豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

鄒本革 ， 張 偉 ， 張瑞華 ， 劉 偉 ， 田 偉

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院 ， 山東 萊陽 265200 ； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamutocida，Pm) 是巴氏桿菌屬中最重要的畜禽致病菌之一，能夠感染人和多種動物的呼吸系統(tǒng)而導(dǎo)致疾病[1]，如牛和羊的支氣管肺炎、家禽的霍亂、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、兔鼻漏等，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也威脅著人類健康[2]。豬多殺性巴氏桿菌病又稱“豬肺疫”或“鎖喉風(fēng)”，是一種急性、熱性傳染病，此病分布廣，常常與豬瘟、豬喘氣病等混合或者繼發(fā)感染，對豬危害很大[3]。

Pm血清型較為復(fù)雜，按照莢膜抗原可分為 A、B、D、E和F共5個血清型，在豬群中以A、B型和D型為主，且其血清型與致病性之間有一定的相關(guān)性[4-5]。如：A型主要引起豬的肺炎，是最常見的血清型；B型主要引起豬的出血性敗血癥；D 型主要引起豬的萎縮性鼻炎[4-6]。目前該病主要通過臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷確診，最終通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA和Pm特異性基因KMT1確定分離菌種屬和莢膜血清型[7-8]。彭忠等[3，6]和席曉劍等[9]發(fā)現(xiàn)我國豬源Pm主要以莢膜A型和D型為主。

山東省某規(guī)?；B(yǎng)豬場年出欄量4 000頭，其中約40頭豬出現(xiàn)體溫升高，咳出帶血絲的膿黏液，呼吸高度困難，食欲廢絕，身體無力，不愿行走，坐姿呈犬樣，不斷咳嗽，排泄物呈水樣，精神焦躁不安，最后虛脫死亡。剖檢病豬可見心包腫大，有大量積液；心肌出血，表面和縱切后都有明顯出血點(diǎn)；胸腔和肺部有粘連，且胸腔積液明顯，肺臟充血、淤血腫大，部分壞死，其他器官眼觀無明顯病變。根據(jù)大體病變觀察初步懷疑為豬Pm感染，為查明病原，本試驗(yàn)對患病豬肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，旨在為Pm引起的豬源疾病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、血平皿、腦心浸液肉湯、細(xì)菌生化鑒定條和藥敏紙片，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色試劑，購自北京索萊寶科技有限公司；TaKaRaExTaq?DNA Polymerase(含dNTP Mixture)、DL2 000 DNA Marker，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫恒濕培養(yǎng)箱和超凈工作臺，均購自濟(jì)南創(chuàng)日新儀器設(shè)備有限公司；基因擴(kuò)增儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司；伯樂凝膠成像系統(tǒng)，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 病料和實(shí)驗(yàn)動物 山東省某規(guī)?；B(yǎng)豬場3月齡發(fā)病豬3頭，體重約35 kg；SPF級昆明小鼠20只，體重約20 g，購自山東省藥物研究所。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的病死豬肺臟內(nèi)容物劃線接種于血平皿上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隨時觀察并記錄菌落形態(tài)；挑取單個菌落在TSB無菌肉湯中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察菌體染色特性及形態(tài)。

1.4.2 生化鑒定 參考細(xì)菌生化鑒定條說明書，將所分離的培養(yǎng)物接種于生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄生化反應(yīng)特性，根據(jù)對照手冊判定反應(yīng)結(jié)果。

