基于WGCNA與GSEA方法挖掘調(diào)控中衛(wèi)山羊羊毛彎曲相關(guān)基因

李曉波，劉占發(fā),劉 悅，陳 倩，馬月輝，趙倩君*，葉紹輝

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 3.寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)山羊保種場，寧夏 755000)

羊毛纖維天然卷曲，其彎曲度可以作為評價羊毛品質(zhì)的依據(jù)。中衛(wèi)山羊是我國珍貴的白色裘皮山羊品種。從1月齡的小羊羔身上取下的毛皮潔白透亮，花紋精美，光澤奪目。羊毛的彎曲表型在生長過程中會逐漸消失，裘皮的經(jīng)濟(jì)價值和美觀度隨著被毛卷曲度的逐漸消失而顯著下降。目前，中衛(wèi)山羊羊毛卷曲隨生長發(fā)生變化的分子機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探索。

毛發(fā)生長主要依賴于毛囊結(jié)構(gòu)干細(xì)胞的發(fā)育，因此毛發(fā)形態(tài)變化取決于毛囊結(jié)構(gòu)生長發(fā)育的狀態(tài)，毛囊是產(chǎn)生毛發(fā)的微型器官，是決定羊毛生長的關(guān)鍵。因此，研究毛囊形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。毛囊是由胚胎時期的上皮細(xì)胞和真皮間充質(zhì)干細(xì)胞及其衍生物通過信號傳遞相互作用形成的。成熟的毛囊包括真皮乳頭、外根鞘、內(nèi)根鞘、毛球、毛干等結(jié)構(gòu)。毛發(fā)表型的形成受到諸多因素影響，細(xì)胞層面的研究認(rèn)為毛發(fā)彎曲的主要原因是毛囊細(xì)胞的不對稱分裂，不對稱的細(xì)胞分裂和細(xì)胞硬化對毛囊底層施加的不同壓力導(dǎo)致毛纖維彎曲。在分子方面研究發(fā)現(xiàn)，71和基因都在內(nèi)根鞘(IRS)編碼蛋白質(zhì)，內(nèi)根鞘是毛囊中的一種剛性結(jié)構(gòu)，通過誘導(dǎo)毛發(fā)的生長影響毛發(fā)的彎曲度。Dickkopf-1(DKK1)是典型的Wnt信號通路的抑制劑，調(diào)節(jié)毛囊的形態(tài)發(fā)生和周期，對1的多態(tài)性和與羊毛表型性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)綿羊1基因組區(qū)域有11個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)，其中9個與羊毛彎曲有關(guān)。通過對胎兒和羔羊皮膚樣本的mRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，有研究發(fā)現(xiàn)了一些與毛囊生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵通路，如WNT、TNF、MAPK信號通路。

既往被毛彎曲轉(zhuǎn)錄組調(diào)控研究主要基于差異基因的GO與KEGG功能富集分析，繼而在調(diào)控通路中挖掘關(guān)鍵基因。本研究基于WGCNA與GSEA的算法對基因測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理從而更有目的性的聚焦于關(guān)鍵的核心基因，對其調(diào)控功能進(jìn)行研究。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)在挖掘與重要性狀及疾病發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程相關(guān)聯(lián)的核心基因中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，相比于傳統(tǒng)算法，它是一種構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)生物學(xué)算法，處理基因的方式更具生物學(xué)意義，該方法通過計算軟閾值對基因進(jìn)行加權(quán)構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)與構(gòu)建表達(dá)矩陣對表達(dá)模式相似的基因進(jìn)行分類，基因被劃分到不同的表達(dá)模塊中通過挖掘模塊中發(fā)揮核心作用的基因，更加高效準(zhǔn)確地為生物學(xué)研究提供靶標(biāo)基因?；蚣母患治?gene set enrichment analysis，GSEA)是針對基因集合而不是單個基因，它可兼顧差異較小的基因而對所有的差異基因進(jìn)行富集，通過對基因集進(jìn)行分析找到與表性差異相關(guān)的基因得到的分析結(jié)果更可靠。本研究主要應(yīng)用這兩種方法對不同時期的中衛(wèi)山羊皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行全面的分析。

