～C。5α-red1、5α-red2和AR在妊娠子宮中的mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于卵泡期子宮和黃體期子宮(<0.05)。

A.5α-red1、5α-red2和AR相對(duì)mRNA水平；B.5α-red1、5α-red2和AR蛋白質(zhì)免疫印跡；C.5α-red1、5α-red2和AR的相對(duì)蛋白水平。不同小寫字母之間差異顯著(P<0.05)，相同字母之間差異不顯著(P>0.05),下同A.Relative mRNA levels of 5α-red1, 5α-red2 and AR; B.Western blot of 5α-red1， 5α-red2 and AR; C.Relative protein levels of 5α-red1, 5α-red2 and AR. There was significant difference between different lowercase letters (P<0.05), and there was no significant difference between the same letters (P>0.05)，the same as below圖2 綿羊子宮不同時(shí)期5α-red1、5α-red2和AR表達(dá)Fig.2 Expression of 5α-red1, 5α-red2 and AR in sheep uterus at different stages

2.3 不同濃度DHT(10-10～10-7 mol·L-1)對(duì)體外培養(yǎng)的EEC中AR表達(dá)的影響

為了檢測(cè)DHT是否通過AR發(fā)揮作用，添加不同濃度DHT(10～10mol·L)體外培養(yǎng)綿羊子內(nèi)膜上皮細(xì)胞。結(jié)果如圖3，在10～10mol·L時(shí)，mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組和10mol·L組(<0.05)。在10～10mol·L時(shí)，AR蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組和10～10mol·L組(<0.05)。

A.AR相對(duì)mRNA水平；B.AR蛋白質(zhì)印跡；C.AR的相對(duì)蛋白水平A. AR relative mRNA levels; B. AR Western blot; C. AR relative protein levels圖3 DHT對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中AR表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DHT on AR expression of sheep EEC in vitro

2.4 不同濃度DHT對(duì)體外培養(yǎng)的EEC中P4合成及受體PGR表達(dá)的影響

在DHT(10～10mol·L)時(shí)，P水平顯著升高(<0.05，圖4A)。對(duì)照組和處理組(10～10mol·L)的P平均濃度分別為(12.66±0.54)、(12.93±0.29)、(13.32±0.32)、(14.95±0.44)和(16.03±0.31) ng·mL。此外，還檢測(cè)P合成酶StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的表達(dá)(圖4B～D)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白和mRNA的表達(dá)以濃度依賴的方式增加，P450 scc蛋白和mRNA的表達(dá)也上調(diào)，在10mol·LDHT時(shí)最為顯著(<0.05)。DHT對(duì)3-mRNA表達(dá)的上調(diào)在10mol·L時(shí)最為顯著(<0.05)。mRNA表達(dá)在10～10和10mol·LDHT上調(diào)，而PGR蛋白表達(dá)在10～10mol·LDHT上調(diào)，但在10mol·LDHT下調(diào)(<0.05)。

A.孕酮水平；B.StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的相對(duì)mRNA水平；C.StAR、P450 scc和PGR的蛋白質(zhì)免疫印跡；D.StAR、P450 scc和PGR的相對(duì)蛋白水平A.P4 levels; B.Relative mRNA levels of StAR, P450 scc, 3β-HSD and PGR; C. Western blot of StAR, P450 scc and PGR; D. StAR, P450 scc and PGR relative protein levels圖4 DHT對(duì)EEC中P4合成和PGR表達(dá)的影響Fig.4 Effects of DHT on P4 synthesis and PGR expression in EEC

2.5 體外培養(yǎng)的EEC中添加Flu對(duì)P4合成及受體PGR表達(dá)的影響

為探索DHT對(duì)P的影響是否由AR介導(dǎo)，添加了10mol·LFlu。結(jié)果顯示，添加Flu的處理組較DHT處理組的P水平顯著降低(<0.05，圖5A)。對(duì)照組和處理組的P平均濃度分別為(13.59±0.39)、(14.95±0.44)、(13.74±0.35)和(13.13±0.10) ng·mL。StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的表達(dá)，如圖5B～D所示。在mRNA表達(dá)方面，添加10mol·LDHT和10mol·LFlu顯著抑制、450、3-和的表達(dá)(<0.05)。然而，蛋白表達(dá)中，只有StAR的表達(dá)被Flu阻斷(<0.05)，P450 scc和PGR的表達(dá)并未減少，反而P450 scc的表達(dá)在添加10mol·LDHT和10mol·LFlu時(shí)表達(dá)增加(<0.05)。

