貝萊斯芽孢桿菌的生物學(xué)特性研究

寧豫昌 ， 吳祖芳 , 龔 婷

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 ， 浙江 寧波 315832)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)最初由Ruiz-García 等[1]從位于西班牙馬拉加省拖雷德爾馬爾地區(qū)的貝萊斯河流的河口中分離出來(lái)，是芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個(gè)新種。此后，人們陸續(xù)從水、土壤、動(dòng)物腸道、發(fā)酵食品等處分離得到該菌種[2-3]，并發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，具有良好的生物學(xué)功能，尤其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治植物真菌病害方面具有重要作用。例如，貝萊斯芽孢桿菌FKM10 被證實(shí)可以通過增加生物量、促進(jìn)養(yǎng)分吸收、改善土壤肥力、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等促進(jìn)湖北海棠的生長(zhǎng)[4]。多花黃精內(nèi)生貝萊斯芽胞桿菌ZJU-3發(fā)酵液中的脂肽粗提物可明顯抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到51.6%，并且該菌株還可產(chǎn)生吲哚乙酸、激動(dòng)素、玉米素、赤霉素等多種植物激素[5]。Kim等[6]將貝萊斯芽孢桿菌AK-0與商品化配方共同配制，可在田間條件下有效防制蘋果炭疽病。

已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有作為人類或畜禽用益生菌的潛在開發(fā)價(jià)值。如，Bampidis等[7]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌NRRL B-67257無(wú)耐藥性基因、毒力基因以及產(chǎn)生氨基糖苷的能力，作為食品添加劑是安全的。唐萍等[8]通過小鼠試驗(yàn)證明，貝萊斯芽孢桿菌DJB5具有較高的生物安全性。此外，通過基因組挖掘發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌化合物，如桿菌素、表面蛋白活性劑、蜂毒素、淀粉環(huán)素和羊毛硫菌素等[9]。然而，目前貝萊斯芽孢桿菌的研究與應(yīng)用仍是以生防細(xì)菌和微生物菌肥為主，關(guān)于該菌種益生性能的研究尚不多見。本實(shí)驗(yàn)室前期由鳀魚自然發(fā)酵液中篩選到1株貝萊斯芽孢桿菌，將其命名為SW5菌株，研究表明，該菌株在高滲透壓環(huán)境下能夠高效地水解魚蛋白[10]。本試驗(yàn)以該菌株為研究對(duì)象，對(duì)其在高濃度膽鹽、高溫、模擬胃液、模擬腸液下的芽孢存活率，產(chǎn)胞外水解酶的能力，對(duì)細(xì)菌的抑制能力，以及對(duì)常用抗生素的敏感性等進(jìn)行了測(cè)試。初步判斷貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株在不良環(huán)境條件下具有良好的生長(zhǎng)性能，能夠產(chǎn)生多種水解酶，且具有良好的抑菌能力和抗生素敏感性，為今后將貝萊斯芽孢桿菌作為新型益生菌開發(fā)的候選菌種提供了參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用菌株 試驗(yàn)用貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，由寧波大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。大腸埃希菌(GDMCC 1.1478)、金黃色葡萄球菌(GDMCC 1.142)、蠟樣芽孢桿菌(GDMCC 802269)、枯草芽孢桿菌(GDMCC 1.255)和腸沙門菌(GDMCC 801272)，均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑 青霉素藥敏片(10 μg/片)、頭孢拉定藥敏片(30 μg/片)、鏈霉素藥敏片(10 μg/片)、新霉素藥敏片(30 μg/片)、氯霉素藥敏片(30 μg/片)、紅霉素藥敏片(15 μg/片)、四環(huán)素藥敏片(30 μg/片)、多西環(huán)素藥敏片(30 μg/片)、阿米卡星藥敏片(30 μg/片) 和甲硝唑藥敏片(5 μg/片)，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；胃蛋白酶(≥250 N.F.U/mg)、胰蛋白酶(250 N.F.U/mg)、可溶性淀粉、酪蛋白、β-葡聚糖(酵母，水溶，HPLC≥80.0%)，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)，購(gòu)自上海浦東化學(xué)品有限公司；牛膽鹽、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑，均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配方 NB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉(NaCl)5.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH (7.0±0.2)。淀粉-NA培養(yǎng)基：可溶性淀粉4.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏 5.0 g、磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH (7.0±0.2)。三丁酸甘油酯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、 NaCl 10 g、三丁酸甘油酯 2 mL、蒸餾水1 000 mL、 pH (7.0±0.2)。CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g、硫酸鎂(MgSO4) 0.25 g、CMC-Na 2.0 g、剛果紅0.2 g、蛋白胨2.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH (7.0±0.2)。TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH (7.0±0.2),以上均為液體培養(yǎng)基，相應(yīng)固體培養(yǎng)基只需在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加16 g/L的瓊脂粉。