關(guān)于動物毛發(fā)彎曲變化相關(guān)的基因及調(diào)控分子機(jī)制的研究報道較少，目前關(guān)于中衛(wèi)山羊羊毛彎曲表型變化的分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在構(gòu)建不同彎曲表型的中衛(wèi)山羊皮膚組織mRNAs表達(dá)譜，鑒定參與毛囊細(xì)胞生長發(fā)育過程的差異表達(dá)的mRNAs，綜合利用WGCNA與GSEA分析方法找到調(diào)控毛發(fā)彎曲的關(guān)鍵基因，本研究為羊毛彎曲的分子機(jī)制解析提供新依據(jù)及新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的中衛(wèi)山羊由寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市中衛(wèi)山羊保種場提供。在整個試驗期間，山羊的飼養(yǎng)條件保持一致。隨機(jī)選擇3只健康、無親緣關(guān)系的羔羊進(jìn)行活體取樣，對同一個體在不同時期進(jìn)行兩次采樣，采樣位置為軸對稱。分別采集45日齡(D45)和365日齡(D365)羔羊皮膚組織，樣品保存在RNAlater中用于后續(xù)測序，每次采樣后均對羊進(jìn)行抗感染治療。

1.2 皮膚組織RNA的提取與測序

將保存在RNAlater試劑中的樣品提取總RNA進(jìn)行測序(RNA-seq)。根據(jù)試劑盒的說明，使用RNasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN，德國)提取6個樣本 (45日齡3個個體，365日齡3個個體)的總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Science，Wilmington，DE，美國)初步測定RNA純度，用Aglient 2100(Agilent Technologies，CA，USA)準(zhǔn)確定量RNA樣品的濃度。用符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA(RNA量>2 μg,濃度 ≥100 ng·μL, RIN ≥7, OD/OD=1.8～2.2, OD/ OD=1.8～2.2) 構(gòu)建文庫?；贗llumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行測序。

1.3 不同時期皮膚組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

利用fastqc 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾得到clean data，并計算Q20、Q30和GC含量。通過軟件TopHat2(v2.2.1)，將clean data與山羊參考基因組(版本：assembly ARS1)進(jìn)行比對。TopHat2可以鑒定外顯子之間的剪接位點，將RNA-seq的reads數(shù)據(jù)map到基因組上。使用Cufflinks軟件的Cuffquant和Cuffnorm組件，通過Mapped Reads在基因上的位置信息，對轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，計算FPKM值。最后，使用CuffCompare將同一組的3個個體進(jìn)行合并，使用Cuffdiff進(jìn)行對比獲得兩個時期之間的差異表達(dá)基因集。

1.4 差異表達(dá)基因功能富集分析

將差異表達(dá)基因的閾值設(shè)置為_value <0.05 和 |logFoldChange| ≥1，篩選表達(dá)差異顯著基因，對其進(jìn)行后續(xù)的分析。利用DAVID和KOBAS在線數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以<0.05為閾值篩選顯著的GO_Term和Pathways。

1.5 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析與Hub基因篩選

應(yīng)用WGCNA R包(v1.70)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)。構(gòu)建了所有差異mRNA的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，利用動態(tài)分割法尋找模塊，并根據(jù)表達(dá)模式將其劃分為不同的模塊。分析不同模塊之間的相關(guān)性，并對所有模塊進(jìn)行聚類。將獲得的同一模塊內(nèi)的表達(dá)模式相同的差異基因進(jìn)行功能富集。參數(shù)設(shè)置如下：CutHeight=0.8，minSize=10，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。將基因劃分為不同模塊后，計算模塊的特征值分析模塊和樣本組間的相關(guān)性。選擇與不同組間相關(guān)性高的模塊作為目標(biāo)模塊；對目標(biāo)模塊中的基因進(jìn)行KEGG富集分析。使用在線工具String(https://cn.string-db.org)，設(shè)置置信度大于0.85基于模塊中差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) (protein-protein interaction network, PPI)。剔除無關(guān)聯(lián)的基因，利用Cytoscape 構(gòu)建核心基因互作網(wǎng)絡(luò)；利用 cytoHubba插件中的MCC算法選擇top10的nodes，得到樞紐基因(hub gene)。