1.4.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析 按照參考文獻(xiàn)[7]合成細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，引物的序列信息見表1，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：ExTaq0.25 μL，10×ExTaqBuffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各2 μL，菌液1 μL，最后加ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)。將含有預(yù)期目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。對測序結(jié)果利用NCBI/BLAST在線分析，利用DNAMAN軟件與NCBI中已發(fā)表的基因序列進(jìn)行同源性比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4.4 細(xì)菌種特異性鑒定和莢膜血清型鑒定 參照參考文獻(xiàn)[7]和[10]合成鑒定Pm及其血清型引物，引物的序列信息見表1，引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。應(yīng)用細(xì)菌種鑒定特異性引物和莢膜分型鑒定引物對目的基因進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和程序同1.4.3。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.4.5 動物回歸試驗(yàn) 挑取單個菌落接于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。取20只健康的SPF級小鼠，隨機(jī)分為3個試驗(yàn)組和1個對照組，每組5只。參照曹瑞勇等[11]的方法，對3個試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射0.2 mL含有1×107、1×108和1×109個細(xì)菌的菌液，對照組小鼠注射等體積的TSB液體培養(yǎng)基，逐日觀察小鼠發(fā)病死亡情況。并對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察病變并進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

1.4.6 藥物敏感試驗(yàn) 按陳國權(quán)等[7]的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，取100 μL TSB菌液涂布于TSA血清培養(yǎng)基上，將常用抗菌藥物的藥敏紙片放在TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈是否出現(xiàn)并測定其直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將接種過細(xì)菌的血平皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細(xì)菌在血平皿上生長出灰白色菌落，表面光滑且較為濕潤、邊緣整齊且沒有溶血現(xiàn)象(圖1)。將菌落進(jìn)行革蘭染色，在油鏡下觀察該菌呈紅色、短桿狀、兩端鈍圓，為革蘭陰性菌(圖2)。

圖1 分離菌落形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of isolated colonies

圖2 分離菌革蘭染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of isolated strain (1 000×)

2.2 生化鑒定 生化鑒定結(jié)果顯示，該分離菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸；不發(fā)酵乳糖和麥芽糖；山梨醇、吲哚、氧化酶、肌醇、甘露醇反應(yīng)結(jié)果呈陽性；枸櫞酸鹽、賴氨酸、精氨酸等結(jié)果均為陰性(表2)，與Pm的生化特征相似程度最高。

表2 分離菌的生化鑒定Table 2 Biochemical identification of isolated strain

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列分析 利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行分離菌株16S rRNA基因的菌液PCR，擴(kuò)增出預(yù)期1 420 bp的單一條帶(圖3)。將目標(biāo)片段測序后，通過BLAST工具將其結(jié)果進(jìn)行在線比對，結(jié)果顯示，該序列與GenBank中Pm登錄號分別為MN588317.1、MG597111.1、MN588319.1、MF417604.1、MG859656.1和MG745918.1的核苷酸序列相似程度最高，同源性大于99.9%；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果也表明該菌株為Pm(圖4)。且從3頭病豬分離的細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增序列經(jīng)比對后完全一致，說明為同一株菌，即均為多殺性巴氏桿菌。

圖3 分離菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA gene from isolated strainM: DL2 000 DNA Marker；1～2: PCR產(chǎn)物M: DL2 000 DNA Marker；1-2: PCR products

圖4 分離菌株與參考菌株16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene from isolated and reference strainsPp：變形桿菌； Ec：陰溝腸桿菌； Se：沙門菌； Pm：多殺性巴氏桿菌； Pa：綠膿桿菌Pp:Proteus penneri; Ec:Enterobacter cloacae; Se:Salmonella enteric;Pm:Pasteurella multocida; Pa:Pseudomonas aeruginosa

2.4 細(xì)菌種特異性鑒定和莢膜血清型鑒定 利用鑒定Pm特異引物KMT1T7和KMT1SP6對分離菌進(jìn)行菌液PCR，獲得大小為460 bp的DNA片段(圖5)，與預(yù)期大小相符合。

圖5 分離菌KMT1基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of KMT1 gene from isolated strainM：DL2 000 Marker； 1～2：PCR產(chǎn)物M: DL2 000 DNA Marker； 1-2: PCR products