1.4 菌株耐受性試驗(yàn)

1.4.1 芽孢懸浮液的制備 活化2次后的貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株接種于NB培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min 下振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)液置于80 ℃恒溫水浴中保溫15 min，8 000 r/min離心10 min后棄去上清液，菌體沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，最后復(fù)溶于與初始培養(yǎng)基等體積的無(wú)菌生理鹽水，即為芽孢懸浮液。

1.4.2 膽鹽耐受試驗(yàn) 在無(wú)菌生理鹽水中加入牛膽鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，分裝于100 mL三角瓶，每瓶30 mL，121 ℃滅菌30 min。將芽孢懸浮液以10%接種于新鮮NB培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 下振蕩培養(yǎng)3 h，分別在培養(yǎng)的第0小時(shí)和第3小時(shí)取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢存活率[11]，后續(xù)試驗(yàn)中芽孢存活率的測(cè)定方法均相同。

1.4.3 模擬胃液耐受試驗(yàn) 用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)生理鹽水pH至3.0，121 ℃滅菌15 min后，冷卻至50 ℃以下，無(wú)菌添加胃蛋白酶，分別配制成胃蛋白酶含量為2.5、5.0 mg/mL和10.0 mg/mL的模擬胃液。將芽孢懸浮液以10%接入模擬胃液中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 h，分別在培養(yǎng)的第0小時(shí)和第3小時(shí)取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢存活率。

1.4.4 模擬腸液耐受試驗(yàn) 取KH2PO40.68 g加水100 mL溶解，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH至6.8，121 ℃滅菌15 min，冷卻至50 ℃以下，無(wú)菌添加胰蛋白酶，分別配制成胰蛋白酶含量為2.5、5.0 mg/mL和10.0 mg/mL的模擬腸液。將芽孢懸浮液以10%接入模擬腸液中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 h，分別在培養(yǎng)的第0小時(shí)和第3小時(shí)取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢存活率。

1.4.5 高溫耐受試驗(yàn) 將芽孢懸浮液分別置于60、65、70、75、80、85、90、95 ℃和100 ℃的水浴中保溫30 min，迅速用冷水冷卻后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定不同保溫條件下懸浮液的芽孢存活率。