A.孕酮水平；B.StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的相對(duì)mRNA水平；C.StAR、P450 scc和PGR的蛋白質(zhì)免疫印跡；D.StAR、P450 scc和PGR的相對(duì)蛋白水平A.P4 levels; B.Relative mRNA levels of StAR, P450 scc, 3β-HSD and PGR; C. Western blot of StAR, P450 scc and PGR; D. StAR, P450 scc and PGR relative protein levels圖5 添加Flu對(duì)EEC中P4合成和PGR表達(dá)的影響Fig.5 Effects of addition of Flu on P4 synthesis and PGR expression in EEC

2.6 添加不同濃度DHT對(duì)體外培養(yǎng)的EEC中E2合成及雌激素受體表達(dá)的影響

結(jié)果表明，10～10mol·LDHT時(shí)，E水平顯著降低，在10mol·LDHT時(shí)最顯著(<0.05，圖6A)。對(duì)照組和處理組的E平均濃度分別為(155.30±4.23)、(151.18±2.37)、(143.62±0.57)、(121.75±2.54)和(130.38±3.69) pg·mL。添加10～10mol·LDHT可降低P450arom和ERα mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，且差異顯著(<0.05)。然而，DHT促進(jìn)了ERβ和GPER的表達(dá)，在10～10mol·LDHT時(shí)顯著上調(diào)(<0.05)。

A.雌二醇水平；B. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相對(duì)mRNA水平；C. P450arom、ERα、ERβ和GPER的蛋白質(zhì)免疫印跡；D. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相對(duì)蛋白水平A.E2 levels; B.Relative mRNA levels of P450arom, ERα, ERβ and GPER; C.Western blot of P450arom, ERα, ERβ and GPER; D.P450arom, ERα, ERβ and GPER relative protein levels圖6 DHT對(duì)EEC中E2合成及雌激素受體表達(dá)的影響Fig.6 Effects of DHT on E2 synthesis and oestrogen receptor expression in EEC

2.7 添加Flu對(duì)體外培養(yǎng)的EEC中E2合成及雌激素受體表達(dá)的影響

添加Flu結(jié)果顯示，E水平的降低被阻止，且差異顯著(<0.05，圖7A)。對(duì)照組和處理組的E水平分別為(157.09±1.25)、(120.23±0.51)、(140.02±0.14)、(141.70±3.05) pg·mL。P450arom、ERα、ERβ和GPER的表達(dá)如圖7B～D所示。結(jié)果表明，10mol·LDHT降低了450和mRNA和ERα蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種下降被10mol·LFlu部分阻斷(<0.05)，也部分阻斷了mRNA和GPER蛋白表達(dá)的增加(<0.05)。

A.雌二醇水平；B. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相對(duì)mRNA水平；C. P450arom、ERα、ERβ和GPER的蛋白質(zhì)免疫印跡；D. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相對(duì)蛋白水平A.E2 levels; B.Relative mRNA levels of P450arom, ERα, ERβ and GPER; C.Western blot of P450arom, ERα, ERβ and GPER; D.P450arom, ERα, ERβ and GPER relative protein levels圖7 添加Flu對(duì)EEC中E2合成和雌激素受體表達(dá)的影響Fig.7 Effects of addition of Flu on E2 synthesis and oestrogen receptor expression in EEC

