紫外指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)黃精基原植物的鑒別

杜澤飛，張 霞，溫 翔，段寶忠

(1. 個(gè)舊市人民醫(yī)院藥劑科，云南 紅河 661000；2. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000)

黃精為大宗中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為2020版《中國(guó)藥典》收載品種，其法定基原為多花黃精(Polygonatum cyrtonema)、滇黃精(P.kingianum)、黃精(P. sibiricum)的干燥根莖，具有潤(rùn)肺滋陰、補(bǔ)脾益氣、補(bǔ)腎益精之功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精主要含有多糖、皂苷類和黃酮類等成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2]，是天然的保健食品，兼具食藥用價(jià)值。黃精種類分布廣泛，受地理、環(huán)境等因素影響，不同基原黃精的化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、藥效等不盡相同[3—6]，對(duì)其進(jìn)行鑒別分類是后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。但不同基原黃精形態(tài)較為相似，不易準(zhǔn)確鑒別[7—8]。

常用的中藥材鑒別方法有形態(tài)鑒別、顯微鑒別、DNA 分子鑒別、色譜鑒別等[9—10]，其中光譜鑒別具有穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，且光譜技術(shù)愈發(fā)成熟，已廣泛用于植物分類和中藥材種類鑒別[11—13]。不同物質(zhì)體系成分的不飽和程度不同，紫外指紋圖譜技術(shù)中的紫外吸收光譜曲線峰形、峰高、峰面積等均有一定的差異[14]。通過(guò)比較圖譜不同吸收峰的差異，可對(duì)藥材種類快速簡(jiǎn)便區(qū)分[15]，如中藥?kù)`芝及其偽品的有效鑒別[16]、不同產(chǎn)地的中藥三七鑒別[17]、不同產(chǎn)地和種類的牛肝菌鑒別[18—20]。目前，尚未見(jiàn)黃精法定基原植物的紫外光譜鑒別研究。本研究對(duì)3種法定基原黃精進(jìn)行紫外光譜分析，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)，包括主成分(PCA)和系統(tǒng)聚類分析(HCA)快速鑒別黃精基原種，為黃精臨床應(yīng)用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供借鑒。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器試劑

UV-9000型紫外可見(jiàn)分光光度儀(上海元析儀器有限公司)、AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、高溫干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)、中藥粉碎機(jī)(佛山市德瑪仕網(wǎng)絡(luò)科技有限公司)、超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技有限公司)、100目不銹鋼篩(寧波新芝生物科技有限公司)。氫氧化鈉、甲醇、無(wú)水乙醇均為分析純，水為超純水。

1.2 材料

藥材樣品采購(gòu)于云南、安徽等地(表1)，經(jīng)大理大學(xué)段寶忠教授鑒定為百合科黃精屬植物黃精(S1～S9)、滇黃精(S10～S21)和多花黃精(S22～S33)的新鮮根莖，所有樣品干燥后粉碎，備用。

2 方法

2.1 黃精紫外光譜測(cè)試液制備

黃精樣品粉碎過(guò)100目篩備用。稱取0.30 g樣品置于 10 mL無(wú)水乙醇溶液中，室溫下超聲提取30 min，過(guò)濾得黃精紫外光譜測(cè)試液。

2.2 黃精紫外光譜測(cè)定

測(cè)定波長(zhǎng)190～400 nm，狹縫1.0 nm，采樣間隔0.2 nm，重復(fù)3次。以無(wú)水乙醇作為參比液和測(cè)試液進(jìn)行基線校正及空白測(cè)定。

2.3 黃精樣品提取條件單因素實(shí)驗(yàn)[18—20]

2.3.1 提取溶劑

隨機(jī)選取S1樣品，準(zhǔn)確稱取0.10 g樣品于10 mL具塞試管中，分別加入蒸餾水、無(wú)水乙醇、甲醇和0.5 mol·L-1氫氧化鈉各10 mL，每組平行3次；超聲提取30 min，過(guò)濾，以對(duì)應(yīng)的溶劑為參比液，測(cè)定紫外光譜，根據(jù)吸收峰數(shù)確定最佳提取溶劑。

2.3.2 提取時(shí)間

稱取S1樣品0.10 g，加10 mL無(wú)水乙醇，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，以溶劑為參比液，掃描紫外光譜，根據(jù)吸收峰數(shù)確定適宜提取時(shí)間。

2.3.3 提取用量

稱取S1樣品0.10、0.15、0.2、0.25、0.3 g，分別加入10 mL無(wú)水乙醇，超聲提取30 min。以溶劑為參比液，測(cè)定紫外光譜，根據(jù)吸收峰數(shù)確定最佳樣品用量。