1.5 產(chǎn)水解酶試驗(yàn) 將SW5菌株的種子液分別點(diǎn)種在酪蛋白固體培養(yǎng)基(在NB固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1%的酪蛋白)、淀粉-NA 固體培養(yǎng)基和CMC-Na剛果紅固體培養(yǎng)基表面，以無(wú)菌操作將種子液劃線接種于三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基表面，所有培養(yǎng)基于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，通過直接觀察固體培養(yǎng)基上的菌落周圍是否形成水解圈判斷菌株是否產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶；取出淀粉-NA 固體平板并將0.04 g碘輕灑在培養(yǎng)皿蓋上后，將培養(yǎng)皿底部倒置在培養(yǎng)皿蓋上碘熏1 min，通過觀察菌落周圍是否形成淀粉水解圈判斷菌株是否產(chǎn)生淀粉酶。將種子液以5%的比例分別接種于酪蛋白液體培養(yǎng)基、淀粉-NA液體培養(yǎng)基、不含剛果紅的CMC-Na液體培養(yǎng)基以及添加橄欖油(10 mL/L) 的NB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，然后將各發(fā)酵液在4 ℃進(jìn)行離心(8 000 r/min、5 min)，收集上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即為待測(cè)粗酶液，分別檢測(cè)各粗酶液中的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶的活力。其中，粗酶液中蛋白酶活力的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[12]的方法，蛋白酶活力定義：40 ℃和pH 7.2條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)分解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個(gè)蛋白酶的酶活力單位(U/mL)；參照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行粗酶液中淀粉酶活力的測(cè)定，淀粉酶活力定義：40 ℃和pH 7.2條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)液化1 mg可溶性淀粉，即為1個(gè)淀粉酶的酶活力單位(U/mL)；參照參考文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定粗酶液中纖維素酶的活力，纖維素酶活力定義：40 ℃和pH 7.2條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素產(chǎn)生1 μg葡萄糖，即為1個(gè)纖維素酶的酶活力單位(U/mL)； 參照參考文獻(xiàn)[15]的方法對(duì)粗酶液中脂肪酶的活力進(jìn)行測(cè)定，脂肪酶活力定義：40 ℃和pH 7.2條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)脂肪酶的酶活力單位(U/mL)。

1.6 抑菌試驗(yàn) 將貝萊斯芽孢桿菌SW5、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和腸沙門菌菌株，分別以5%的接種量同時(shí)接種于10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸沙門菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)物用無(wú)菌水分別稀釋1 000倍后，各吸取0.1 mL至TSB固體培養(yǎng)基表面，并涂布均勻。SW5菌株的液體培養(yǎng)物在4 ℃、8 000 r/min離心5 min，分別收集發(fā)酵上清液和菌體沉淀(菌體沉淀再用適量無(wú)菌生理鹽水懸浮)。在涂布有大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和腸沙門菌的固體平板表面分別放置3個(gè)經(jīng)過滅菌處理并干燥的牛津杯，用移液槍吸取SW5菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵液上清、菌體沉淀，加到牛津杯中，每個(gè)牛津杯中加200 μL， 靜置30 min后，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，然后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 抗生素敏感試驗(yàn) 將貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株種子液接種于NB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，然后將0.1 mL的SW5菌株發(fā)酵液加入到15 mL冷卻至50 ℃的滅菌NB固體培養(yǎng)基，并充分混勻?；靹蚝蟮腘B固體培養(yǎng)基立即傾倒入滅菌培養(yǎng)皿，冷卻至完全凝固。將含有定量抗生素的各個(gè)藥敏紙片和空白紙片分別放置在固體培養(yǎng)基表面，在37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h后，測(cè)量各藥敏片的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 膽鹽耐受試驗(yàn) 膽鹽濃度對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株芽孢存活率的影響結(jié)果見圖1。隨著膽鹽濃度逐漸由0.05%提高至0.30%，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢存活率逐漸由92.94%下降至65.19%。說明膽鹽可降低貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株芽孢的存活率，但同時(shí)也說明，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢對(duì)膽鹽具有較好的抵抗能力。此外，由圖1可知，當(dāng)膽鹽濃度為0.25%和0.30%時(shí)，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢存活率分別為65.54%和65.19%，說明當(dāng)膽鹽濃度由0.25%提高至0.30%時(shí)，對(duì)該菌株芽孢的存活率無(wú)明顯的影響。

圖1 膽鹽濃度對(duì)貝萊斯芽孢桿菌芽孢存活率的影響Fig.1 Effect of bile salt concentration on the survival rate of Bacillus velezensis spores

2.2 模擬胃液和模擬腸液耐受試驗(yàn) 模擬胃液和模擬腸液對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株芽孢存活率的影響結(jié)果如表1和表2所示，在胃蛋白酶含量分別為2.5、5.0 mg/mL和10.0 mg/mL的模擬胃液中處理3 h后，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢存活率分別為84.03%、75.48%和51.99%，而在胰蛋白酶含量分別為2.5、5.0 mg/mL和10.0 mg/mL的模擬腸液中處理3 h后，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢存活率分別為68.06%、46.87%和31.91%。說明貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢無(wú)論對(duì)模擬胃液還是模擬腸液，都具有較好的耐受能力，該菌株芽孢能夠經(jīng)受胃腸道消化液的抑制而發(fā)揮作用。