1.6 GSEA分析

本研究應(yīng)用基因集富集分析(GSEA)方法對兩組間基因集合進(jìn)行基因功能富集分析。GSEA是從全體基因的表達(dá)矩陣中找出具有協(xié)同差異 (concordant differences)的基因集，因此能兼顧差異較小的基因。參數(shù)設(shè)置如下：選擇“C2.KEGG通路基因集”作為背景，置換檢驗數(shù)量選擇1 000默認(rèn)值，樣本量較少置換檢驗類型選擇gene_set，基因類型選擇使用基因名，由于本研究樣本數(shù)量為3個以上，設(shè)置的基因排序方法為Signal2 Noise，其他參數(shù)設(shè)置保持為默認(rèn)值。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

選取中衛(wèi)山羊羔羊的兩個生長時期(D45，D365)，每個時期3個樣品，共6個中衛(wèi)山羊肩部皮膚組織樣品進(jìn)行RNA測序。將數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、比對、計數(shù)，每個樣品產(chǎn)生超過12G的原始數(shù)據(jù)，其中Q30數(shù)據(jù)基本都在90% 以上，表明測序數(shù)據(jù)滿足后續(xù)分析的要求。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

為了評估轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，對每個樣本表達(dá)矩陣的FPKM值進(jìn)行了歸一化處理。發(fā)現(xiàn)在6個樣本中，45日齡羔羊皮膚組織的mRNA的表達(dá)量高于356日齡羔羊(圖1A)。這可能與羔羊時期組織器官快速的生長發(fā)育有關(guān)，這一時期體內(nèi)新陳代謝旺盛，基因的表達(dá)相對更為活躍。將-value<0.05，|logFC|≥1作為閾值篩選差異表達(dá)mRNA，45日齡為對照組，365日齡為試驗組進(jìn)行比較，共鑒定出上調(diào)表達(dá)mRNA 812個，下調(diào)表達(dá)mRNA 440個(圖1B)?；趍RNA的FPKM值對兩組差異表達(dá)基因進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖1C)，結(jié)果表明同一群體中的個體表達(dá)模式相似，而不同時期組間的表達(dá)模式差異顯著。

A.個體基因表達(dá)量的箱線圖；B.差異表達(dá)基因的火山圖；C.差異基因聚類圖A. Box diagram of individual gene expression; B. Volcanic map of differentially expressed genes; C. Cluster map of differential genes圖1 不同時期皮膚組織的差異基因的表達(dá)、篩選與聚類結(jié)果Fig.1 Expression, screening and clustering of differential genes in skin tissues at different stages

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

對1 252個差異基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，共富集到119個GO_term，其中包含86個生物學(xué)過程(BP)，20個細(xì)胞組分(CC)，13個生物學(xué)功能(MF)。每個項目中前5條被顯著富集到的GO條目如圖2A所示。在生物學(xué)過程中，差異表達(dá)基因被顯著富集到細(xì)胞粘附(cell adhesion，16個基因)、細(xì)胞表面受體信號通路(cell surface receptor signaling pathway，12個基因)、吞噬(phagocytosis，6個基因)。在細(xì)胞組分當(dāng)中，差異基因顯著富集到細(xì)胞外間隙(extracellular space，60個基因)、細(xì)胞外囊泡 (extracellular exosome，117個基因)。在生物學(xué)功能當(dāng)中，差異基因顯著富集到花生四烯酸結(jié)合(arachidonic acid binding，6個基因)和鈣離子結(jié)合(calcium ion binding，36個基因)。這些富集條目與物質(zhì)代謝和能量循環(huán)過程緊密相關(guān)，表明細(xì)胞生命活動頻繁，毛囊的生長發(fā)育受到這些生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。