利用莢膜血清型A、B、D、E型和F型共5對分型引物進(jìn)行菌液PCR，結(jié)果顯示，只有莢膜D型引物獲得預(yù)期650 bp的單一條帶(圖6)，測序后經(jīng)BLAST搜索比對，符合莢膜D型Pm基因序列。

圖6 分離菌莢膜血清型鑒定Fig.6 Capsule serotype identification of isolated strainM：DL2 000 Marker； 1～2：PCR產(chǎn)物M: DL2 000 DNA Marker； 1-2: PCR products

2.5 動物回歸試驗(yàn) 分離菌菌液接種小鼠6 h后，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)運(yùn)動遲緩、食欲不振、呼吸急促、體溫升高、皮膚血斑等癥狀，24 h后全部死亡，對照組小鼠全部正常。無菌采集小鼠肺臟液體接種于TSA血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，鏡檢及菌液KMT1 基因PCR結(jié)果都顯示，試驗(yàn)組小鼠肺臟液體分離菌為Pm，且PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定為豬源Pm莢膜D型(圖7)，而在對照組小鼠肺臟內(nèi)未分離出Pm。

圖7 小鼠肺液分離菌KMT1基因的PCR擴(kuò)增Fig.7 PCR amplification of KMT1 gene from isolated strain in mouse lung fluidM.DL2 000 Marker； 1～15：試驗(yàn)組； 16～20：對照組M:DL2 000 DNA Marker； 1-15:Experimental group; 16-20:Control group

2.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌對頭孢噻吩、頭孢唑啉、多西環(huán)素、安普霉素、慶大霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等14種藥物敏感，對丁胺卡那霉素中度敏感，對氟苯尼考、頭孢唑肟、恩諾沙星、鏈霉素、紅霉素和青霉素等9種藥物耐藥(表3)。

表3 分離菌藥敏試驗(yàn)Table 3 Drug sensitivity test of isolated strain

3 討論

本試驗(yàn)利用細(xì)菌分離法從養(yǎng)豬場3頭病死豬的肺臟中分離出Pm，根據(jù)16S rRNA序列比對證明3頭豬中分離出的Pm為同一株菌；同時分子鑒定中采用菌液作為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省去了細(xì)菌DNA提取的步驟，節(jié)約了試驗(yàn)成本，將鑒定時間縮短至少1 h。目前，雖然Pm的致病機(jī)制尚未完全研究清楚，但莢膜、脂多糖、外膜蛋白及毒素等在該菌致病過程中的作用已逐漸被證實(shí)[4-6]。寧慧波等[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由A型和D型Pm引起的豬萎縮性鼻炎嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。Ujvari等[13]報(bào)道了從患禽霍亂的雞體內(nèi)分離出D型和F型Pm。禽類中通常存在莢膜F型Pm，豬中卻很少見，但有學(xué)者從我國豬的臨床樣本中首次分離出F型Pm，并確定其完整基因組序列，同時利用分離菌株分別對雞和豬進(jìn)行回歸試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌株對雞致病性弱，而對豬致病性很強(qiáng)[14]，這說明同一莢膜血清型Pm對不同宿主的致病性存在很大差異。彭忠等[6]從國內(nèi)不同地區(qū)規(guī)?；i場患有疑似呼吸系統(tǒng)疾病的豬病料中分離出Pm，并對其進(jìn)行血清型分析，結(jié)果顯示，我國豬群中流行的Pm的莢膜血清型為A型占48.85%、D型占42.75%、F型占2.67%。席曉劍等[9]從有肺炎等癥狀豬的肺臟中分離鑒定出142株P(guān)m，其中A型占48.6%；D型占49.3%。而本試驗(yàn)從病死豬的肺臟中僅分離出D型Pm，并且在不同批次和豬舍中同樣檢測到D型Pm，未分離出A型Pm，這與貢嘎等[4]從藏豬病料中分離的Pm血清型一致。動物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌引起小鼠發(fā)病癥狀與送檢病豬相同，且鼠體分離菌株和病豬分離菌株都可以擴(kuò)增出PmKTM1基因特異片段，測序后證實(shí)為相同菌株，最終確診發(fā)病豬肺臟中分離到的D型Pm是強(qiáng)致病株，同時也是送檢病豬的主要病原菌。彭忠等[6]報(bào)道顯示，Pm血清A型菌株毒力普遍較強(qiáng)，而D型毒力普遍較弱，但是A型菌株中也有毒力較弱的菌株。Pm的致病性與其宿主和菌株的毒力密切相關(guān)，是宿主與菌株相互作用的結(jié)果[15]，這可能與豬的生存環(huán)境，或者Pm的脂多糖分型有關(guān)，也有可能與Pm自身是否攜帶exbD、hgbA、hgbB和ompA等毒力基因有關(guān)[3]。