表1 模擬胃液對(duì)貝萊斯芽孢桿菌芽孢存活率的影響Table 1 Effect of simulated gastric juice on the survival rate of Bacillus velezensis spores

表2 模擬腸液對(duì)貝萊斯芽孢桿菌芽孢存活率的影響Table 2 Effect of simulated intestinal juice on the survival rate of Bacillus velezensis spores

2.3 高溫耐受試驗(yàn) 在不同高溫條件下處理30 min 后，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢存活率結(jié)果如圖2所示，在60～80 ℃條件下，芽孢存活率由99.3%下降至93.5%，但均維持了90%以上的存活率，而從85～100 ℃時(shí)，芽孢存活率由72.8%快速下降至9.4%。說明80 ℃以下的高溫處理對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的芽孢存活率無(wú)明顯影響。因此，該菌株芽孢在實(shí)際加工生產(chǎn)中能夠很好地抵御80 ℃以下的高溫條件，甚至在85 ℃的高溫條件下，其芽孢存活率仍能維持在70%以上。

圖2 溫度對(duì)貝萊斯芽孢桿菌芽孢存活率的影響Fig.2 Effect of temperature on the survival rate of Bacillus velezensis spores

2.4 產(chǎn)水解酶試驗(yàn) 貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株產(chǎn)水解酶的選擇性平板定性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，該菌株在蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的選擇性平板上均可形成明顯的水解圈。對(duì)該菌株發(fā)酵上清液分別進(jìn)行上述4種水解酶的活力測(cè)定，結(jié)果如圖4所示，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的活力分別為53.90、10.30、67.80 U/mL和23.24 U/mL。

圖3 貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)水解酶試驗(yàn)Fig.3 Hydrolase production test of Bacillus velezensisA：蛋白酶選擇性平板； B：脂肪酶選擇性平板； C：淀粉酶選擇性平板； D：纖維素酶選擇性平板A:Protease selective plate; B:Lipase selective plate; C:Amylase selective plate; D:Cellulase selective plate

圖4 貝萊斯芽孢桿菌胞外水解酶活力Fig.4 Activity of extracellular hydrolase from Bacillus velezensis

2.5 抑菌試驗(yàn) 貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)幾種常見細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的菌體懸浮液對(duì)所有抑制對(duì)象均無(wú)抑菌能力，而其發(fā)酵液和發(fā)酵上清液則對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、腸沙門菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均具有抑制能力，其中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng)，其次是大腸埃希菌。因此，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌均具有抑制作用，并且對(duì)腸沙門菌、銅綠假單胞菌等都具有抑菌能力，因此，可考慮將貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株應(yīng)用于食品或飼料的防腐。

表3 貝萊斯芽孢桿菌抑菌試驗(yàn)Table 3 Antibacterial test of Bacillus velezensis

2.6 抗生素敏感試驗(yàn) 本試驗(yàn)選擇了青霉素、四環(huán)素、新霉素、氯霉素和鏈霉素等10種常見的抗生素藥敏片對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試。結(jié)果如圖5和表4所示，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)上述10種抗生素均敏感，其中對(duì)鏈霉素的敏感性最強(qiáng)，鏈霉素對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)36 mm。因此，推測(cè)貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株未攜帶抗生素抗性基因，因此貝萊斯芽孢桿菌在實(shí)際應(yīng)用中可以較好地避免抗藥基因的轉(zhuǎn)移，具有良好的生物安全性。

表4 不同抗生素對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibition zone of different antibiotics on Bacillus velezensis