圖2 差異基因GO和KEGG富集分析Fig.2 GO and KEGG enrichment analysis of differential genes

KEGG分析結(jié)果顯示，共79條信號通路被顯著富集，圖2B列出了前20個顯著富集的通路。發(fā)現(xiàn)有一些之前的研究中已經(jīng)被報道參與毛囊發(fā)育調(diào)控的通路，其中包含PI3K-Akt signaling pathway、Rap1 signaling pathway、Ras signaling pathway、Wnt signaling pathway、MAPK signaling pathway等。

2.4 差異基因的加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

基于WGCNA方法對D45和D365兩組間的1 252個差異基因進(jìn)行分析。利用 pickSoftThreshold計算軟閾值，在R>0.85條件下， 選擇最佳軟閾值β為22進(jìn)行無尺度網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖3A、3B)。根據(jù)基因表達(dá)特征進(jìn)行聚類劃分模塊，共鑒定出14個模塊(black、blue、brown、cyan、green、greenyellow、magenta、pink、purple、red、salmon、tan、turquoise、yellow)(表1，圖3C)，各模塊包含基因數(shù)量在表1中列出；其中最大的綠松石模塊有306個差異基因，淺橙色模塊中基因數(shù)量最少，僅僅包括7個基因。利用各模塊的特征向量值計算模塊與兩個不同時期羊毛彎曲表型的關(guān)系；其中與D45相關(guān)性(R=0.988，<0.01)最高的模塊為綠松石模塊，與D365相關(guān)性(R=0.922，<0.01)最高的模塊為黃色模塊(圖4A)；將不同模塊進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)綠松石與黃色模塊聚集在不同分支。將這兩個模塊作為目標(biāo)模塊進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 各模塊中基因數(shù)量Table 1 Number of genes in each module

A.軟閾值β計算結(jié)果無尺度網(wǎng)絡(luò)線性模型；B.不同軟閾值對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)連接度；C.基因?qū)蛹壘垲悇澐帜KA. The result of soft threshold β calculation is a scale-free network linear model; B. Network connectivity corresponding to different soft thresholds; C. Gene hierarchical clustering partition module圖3 差異基因加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Weighted co-expression network analysis of differential genes

A.模塊與表型相關(guān)性分析；B.模塊相關(guān)性分析A. Correlation analysis between modules and phenotypes; B. Module correlation analysis圖4 模塊相關(guān)性Fig.4 Module correlation

2.5 目標(biāo)模塊中基因的KEGG分析

對目標(biāo)模塊中的基因進(jìn)行KEGG功能分析，結(jié)果顯示黃色模塊中的基因顯著富集到JAK/STAT signaling pathway、Histidine metabolism、Chemokine signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、beta/Alanine metabolism等通路中；綠松石模塊中基因富集到Wnt signaling pathway、TGF/beta signaling pathway、Biosynthesis of amino acids等通路中(圖5A-B)。其中Jak/STAT、Chemokine、Wnt、TGF/beta通路在調(diào)控毛囊發(fā)育與毛發(fā)表型中被已有的研究多次報道。

A.黃色模塊中基因顯著富集通路;B.綠松石模塊中基因顯著富集通路A. The significant enriched pathways by genes in yellow module; B. The significant enriched pathways by genes in turquoise module圖5 目標(biāo)模塊基因的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of target module genes

2.6 目標(biāo)模塊分子網(wǎng)絡(luò)分析鑒定關(guān)鍵基因

對目標(biāo)模塊中基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)的構(gòu)建，分析蛋白之間的相互作用。黃色模塊中基因獲得18個蛋白質(zhì)節(jié)點，綠松石模塊中基因獲得41個蛋白質(zhì)節(jié)點(圖6A-B)。在Cytoscape 中將結(jié)果導(dǎo)入構(gòu)建核心基因互作網(wǎng)絡(luò)，利用cytoHubba插件中的MCC算法選擇top10的nodes。黃色模塊中得到的10個核心基因為27、7、20、26、1、10、4、、31、2 (圖7A)。綠松石模塊中得到的10個核心基因為71、75、14、78、15、1、2、3、、3 (圖7B)。

