丹參素通過JAK/STAT信號通路對冠心病大鼠的心肌保護作用及對血栓彈力圖的影響

李 晨，薛 賢，韓 羽，陳現(xiàn)杰

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病(coronary heart disease，CHD)是臨床最常見的心血管疾病，是由于冠狀動脈粥樣硬化，造成冠狀動脈血管狹窄甚至阻塞、血栓形成加劇導致心肌缺血、缺氧、壞死而引發(fā)的一種心臟病。冠心病嚴重影響人類生命健康，是發(fā)病率和致死率較高的疾病之一。中藥在治療心血管疾病方面有著巨大的潛力和優(yōu)勢，丹參有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，其在冠心病心絞痛的治療中被使用的頻次最高[1]。從丹參水溶性部位分離到的丹參素有著廣泛的藥理活性，具有擴張冠狀動脈、保護心肌、改善微循環(huán)、降低膽固醇、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗炎及增強免疫等作用[2-4]。丹參及其提取物在治療心血管疾病方面有良好的效果，但在保護心肌、抗血栓方面報道較少。本研究通過建立冠心病大鼠模型，觀察不同濃度丹參素對冠心病心肌損傷的影響，探討丹參素對冠心病心肌損傷的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)合格證號：SCXK(滬)2017-0005，購入后適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 建立冠心病大鼠模型 從60只大鼠中隨機選取12只作為正常對照組，飼喂普通飼料。其余48只采用高脂飲食和注射垂體后葉素建立冠心病模型，每天飼喂高脂飼料，自由飲水，連續(xù)8周，末次喂養(yǎng)前72 h，按30 U/kg腹腔注射垂葉后體素，連續(xù)3 d，末次注射垂體后葉素24 h后，所有造模大鼠監(jiān)測心電圖，出現(xiàn)ST段移位或者T波高聳，提示造模成功，共45只(其中3只造模不成功)。45只造模成功大鼠隨機分為4組，其中模型組11只，陽性對照組11只，丹參素低劑量組11只，丹參素高劑量組12只。

1.2.3 血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)檢測 末次給藥2 h后，腹主動脈采血，取0.9 mL全血加入0.1 mL檸檬酸鈉抗凝并混勻。調(diào)節(jié)血栓彈力圖儀主機預熱至37 ℃，上杯，加血樣，杯中懸針將血凝塊應切力轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?，?jīng)電腦收集和TEG軟件處理，得到TEG相關(guān)參數(shù)：R值、Aagle角、MA值。

1.2.4 心肌損傷指標檢測 腹主動脈采血2 mL，靜置后以2 500 r/min離心15 min，離心半徑12 cm，分離血清。采用免疫化學發(fā)光法檢測血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平。

1.2.5 氧化應激指標檢測 腹主動脈采血2 mL，靜置后以2 500 r/min離心15 min，離心半徑為12 cm，分離血清。采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，化學比色法測定T-AOC。

1.2.6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 采血結(jié)束后摘取心臟，取左心室冠狀面中部的環(huán)狀心肌組織塊并置于10%的中性甲醛溶液中固定備用。取出固定于中性甲醛中約1 mm×1 mm×1 mm大小心肌組織，常規(guī)石蠟包埋、切片(心肌纖維縱切)，脫蠟，3%H2O2室溫處理10 min；蒸餾水洗滌2 min；加入含有末端脫氧核糖核酸(TdT)和地高辛標記的脫氧尿嘧啶(DIG-dUTP)的緩沖液混勻，濕盒37 ℃反應2 h；10×封閉-洗滌緩沖液(TBS)封閉30 min；加入抗地高辛抗體，混勻濕盒反應30 min；TBS沖洗；用抗體稀釋液，生物素-鏈霉親合素-過氧化物酶法(SABC)混勻后反應30 s，TBS洗滌；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染30 s，脫水、封片。顯微鏡下觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕黃色，每張切片隨機選取5個不同視野，計算凋亡指數(shù)，即凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測心肌組織JAK2、STAT1和STAT3 mRNA表達量 采血結(jié)束后摘取心臟，取左心室前壁于液氮凍存?zhèn)溆?。取液氮保存的心肌組織100 mg，提取總RNA，測定RNA純度，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進行基因片段擴增并定量。反應體系：模板cDNA 2 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。反應條件：96 ℃預變性5 min，94 ℃變性5 s，65 ℃退火10 s，70 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，以目的產(chǎn)物與GAPDH的比值表示mRNA的相對含量。引物序列見表1。