圖5 貝萊斯芽孢桿菌的抗生素敏感性Fig.5 Sensitivity of Bacillus velezensis to antibiotics1～4:分別為青霉素、四環(huán)素、新霉素和甲硝唑； 5～8：分別為氯霉素、鏈霉素、多西環(huán)素和紅霉素； 9～10：分別為頭孢拉定和阿米卡星1-4:Penicillin,tetracycline,neomycin and metronidazol, respectively; 5-8:Chloramphenicol,streptomycin,doxycycline and erythromycin,respectively； 9-10:Cefradine and amikacin,respectively

3 討論

益生菌通過動(dòng)物胃腸道時(shí)會(huì)受到多種消化酶的抑制，從而降低益生菌的存活率，其中胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)益生菌的影響最為顯著[16]。白聰豪等[17]研究顯示，在胃蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的模擬胃液中處理3 h后，保加利亞乳桿菌的存活率下降至46.34%。焦苗苗等[18]研究了納豆芽孢桿菌在胃腸道環(huán)境下的抗逆性，結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌在人工胃液中作用1～2 h時(shí)，活菌數(shù)下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)。益生菌在腸道中需至少保持106CFU/mL的活菌數(shù)時(shí)方能較好地發(fā)揮其益生作用[19]。在本試驗(yàn)中，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢在含有不同質(zhì)量濃度胃蛋白酶和胰蛋白酶的模擬胃液和模擬腸液中處理3 h后，其菌落形成單位數(shù)均始終維持在108CFU/mL以上，顯示了其良好的耐消化酶特性。膽鹽是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽，它是膽汁中參與脂肪消化和吸收的主要成分，同時(shí)還可對(duì)穿過腸道的外源微生物發(fā)揮抑制作用。膽鹽具有兩親性，一方面對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜具有較高的親和力，另一方面通過發(fā)揮其表面活性劑作用，破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[20]。因此，能否抵抗一定濃度的膽鹽，同樣是選擇益生菌的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物腸道消化液中膽鹽的質(zhì)量濃度通常為0.03%～0.30%，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株的芽孢在0.30%的膽鹽溶液中處理3 h后，其存活率仍可達(dá)到65.19%，顯示了其對(duì)膽鹽較強(qiáng)的抵抗力。駱海龍等[21]對(duì)細(xì)菌適應(yīng)膽鹽脅迫的機(jī)制進(jìn)行了綜述，認(rèn)為細(xì)菌可通過形成生物膜、修復(fù)受損的蛋白質(zhì)、調(diào)整能量代謝途徑與方式、修復(fù)與維持細(xì)胞膜完整性，利用特定的泵出系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的膽鹽成分排至胞外等產(chǎn)生對(duì)膽鹽的抵抗能力。細(xì)菌芽孢較營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐熱性，因此，芽孢桿菌類益生菌的芽孢?？赡褪茌^高的飼料加工溫度。目前，飼料加工的常見溫度是85 ℃ 左右，本試驗(yàn)中，貝萊斯芽孢桿菌的芽孢在85 ℃ 下處理30 min后，其存活率仍可保持在72.8%。劉超齊等[22]研究表明，枯草芽孢桿菌在80 ℃下處理30 min后，其存活率只有對(duì)照組的29%，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃，其存活率幾乎為0，而在本試驗(yàn)中，芽孢存活率在100 ℃時(shí)仍能維持9.4%，推測(cè)是因?yàn)榍罢咴囼?yàn)中所采用的試驗(yàn)對(duì)象以營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為主，而本試驗(yàn)中所采用的則是細(xì)菌芽孢，芽孢的耐熱性本就顯著大于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，而芽孢桿菌類益生菌在加工和使用過程中，通常是以其芽孢為對(duì)象的。已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌作為益生菌可增強(qiáng)羅非魚對(duì)病原菌的抵抗力，改善豬糞便菌群結(jié)構(gòu)等[23-24]，但是目前關(guān)于該菌種對(duì)胃腸道消化環(huán)境和高溫的耐受能力尚未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌芽孢對(duì)模擬胃液、模擬腸液、高濃度膽鹽、高溫等環(huán)境均具有良好的抵抗能力，既可抵御較高的加工溫度，又能以較高的存活率通過胃腸消化道。