A.黃色模塊中基因的PPI網(wǎng)絡(luò)；B.綠松石模塊中基因的PPI網(wǎng)絡(luò)A. PPI network of genes in yellow module; B. PPI network of genes in turquoise module圖6 目標(biāo)模塊基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Target module gene protein interaction network

A.黃色模塊Top10基因；B.綠松石模塊Top10基因。顏色由藍(lán)到紅，紅色越深說明連接度越高A. Top10 genes in yellow module；B. Top10 genes in turquoise module. The color ranges from blue to red, and the darker the red, the higher the connection圖7 目標(biāo)模塊核心基因網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Core genes network of target module

2.7 基因集合富集分析GSEA

利用GSEA方法對兩組樣本的所有基因集進(jìn)行分析。D45樣本中73條通路中的基因表達(dá)上調(diào)，75%的正確率支持其中16條通路的基因上調(diào)，nominal-value<0.05的有17條通路；nominal-value <0.01的有9條通路，其中包括Hedgehog signaling pathway、cell cycle、Proteasome、RNA degradation、TGF/BETA信號通路等。D365樣本中有93條通路中的基因表達(dá)上調(diào)，75%的正確率支持其中30條通路的基因上調(diào)，nominal-value<0.05的有27條通路；nominal-value <0.01的有18條通路，其中包括Cytokine receptor interaction、JAK/STAT signaling pathway、cell adhesion molecules cams等。先前研究顯示，Hedgehog signaling pathway、JAK/STAT signaling pathway、TGF/BETA signaling pathway參與毛囊發(fā)育調(diào)控。Hedgehog signaling pathway中富集到的15個基因在D45中是上調(diào)的；JAK/STAT signaling pathway中富集到的56個基因在D365中是上調(diào)的，且2、7、26、8、11調(diào)控毛囊生長發(fā)育的基因被包含在領(lǐng)頭亞基中，因而推測這些集合中的基因在調(diào)控毛發(fā)彎曲表型變化中發(fā)揮了作用(圖8A、8B)。

圖8 差異基因集合富集分析Hedgehog和JAK/STAT通路結(jié)果Fig.8 Results of Hedgehog and JAK/STAT pathways analysis based on set enrichment of differential genes (GSEA) method

3 討 論

隨著高通量技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，畜禽的組學(xué)數(shù)據(jù)不斷的充分完善，利用更高級的測序手段和生物信息學(xué)手段去解析這些龐大的數(shù)據(jù)集，更有利于深入地探究畜禽重要性狀的分子調(diào)控機(jī)制。中衛(wèi)山羊毛曲度隨生長發(fā)育變化的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。為了探討差異基因?qū)ι窖虿煌L階段毛發(fā)表型變化的潛在影響，本研究構(gòu)建了45日齡和365日齡山羊皮膚組織轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，共篩選到1 252個差異顯著基因，發(fā)現(xiàn)在45日齡皮膚組織中基因總體表達(dá)量高于365日齡。本研究綜合應(yīng)用KEGG、WGCNA和GSEA 多種分析方法，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，將富集到參與毛囊發(fā)育相關(guān)的信號通路和基因集深入解析，進(jìn)一步篩選影響羊毛彎曲表型的關(guān)鍵Hub基因，闡明中衛(wèi)山羊毛發(fā)彎曲的潛在調(diào)控機(jī)制。

WGCNA分析可將表達(dá)模式高度相關(guān)的基因劃分為模塊，通過計算模塊之間的相互關(guān)聯(lián)度以及與外部樣本性狀的關(guān)聯(lián)，篩選出特異性模塊構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)挖掘出關(guān)鍵的核心基因。近年來，WGCNA應(yīng)用最多的是在研究調(diào)控癌癥的關(guān)鍵基因，通過模塊基因的構(gòu)建篩選找到致病的Hub基因，在胃癌、肺癌、葡萄球膜黑色素瘤、腹主動脈瘤、乳腺癌等研究中作為主要分析手段。GSEA分析使用預(yù)設(shè)的基因集，將所有的差異基因根據(jù)程度進(jìn)行排序，然后富集在這個排序的頂端或低端，可篩選到差異表達(dá)不顯著卻有生物學(xué)意義的基因。