2.4 方法學(xué)考查

2.4.1 精密度

稱取S1樣品0.3 g樣品1份，按照2.2的方法重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)(210 nm)處的變異系數(shù)RSD(%)，考查精密度。

2.4.2 重復(fù)性

稱取S1樣品6份，每份0.3 g，按照2.2的方法測(cè)定，計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)(210 nm)處的變異系數(shù)RSD(%)，考查重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性

稱取S1樣品0.3 g，按照2.1的方法提取，分別在放置1、5、10、20、30 h時(shí)測(cè)定紫外光譜，計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)(210 nm)處的變異系數(shù)RSD(%)，考查穩(wěn)定性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

取波長(zhǎng)190～450 nm范圍內(nèi)的紫外光譜數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)置后用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析與主成分分析，直觀表征不同基原黃精樣品間的相似性。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃精特征成分提取條件的優(yōu)化

3.1.1 最優(yōu)提取溶劑

圖1A為相同條件下不同溶劑提取樣品S1的紫外指紋圖譜，根據(jù)圖譜吸收峰數(shù)確定不同溶劑對(duì)黃精提取率的影響。結(jié)果顯示，相同條件下蒸餾水、甲醇和 0.5 mol·L-1氫氧化鈉提取液有 1～3個(gè)吸收峰；無(wú)水乙醇提取液在190～300 nm波長(zhǎng)范圍有明顯的紫外吸收峰，共有5個(gè)吸收峰，吸收峰數(shù)目較多。因此，用無(wú)水乙醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取條件下黃精樣品紫外指紋圖譜Fig. 1 UV fingerprint of polygonatum samples under different extraction conditions

3.1.2 最佳提取時(shí)間

以無(wú)水乙醇作為提取溶劑，考查不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。從圖1B可看出，提取20 min時(shí)，黃精樣品提取液的紫外吸收峰較少，只有5個(gè)，集中在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)；當(dāng)提取30 min時(shí)，吸收峰數(shù)目較多，共8個(gè)；當(dāng)提取60 min時(shí)吸收峰數(shù)目沒(méi)有明顯變化。故提取時(shí)間30 min較宜。

3.1.3 最適稱樣量

以無(wú)水乙醇為提取溶劑，研究不同稱樣量對(duì)黃精紫外光譜的影響。結(jié)果表明，黃精樣品取0.1 g時(shí)，提取液的紫外吸收峰較少，只有3個(gè)吸收峰；當(dāng)用量為0.3 g時(shí)，吸收峰較多，共7個(gè)(圖1C)。故樣品用量取0.3 g較好。

3.2 試驗(yàn)方法考查

黃精樣品無(wú)水乙醇提取液的紫外光譜的重復(fù)性變異系數(shù)RSD在0.03%～0.63%之間，精密度的變異系數(shù)RSD介于0.00～2.87%之間，30 h內(nèi)穩(wěn)定性的變異系數(shù)RSD在0.04%～1.73%之間，表明該方法精密度高、重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可靠。

3.3 黃精紫外指紋圖譜對(duì)比分析

圖2為不同種類黃精的紫外指紋圖譜，圖2A為3種黃精平均紫外光譜圖，圖2B為3種黃精一階倒數(shù)處理紫外光譜圖。由圖2A可以看出，不同種類黃精的紫外指紋圖譜在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)主要紫外吸收峰出現(xiàn)的位置基本一致，如210 nm、280 nm等處是黃精樣品的共有峰，表明不同基原黃精主要化學(xué)組分相似；但不同樣品的吸光度差異較為明顯，如多花黃精在210 nm和281 nm 等處的吸光度較高，吸光度值分別為2.74和1.24，而黃精在這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度為2.72和0.92，滇黃精則為2.50和0.80(圖2A)，多花黃精、黃精、滇黃精的吸光度A210: A281分別為2.21、2.95、3.13，滇黃精的吸光度比值最大，而多花黃精的吸光度比值最小，不同黃精樣品表現(xiàn)出指紋性和特征性，表明3種黃精化學(xué)成分的含量存在一定的差異，這可能是因種類、產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致的成分含量或化學(xué)成分構(gòu)型種間差異。由圖2B可以看出，黃精和多花黃精在210 nm處有吸收峰，且黃精的吸收峰較強(qiáng)，但滇黃精在此附近無(wú)吸收峰，在220 nm與280 nm附近多花黃精的吸收較強(qiáng)。因此，利用紫外波長(zhǎng)210 nm、220 nm、280 nm吸收區(qū)域或不同波長(zhǎng)下吸光度值的比值可進(jìn)行黃精基原植物鑒別。