2.8 不同濃度DHT對(duì)體外培養(yǎng)的EEC凋亡相關(guān)因子的影響

為探索DHT對(duì)綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外凋亡的影響，相關(guān)凋亡因子Bax、Bcl-2、CASP3和Act-CASP3的表達(dá)如圖8A～C。結(jié)果表明，隨著DHT濃度的增加(10～10mol·L)，Bax mRNA和蛋白表達(dá)增加，3 mRNA和Act-CASP3蛋白表達(dá)增加(<0.05)。10和10mol·LDHT分別增加Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)。但10和10mol·LDHT降低了-2 mRNA表達(dá)(<0.05)。10～10mol·LDHT上調(diào)Bax/Bcl-2比值。凋亡敏感性增加。

A.Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和CASP3相對(duì)mRNA水平；B.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的蛋白質(zhì)免疫印跡；C.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的相對(duì)蛋白水平A. Relative mRNA levels of Bax, Bcl-2, Bax/Bcl-2 and CASP3; B. Western blot of Bax, Bcl-2 and Act-CASP3; C. Relative protein levels of Bax, Bcl-2, and Act-Casp3圖8 不同濃度DHT對(duì)EEC中相關(guān)凋亡因子的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DHT on apoptosis-related factors of EEC

2.9 添加Flu對(duì)體外培養(yǎng)的EEC中凋亡相關(guān)因子的影響

為檢測(cè)DHT對(duì)凋亡的影響是否由AR介導(dǎo)，添加Flu檢測(cè)體外培養(yǎng)的綿羊EEC的凋亡相關(guān)因子變化(圖9A～C)。結(jié)果顯示，10mol·LFlu部分阻斷了10mol·LDHT對(duì)Bax、CASP3和Act-CASP3 mRNA和蛋白表達(dá)的增加(<0.05)，而對(duì)Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)沒有影響。Bax/Bcl-2的表達(dá)被10mol·LFlu部分阻斷，顯著低于10mol·LDHT(<0.05)。

A.Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和CASP3相對(duì)mRNA水平；B.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的蛋白質(zhì)免疫印跡；C.Bax、Bcl-2、和Act-CASP3的相對(duì)蛋白水平A. Relative mRNA levels of Bax, Bcl-2, Bax/Bcl-2 and CASP3; B. Western blot of Bax, Bcl-2 and Act-CASP3; C. Relative protein levels of Bax, Bcl-2, and Act-CASP3圖9 添加Flu對(duì)EEC中相關(guān)凋亡因子的影響Fig.9 Effects of Flu addition on apoptosis-related factors of EEC

3 討 論

DHT參與調(diào)節(jié)子宮功能。本研究中，5α-red1、5α-red2和AR在綿羊EEC中表達(dá)，這與人、豬、大鼠和小鼠的結(jié)果一致，表明綿羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞能夠合成和利用DHT。在綿羊子宮不同時(shí)期DHT合成酶和AR表達(dá)存在差異。妊娠期子宮中DHT合成和AR表達(dá)最低。這表明DHT可能在不同階段發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，例如黃體退化。已有證據(jù)表明，DHT在小鼠子宮中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜周期，并嚴(yán)格控制G1/S和G2/M細(xì)胞，觸發(fā)轉(zhuǎn)率級(jí)聯(lián)，調(diào)控子宮細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，本試驗(yàn)還檢測(cè)了DHT對(duì)EEC中AR的影響。結(jié)果顯示，高濃度DHT可能通過配體-受體效應(yīng)促進(jìn)AR的表達(dá)。在雌性動(dòng)物中，缺乏AR可能會(huì)導(dǎo)致多種妊娠疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥和反復(fù)流產(chǎn)。這些證據(jù)充分表明DHT通過AR影響子宮功能。