毛囊細(xì)胞生長與形態(tài)變化導(dǎo)致羊毛產(chǎn)生彎曲變化。毛囊作為毛發(fā)生長的基本器官，在毛發(fā)生長發(fā)育過程中受到多種信號通路的調(diào)控，決定了毛發(fā)的表型特征。以往的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt、Chemokine、cAMP和RAS和MAPK等信號通路在毛囊發(fā)育中起直接或間接作用。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞遷移分化、毛囊發(fā)育和外胚層胎盤形成導(dǎo)致的皮膚結(jié)構(gòu)差異被Wnt和Hedgehog信號通路為代表的KEGG通路調(diào)控。本研究對1 252個差異顯著的基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示這7條通路均被顯著富集。本研究中，WGCNA 根據(jù)表達(dá)模式將基因劃分在14個模塊，其中與羊毛彎曲表型密切相關(guān)的黃色模塊和綠松石模塊中基因的KEGG結(jié)果顯示，JAK/STAT、Chemokine、Wnt、TGF/beta等通路被顯著富集。毛發(fā)彎曲度的變化可能與這些通路密切相關(guān)。通過對目標(biāo)模塊中基因進(jìn)行分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選出20個關(guān)鍵調(diào)控基因，其中包括27、7、2、1、71等。其中27、7、2與毛囊的生長調(diào)控有關(guān)，其余基因?qū)γl(fā)彎曲度的調(diào)控作用還未見報道?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，皮膚相關(guān)趨化因子27調(diào)控上皮細(xì)胞在控制細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起重要作用，維持毛囊的生長。7是毛囊中的一種細(xì)胞因子，它維持了細(xì)胞的動態(tài)平衡，對皮膚組織至關(guān)重要。作為一個關(guān)鍵因子，2可以調(diào)節(jié)毛囊的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。推測27、7、2這3個基因在調(diào)控中衛(wèi)山羊毛發(fā)彎曲變化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在GSEA富集的通路中，27、7、2分別富集到了Hedgehog signaling pathway和JAK/STAT signaling pathway中。初級纖毛是真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，通過改變信號蛋白的局部濃度和活性來解碼各種信號，Hedgehog信號被激活，控制毛發(fā)發(fā)育的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。JAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT信號在控制毛發(fā)周期中起著重要作用。根據(jù)WGCNA與GSEA分析結(jié)果與文獻(xiàn)報道推斷,27、7、2可能是羊毛產(chǎn)生彎曲的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究構(gòu)建了中衛(wèi)山羊不同彎毛表型皮膚的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)圖譜。在45和365日齡山羊皮膚組織中共鑒定出1 252個差異表達(dá)基因，綜合KEGG、WGCNA和GSEA 多種分析方法篩選到了一系列參與毛囊發(fā)育和羊毛彎曲度的信號通路和基因。本研究結(jié)果可為毛囊發(fā)育和羊毛彎曲機(jī)理的研究提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

中國中衛(wèi)山羊優(yōu)質(zhì)的羔羊羊皮具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。羊皮的品質(zhì)主要受毛發(fā)彎曲度的影響，毛囊的生長發(fā)育對羊毛的曲度起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用RNA測序技術(shù)構(gòu)建了45和365日齡中衛(wèi)山羊mRNA的表達(dá)譜，綜合應(yīng)用WGCNA和GSEA等生物信息學(xué)方法研究了調(diào)控毛發(fā)彎曲度的相關(guān)基因，通過篩選發(fā)現(xiàn)Hedgehog、JAK/STAT等信號通路和27、7、2 等基因在調(diào)控毛囊發(fā)育和羊毛彎曲方面發(fā)揮了重要作用。