圖2 黃精樣品紫外指紋圖譜Fig. 2 UV fingerprint of three Polygonatum species

3.4 HCA分析

采用平方歐式距離，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析(HCA)中的Ward聚類法對(duì)3種基原黃精進(jìn)行分析(圖3)。33批黃精藥材在分類距離為25時(shí)，被分為兩大類，Ⅰ類包括12批滇黃精樣品(S10～S21)，Ⅱ類包括9批黃精和11批多花黃精。滇黃精聚為一支，與黃精和多花黃精明顯區(qū)分。根據(jù)聚類分析，滇黃精和其他兩種黃精的化學(xué)成分存在顯著差異。而黃精和多花黃精具有相似的化學(xué)成分，無(wú)法通過(guò)聚類分析進(jìn)行區(qū)分。

圖3 33批黃精樣品HCA樹(shù)狀圖Fig. 3 The cluster analysis of Polygonatum samples

3.5 PCA分析

將3種黃精紫外光譜全波段譜圖進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理后，用SPSS20.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。PCA提取的前3個(gè)主成分作為坐標(biāo)軸，繪制3種黃精的主成分分析三維得分圖。主成分得分圖反映不同種類黃精紫外指紋圖譜間的關(guān)系，圖譜相似的樣品在主成分得分圖中聚在較近的區(qū)域，而圖譜差異越大在主成分得分圖中距離越遠(yuǎn)。研究表明，前三個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98.36%，能夠表達(dá)黃精紫外光譜的大量信息，其中第一主成分特征值為27.79，方差貢獻(xiàn)率為 84.21%，第二主成分特征值為 3.8，方差貢獻(xiàn)率為11.51%，第三主成分特征值為0.87，方差貢獻(xiàn)率為2.64%。由圖4可見(jiàn)，33批黃精藥材被分為2大類，其中滇黃精樣品聚為一類(Ⅰ)，黃精和多花黃精樣品聚為另一類(Ⅱ)，與聚類分析結(jié)果一致。主成分分析能夠反映不同種類黃精的組分和含量差異，根據(jù)主成分分析結(jié)果可以鑒別不同種類黃精。

圖4 33批黃精樣品PCA圖Fig. 4 PCA results of Polygonatum samples

4 討論與結(jié)論

黃精為多元道地藥材，市場(chǎng)上除了3種法定基原黃精外，其同屬植物也均有流通，但傳統(tǒng)認(rèn)為黃精質(zhì)量最佳。2020年版《中國(guó)藥典》鑒定項(xiàng)目中僅有黃精性狀的描述及多糖含量的測(cè)定，但這兩項(xiàng)難以準(zhǔn)確鑒定其種類。本研究發(fā)現(xiàn)，3種黃精基原植物的紫外指紋圖譜聚類分析中，滇黃精單獨(dú)聚為一支，與黃精和多花黃精明顯區(qū)分，與采用黃精多糖的差異性區(qū)分基原黃精的結(jié)果一致[6]。筆者前期采用紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可將3種基原黃精加以區(qū)分[21]。楊興鑫等[4]采用UPLC-Orbitrap MS技術(shù)分別對(duì)黃精化學(xué)成分進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)3種法定基原黃精明顯分為3類。目前，采用紫外光譜方法對(duì)黃精基原植物進(jìn)行鑒別未見(jiàn)報(bào)道，或因紫外光譜數(shù)據(jù)易受測(cè)試條件如溫度、濕度、溶劑等的影響，所測(cè)數(shù)值為多成分共同吸收，又以主成分的影響為主，對(duì)細(xì)微成分區(qū)別度較低。

黃精化學(xué)成分構(gòu)成復(fù)雜，不同提取條件對(duì)黃精圖譜顯示結(jié)果有較大差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃精提取條件優(yōu)化，建立33個(gè)不同基原黃精的平均紫外指紋圖譜，不同種類黃精圖譜差異明顯。三種黃精紫外光譜在波長(zhǎng)210 nm、220 nm、280 nm附近差異明顯，其共有峰揭示了組成成分的相似，而吸光度差異反映出含量不同。聚類分析和主成分分析顯示，不同種類黃精對(duì)物質(zhì)的積累具有差異，這可能與黃精的生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)等因素有關(guān)；紫外光譜結(jié)合主成分分析可以區(qū)分滇黃精與黃精、多花黃精樣品，可為不同基原黃精鑒別和質(zhì)量控制提供參考。