表1 基因及其引物序列

1.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測心肌組織JAK2、STAT1和STAT3蛋白表達量 取液氮保存心肌組織100 mg置于勻漿器中，加入細胞裂解液，勻漿后，離心取上清液，按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書檢測蛋白濃度；取總蛋白50 μg十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉封閉2h，加入兔抗JAK2(1∶1000)、p-JAK2(1∶1000)、STAT1(1∶1000)、p-STAT1(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)，GAPDH(1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，洗膜，增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色，暗室下曝光成像。通過Image J軟件檢測灰度值，進行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組TEG相關(guān)指標比較 各組TEG相關(guān)指標比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常對照組比較，模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組R值均縮短，Angle角和MA值均增大，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組R值均延長，Angle角和MA值均減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹參素低劑量組比較，丹參素高劑量組、陽性對照組R值均延長，Angle角和MA值均減小，且丹參素高劑量組R值較陽性對照組延長，Angle角和MA值較陽性對照組減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組TEG相關(guān)指標比較(±s)

2.2 各組心肌損傷指標比較 各組血清CK-MB和cTnI水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常對照組比較，模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組血清CK-MB和cTnI水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組血清CK-MB和cTnI水平均降低(P<0.05)；與丹參素低劑量組比較，丹參素高劑量組、陽性對照組血清CK-MB和cTnI水平均降低，且丹參素高劑量組CK-MB和cTnI水平低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組血清CK-MB和cTnI水平比較(±s)

2.3 各組氧化應激指標水平比較 各組血清SOD、MDA和T-AOC水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常對照組比較，模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組血清SOD、T-AOC活性均降低，MDA含量均增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組血清SOD、T-AOC活性均升高，MDA含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹參素低劑量組比較，丹參素高劑量組、陽性對照組血清SOD、T-AOC活性均升高，MDA含量均降低，且丹參素高劑量組血清SOD、T-AOC活性較陽性對照組升高，MDA含量較陽性對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清SOD、T-AOC和MDA水平比較(±s)

2.4 各組心肌細胞凋亡情況比較 正常對照組、模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組心肌細胞凋亡指數(shù)分別為(3.36±0.34)%、(22.16±2.34)%、(15.48±1.72)%、(5.51±0.67)%、(9.64±1.19)%。各組心肌細胞凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=361.778，P<0.001)。與正常對照組比較，模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組心肌細胞凋亡指數(shù)均升高(P<0.001)；與模型組比較，丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組心肌細胞凋亡指數(shù)均降低(P<0.001)；與丹參素低劑量組比較，丹參素高劑量組、陽性對照組凋亡指數(shù)均降低(P<0.001)，且丹參素高劑量組心肌凋亡指數(shù)低于陽性對照組(P<0.001)。詳見圖1。

圖1 各組心肌細胞凋亡情況(TUNEL×400)(A為正常對照組；B為模型組；C為丹參素低劑量組；D為丹參素高劑量組；E為陽性對照組)

2.5 各組心肌組織JAK2、STAT1和STAT3 mRNA相對表達量比較 各組心肌組織JAK2、STAT1和STAT3 mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠心肌組織JAK2、STAT1、STAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

2.6 各組心肌組織JAK2、STAT1和STAT3蛋白相對表達量比較 各組心肌組織p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與正常對照組比較，模型組、丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均升高(P<0.05)；與模型組比較，丹參素低劑量組、丹參素高劑量組、陽性對照組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均降低(P<0.05)；與丹參素低劑量組比較，丹參素高劑量組、陽性對照組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3均降低，且丹參素高劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表6及圖2。

表6 各組大鼠心肌組織JAK2、STAT1和STAT3蛋白相對表達量比較(±s)

圖2 各組心肌組織JAK2、STAT1和STAT3蛋白相對表達量條帶圖(A為正常對照組；B為模型組；C為丹參素低劑量組；D為丹參素高劑量組；E為陽性對照組)

3 討 論

冠心病發(fā)病率、致殘致死率均較高，日益成為影響人類健康的主要疾病之一，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要發(fā)病原因。動脈粥樣硬化斑塊破裂繼發(fā)血栓形成，引起冠狀動脈狹窄閉塞，導致心肌缺血；在心肌缺血發(fā)展過程中，自由基大量產(chǎn)生，組織抗氧化能力下降，發(fā)生氧化應激，引起心肌組織過氧化損傷，最終導致心肌細胞凋亡或壞死[5]。隨著中藥制藥技術(shù)不斷發(fā)展，多種植物提取物在抗血栓、抑制氧化應激、抗細胞凋亡方面療效明顯，在許多疾病治療中發(fā)揮著積極作用。丹參及其提取物制劑在臨床上被廣泛應用于治療心血管疾病、肝腎病及皮膚病等，并取得了良好效果。