目前，使用抗菌藥物是治療Pm最有效的方法之一，但不同地區(qū)Pm的耐藥性具有一定的地域差異性。貢嘎等[4]對藏豬Pm的藥敏試驗(yàn)表明，該菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、阿莫西林和氨芐西林4種藥物均產(chǎn)生耐藥性，對恩諾沙星和環(huán)丙沙星敏感。曹瑞勇等[11]從黑山羊體內(nèi)分離出的D型Pm對氟苯尼考耐藥。劉海燕等[10]從山羊體內(nèi)分離的6株P(guān)m都對林可霉素和青霉素表現(xiàn)為耐藥，對復(fù)方新諾明和氟苯尼考的敏感性最高。本試驗(yàn)分離到的Pm菌株對氟苯尼考、頭孢唑肟、恩諾沙星耐藥，對安普霉素、慶大霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感性強(qiáng)，與貢嘎等[4]發(fā)現(xiàn)的對恩諾沙星的敏感性有較大差異，而劉杰等[16]研究發(fā)現(xiàn)鴨源A型Pm對恩諾沙星敏感性強(qiáng)，這可能與菌株的分離地區(qū)及動物來源不同等有關(guān)，這說明不同莢膜型的Pm的耐藥敏感性不同，不能交叉用藥。但本試驗(yàn)臨床情況是采用環(huán)丙沙星等敏感性強(qiáng)的藥物進(jìn)行治療，養(yǎng)殖場疫情沒有很好的被控制，筆者認(rèn)為一方面可能是與Pm莢膜血清型不同有關(guān)，另一方面也可能是本試驗(yàn)僅從3頭病豬中分離出相同的Pm，其他病豬是否含有該類型Pm，或者是否含有其他毒株，也可能使治療效果出現(xiàn)差異。劉杰等[16]指出革蘭陰性菌在死亡后會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，對動物內(nèi)臟器官會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，因此在使用環(huán)丙沙星、慶大霉素的過程中可加入黃芪多糖以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，后續(xù)跟蹤發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場的疫情有所緩解，死亡率降低。

本試驗(yàn)中篩選的Pm對小鼠的致病力比較強(qiáng)，且與臨床發(fā)病豬的癥狀比較急吻合，表明分離菌株為強(qiáng)毒株，同時豐富了我國豬源Pm的生物學(xué)特征，為其感染的防控提供了有用的信息。隨著我國對抗菌藥物使用的逐步限制，細(xì)菌病的預(yù)防需要養(yǎng)殖場對致病毒株進(jìn)行了解，難點(diǎn)是不同血清型的毒株基本沒有交叉保護(hù)性，同時對藥物的耐藥性和敏感性差異很大，因此養(yǎng)殖場需要建立完善的監(jiān)控體系，及時更新疫苗毒株。本試驗(yàn)的分離菌株能否作為疫苗研制還需要對其毒力基因和耐藥基因進(jìn)行分析，生產(chǎn)弱毒疫苗是否能夠降低其致毒性還需要進(jìn)一步研究。