通常，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種水解酶類，當(dāng)它們?cè)谀c道定植后，通過分泌的各類水解酶幫助宿主消化吸收，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。竇春萌等[25]從凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)篩選到11株芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)它們均有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力。Lin等[26]以產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等多種水解酶的枯草芽孢桿菌對(duì)牛蛙進(jìn)行添加飼喂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)、鈣和磷的表觀消化系數(shù)顯著提高?？讘c娟等[27]的研究表明，日糧添加0.5×106CFU/g枯草芽孢桿菌和0.5×107CFU/g乳桿菌可以提高斷奶仔兔腸道有益菌群數(shù)量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、盲腸發(fā)酵、飼料效率和生長(zhǎng)性能。目前已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶等[28-29]。本試驗(yàn)中的定性和定量測(cè)定結(jié)果均表明貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，其發(fā)酵上清液中上述4種粗酶活力分別為67.80、53.90、23.24 U/mL和10.30 U/mL，這與前人的研究結(jié)果相符。說明貝萊斯芽孢桿菌作為益生菌應(yīng)用，將有望促進(jìn)飼料中多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料的消化利用率。

2002年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織(Worl Health Organization,WHO) 公布的《食品益生菌評(píng)價(jià)指南》中提出，益生菌代謝產(chǎn)物要有有效的抑菌活性[30]。目前，關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌對(duì)病原微生物拮抗能力的報(bào)道，多數(shù)是以真菌作為拮抗對(duì)象，關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌抑制細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道尚不多見。張海林等[31]的研究表明，貝萊斯芽孢桿菌PL-2菌株可產(chǎn)生一種分子量大約10 kDa的細(xì)菌素，該細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀菌具有較好的抑制活性，而對(duì)大腸埃希菌則無(wú)抑菌活性。本試驗(yàn)結(jié)果則顯示，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、腸沙門菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均具有抑制能力，這與張海林等[31]的研究結(jié)果有一定出入，或許是貝萊斯芽孢桿菌不同來(lái)源菌株之間的遺傳差異所造成的，也可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)與張海林等[31]的研究中所使用的大腸埃希菌的菌株差異造成的。但是，本試驗(yàn)和張海林等[31]的研究結(jié)果均表明，貝萊斯芽孢桿菌具有對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑制能力。

優(yōu)良的益生菌還應(yīng)具有較好的生物安全性，例如不攜帶抗生素的抗性基因。本試驗(yàn)測(cè)試了貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)10種常見抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，該菌株對(duì)青霉素、四環(huán)素、新霉素、氯霉素、鏈霉素等10種常見的抗生素均敏感，因此，推測(cè)貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株不存在抗生素抗性基因擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。高艷俠[23]研究表明，分離自健康羅非魚腸道的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)青霉素等27種抗生素敏感，僅對(duì)桿菌肽耐藥。張小波等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，分離自發(fā)病花邊鴨內(nèi)臟的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)紅霉素等18種常見抗生素敏感，對(duì)多黏菌素B、苯唑西林、氨芐西林、頭孢他啶、青霉素、羧芐西林6種抗生素耐藥。推測(cè)不同的貝萊斯芽孢桿菌菌株在抗生素敏感性方面的差異，可能與其不同的分離來(lái)源有關(guān)，這尚需更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。

綜上，貝萊斯芽孢桿菌的芽孢在高溫、高濃度膽鹽、模擬胃液和模擬腸液等不良環(huán)境下具有較高的存活率，因此推測(cè)可以在加工和使用過程中經(jīng)受各種極端環(huán)境的壓力，從而以較高的存活率到達(dá)腸道定植。定性和定量試驗(yàn)結(jié)果均表明，貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等多種水解酶，在使用中有望促進(jìn)飼料在腸道中的消化和吸收。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等多種革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌具有拮抗能力。抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)多種常見抗生素均敏感，具有良好的生物安全性。因此，貝萊斯芽孢桿菌具有良好的益生特性，值得作為益生菌候選菌種加以進(jìn)一步的深入研究。