血栓形成與冠心病發(fā)生發(fā)展各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)密切相關(guān)，凝血機制在血栓形成過程中起著重要作用。TEG是臨床上廣泛應用于監(jiān)測凝血功能的重要檢查方法，反映血液凝固動態(tài)變化指標。R值反映凝血時間，Angle角反映血栓形成速度，MA值反映血栓最大強度，是目前評價血栓風險較準確指標。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組R值縮短，Angle角和MA值增大，證實模型組大鼠血液處于相對高凝狀態(tài)，存在明顯凝血功能亢進，與冠心病發(fā)病機制相符；與模型組比較，丹參素各劑量組R值延長，Angle角和MA值減小，提示丹參素可改善TEG相關(guān)指標。研究表明，丹參素可以選擇性抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)發(fā)揮抗血栓形成和抗血小板聚集作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可延長凝血時間，降低血栓形成風險，為臨床指導冠心病抗血小板治療及個體化臨床治療提供準確信息[8]。以上研究表明，丹參素可改善TEG相關(guān)指標，減緩血栓形成，從而延緩冠心病發(fā)生發(fā)展。正常情況下，心肌組織的氧化與抗氧化處于相對動態(tài)平衡狀態(tài)，氧化應激反應是冠心病心肌缺血的基本病理變化，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著重要作用。研究表明，丹參素衍生物對斑馬魚具有明顯抗血栓、抗氧化作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參可抑制醛固酮引起的心肌損傷，促進心肌新血管形成，保護心肌[10-11]。本研究結(jié)果證實，氧化應激參與冠心病病理過程，導致心肌組織過氧化損傷；丹參素各劑量組SOD和T-AOC活性升高，MDA含量降低，心肌損傷指標CK-MB和cTnI得到有效抑制，心肌細胞凋亡指數(shù)降低，且丹參素高劑量組改善效果優(yōu)于陽性對照組，提示丹參素對冠心病引起的心肌過氧化損傷有保護作用，表明丹參素可能通過抗氧化應激抑制心肌細胞凋亡，減少冠心病病理過程中心肌損傷，保護心肌。

JAK/STAT信號通路在多種生物學進程中起著重要作用，通過磷酸化產(chǎn)生激酶活化級聯(lián)反應，并將活化的信號傳導到下游，引發(fā)基因和蛋白水平變化，發(fā)揮生物學效應。研究表明，JAK/STAT信號通路在心肌疾病機制中起著重要作用，冠心病引起的心肌功能障礙與此通路密切相關(guān)[12-14]。JAK/STAT在心肌缺血期間被激活，冠狀動脈持續(xù)閉塞后，STAT1和STAT3磷酸化增多，STAT1活化促進凋亡蛋白Caspase-1、Fas和Fal的表達，抑制編碼抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x的表達，增加心肌細胞凋亡，導致心肌受損[15-17]。Zhang等[16]研究證實，抑制JAK/STAT通路激活，可減少炎性因子的釋放，減輕心肌組織損傷。Abdelsamia等[17]研究顯示，姜黃素可通過抑制JAK/STAT通路預防糖尿病性心肌病。本研究結(jié)果顯示，模型組磷酸化JAK2、STAT1和STAT3蛋白表達與非磷酸化蛋白水平比值明顯升高，證實JAK/STAT通路在冠心病發(fā)展過程中病理過程被激活；丹參素各劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1和p-STAT3/STAT3比值明顯降低，各蛋白磷酸化水平明顯降低，同時心肌細胞凋亡指數(shù)也明顯降低，提示丹參素有抑制p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的作用，表明丹參素可能通過抑制JAK/STAT通路中的關(guān)鍵分子，提高心肌抗氧化能力，減輕冠心病病理過程中心肌損傷。

綜上所述，丹參素在大鼠冠心病病理過程中可能是通過JAK/STAT通路抑制JAK2、STAT1和STAT3磷酸化發(fā)揮抗氧化及抗栓作用，減輕冠心病大鼠心肌損傷，為臨床冠心病的診治提供理論依據(jù)。