DHT和P在子宮中可能發(fā)揮相似的生物學(xué)功能，P的生物學(xué)作用需要其特異性受體PGR介導(dǎo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DHT可促進(jìn)P合成酶StAR和P450 scc基因和蛋白的表達(dá)，這可能會(huì)增加子宮中P的濃度，從而發(fā)揮生理作用。研究表明，子宮內(nèi)的P可拮抗E，促進(jìn)膜細(xì)胞凋亡，并降低子宮重量。同時(shí)，AR抑制劑Flu可以阻斷P合成酶的增加，表明DHT至少部分通過AR介導(dǎo)調(diào)節(jié)P合成。此外，DHT也顯著增加PGR的蛋白表達(dá)，但在高濃度下抑制了這種增加，這與DHT處理子宮內(nèi)膜外植體和體外Ishikawa細(xì)胞的結(jié)果一致。Flu阻斷了PGR的上調(diào)，表明DHT對(duì)PGR的上調(diào)也部分依賴于AR的介導(dǎo)作用。研究表明，P和PGR的增加能夠有效的減弱子宮收縮，從而減少因子宮過度蠕動(dòng)而引起的子宮內(nèi)膜異位癥，還可促進(jìn)胚胎植入。此外，DHT對(duì)P的調(diào)節(jié)可能是宮內(nèi)腺體形成的一個(gè)重要機(jī)制。這些證據(jù)表明，DHT在子宮中能夠調(diào)節(jié)P合成，進(jìn)而調(diào)控子宮的正常生理環(huán)境。

E也是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)環(huán)境的重要參與者，能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜增殖、分化、脫落和再生周期。DHT影響E的合成，在本試驗(yàn)中，DHT減少P450arom的合成可被Flu阻斷，表明至少部分通過AR介導(dǎo)，E濃度與此結(jié)果一致。研究表明，DHT可以拮抗E誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和蛻膜化。結(jié)合本試驗(yàn)可推測(cè)，DHT和P可能在促進(jìn)子宮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮類似的作用。此外，DHT對(duì)ERα和ERβ有調(diào)控作用，DHT增加了子宮中的ERβ，但降低了ERα的表達(dá)，這與豬的結(jié)果相似。在對(duì)AR和ER的基因分析中顯示，AR和ER可能共享類似的控制基因片段或上游調(diào)節(jié)器或串?dāng)_效應(yīng)。這部分解釋了DHT對(duì)ERβ的促進(jìn)作用，并且DHT也可能通過ERβ介導(dǎo)發(fā)揮作用。此外，DHT增加顆粒細(xì)胞中的ERα和ERβ，但下調(diào)E合成酶P450arom的表達(dá)。結(jié)合本試驗(yàn)，推測(cè)認(rèn)為在子宮中DHT發(fā)揮生物學(xué)功能不僅通過基因組和非基因組途徑，還通過其它途徑。DHT上調(diào)GPER，這種上調(diào)沒有被Flu阻斷，這表明DHT上調(diào)GPER可能不是由AR介導(dǎo)的。

細(xì)胞凋亡受Bcl-2家族和caspase家族調(diào)控。在本試驗(yàn)中，DHT增加了Bax的表達(dá)，降低了Bcl-2的水平，增加了Bax/Bcl-2的比率。這表明DHT促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。在子宮內(nèi)膜基因組分析中，DHT可通過伴侶蛋白HSP105和叉頭框蛋白1促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但在黃體細(xì)胞中，DHT抑制了黃體細(xì)胞凋亡，這種差異可能和參與不同生理功能有關(guān)。在本試驗(yàn)中，DHT還上調(diào)Act-CASP3蛋白和3基因的表達(dá)。而在添加Flu后，Bax、Act-CASP3和3的表達(dá)下調(diào)，表明AR至少部分參與介導(dǎo)。推測(cè)，這種DHT在子宮中促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與防止子宮內(nèi)膜異常增生有關(guān)。有趣的是，在去卵巢小鼠中，DHT增加了子宮重量、子宮內(nèi)膜和子宮肌層的橫截面積。此外，DHT可以恢復(fù)類固醇耗盡的子宮功能。DHT這種促進(jìn)或抑制凋亡的生物學(xué)作用是否與卵巢切除有關(guān)，DHT是否在子宮中部分代替P和E發(fā)揮作用，值得今后進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

DHT的合成和AR的表達(dá)在綿羊子宮的不同階段存在差異。此外，DHT至少部分通過AR調(diào)控P和E合成、受體表達(dá)以及EEC凋亡，并參與子宮生理功能的調(diào)節(jié)。本研究為雄激素參與調(diào)節(jié)子宮功能機(jī)制提供新的數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。