絲氨酸/絲氨酸激酶信號通路與腦出血關(guān)系的研究進展

張 策，鄒 偉

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指非外傷性的腦實質(zhì)內(nèi)出血，發(fā)病后多遺留嚴重的神經(jīng)功能損傷[1]。神經(jīng)元死亡是其中重要的病理因素。絲氨酸(Rho)/Rho激酶信號通路是可調(diào)節(jié)細胞骨架關(guān)鍵蛋白-肌動蛋白聚合解聚狀態(tài)的重要信號通路，參與一系列的細胞生理過程且與多種腦血管疾病的發(fā)病過程密切相關(guān)?，F(xiàn)對Rho/Rho激酶信號通路的基本生物學(xué)特征、生理學(xué)作用及其與腦出血的關(guān)系進行綜述。

1 Rho/Rho激酶信號通路基本生物學(xué)特征

1.1 Rho A Rho蛋白-Ras相關(guān)單體鳥嘌呤-5′-三磷酸(GTP)酶可被多個上游分子所活化，調(diào)節(jié)細胞外刺激介導(dǎo)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與肌動蛋白的組織和周期的調(diào)節(jié)。Rho A是Rho家族(Rho A、Rho B、Rho C等)中最重要、最直接的一個Rho激酶，上游刺激信號調(diào)控如神經(jīng)突、軸突生長、樹突形成、神經(jīng)元遷移等，還影響著細胞分化、黏附、遷移、增殖、凋亡等細胞功能[2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肌動蛋白的聚合重組作用是神經(jīng)元軸突的延伸推動細胞膜向前移動的必要條件[3]，減少Rho A的表達可以降低其對神經(jīng)受損后重塑的抑制作用。在軸突和突觸重塑的過程中Rho A能夠激活下游Rho相關(guān)激酶的信號傳導(dǎo)活化后的Rho A，可以與其下游信號通路上的10多種蛋白結(jié)合而產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)。

1.2 Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase，ROCK)Ⅱ Rho下游通路上的信號分子ROCK，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是細胞再生、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄和分化的關(guān)鍵分子[4]。ROCK主要有兩個亞型，分別是ROCK Ⅰ或稱ROK β、ROCK-1、P160-ROCK，主要分布在心臟、血管和骨骼肌等[5]；另一個是ROCK Ⅱ或稱ROK α、ROCK-2[6]；主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的皮質(zhì)、海馬中表達[7]。ROCK Ⅰ蛋白和ROCK Ⅱ蛋白的氨基酸同源率高達65%，與Rho蛋白結(jié)合域(Rho-binding domain，RBD)的同源率高達58%[8]。ROCK的激酶活性在靜息狀態(tài)下具有一定的自我抑制，其羧基端主要起抑制作用；其活性端主要位于氨基酸，活性端與Rho A結(jié)合后，空間結(jié)構(gòu)暴露活性中心，從而表現(xiàn)出催化活性作用[9]。

1.3 Rho-kinase效應(yīng)分子 Rho激酶的下游靶分子包括肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)等[10]。其中MLC是ROCK的作用點位之一，可直接作用于Rho激酶。一方面，MLCP在肌球蛋白結(jié)合亞基(myosin-binding subunit，MBS)參與的條件下，與磷酸化肌球蛋白輕鏈(phospho-myosin light chain，p-MLC)聯(lián)結(jié)[11]，或直接磷酸化MLC[12]，使其脫磷酸；另一方面，Rho激酶激活后磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞基，使MLCP失活[13]，MLC磷酸化水平升高，血管痙攣[14]，但可被Rho激酶抑制劑所翻轉(zhuǎn)[15]。

1.4 Rho/Rho激酶信號通路的生物學(xué)作用 Rho/Rho激酶信號通路中的主要信號分子為Rho GTP酶、ROCK和MLCP。Rho激酶激活途徑主要有兩種：一是通過異源三聚體G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled prot，GPCR)、受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)及細胞因子受體(cytokine receptor)的活化[16]；二是通過細胞黏附(cell adhesion)及整合素/整聯(lián)蛋白(integrin)的激活及鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAP)和GDP解離抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)的共同調(diào)節(jié)作用完成[17]。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作用于Rho激酶后，使其磷酸化，促使Rho釋放二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)，活化成Rho GTP酶后與ROCK的Rho蛋白結(jié)合，改變了Rho激酶的空間構(gòu)型，暴露活性點位，激活Rho激酶[18]，從而導(dǎo)致血管收縮，引發(fā)相關(guān)腦血管疾病。Rho/Rho激酶信號通路通過Rho與GTP酶結(jié)合激活下游ROCK，并進一步磷酸化ROCK下游底物，重塑細胞骨架、誘導(dǎo)肌動蛋白絲(actin filament)穩(wěn)定和肌動蛋白-肌球蛋白收縮組合肌動蛋白網(wǎng)和肌球蛋白纖維調(diào)節(jié)微管動力[19]。

2 Rho/Rho激酶信號通路的生理學(xué)作用

2.1 Rho/Rho激酶信號通路對炎性因子的影響 分子免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究認為，腦水腫的形成可在顱腦損傷后急性期/神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)下持續(xù)加重[20]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細胞釋放或聚集具有神經(jīng)毒性的內(nèi)源性炎性因子[如白細胞介素-1β(1L-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等][21]，引起血-腦屏障破壞，加重腦水腫和神經(jīng)元凋亡[22-24]。Li等[25]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、細胞死亡和腦水腫可由1L-1β、TNF-α引起。龔浩等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，血清TNF-α水平能輔助判斷急性腦出血病人近期預(yù)后情況，且與其神經(jīng)功能損傷密切相關(guān)。

Rho/Rho激酶信號通路激活后，通過與炎癥反應(yīng)的相互作用使血管內(nèi)皮通透性增高，單核巨噬細胞和炎性因子穿過腦血管[27]，加重炎癥反應(yīng)及腦水腫程度。TNF-α可直接破壞細胞間緊密連接，增加血-腦屏障通透性，也可通過其受體激活Rho GTP酶，促進MLC磷酸化，提高平滑肌對Ca2+的敏感性，血管平滑肌收縮，加重腦水腫細胞毒性。Chen 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Rho GTP激酶抑制劑可轉(zhuǎn)錄白細胞介素-6(IL-6)mRNA，減少1L-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生。Rho激酶還參與白細胞與內(nèi)皮細胞間“對接”結(jié)構(gòu)的形成等炎癥反應(yīng)過程[29-30]。Rho激酶通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與了血腦屏障的破壞和顱腦損傷后腦水腫。

2.2 Rho/Rho激酶信號通路對血管和組織內(nèi)皮通透性的影響 ROCK介導(dǎo)的細胞骨架收縮性可調(diào)控緊密連接蛋白claudin-5的連接點位和連接穩(wěn)定性，由此保護淋巴內(nèi)皮屏障的完整性[31]。磷酸化MLC(p-MLC)水平升高及去磷酸化均可導(dǎo)致血管屏障的破壞，p-MLC受細胞內(nèi)Ca2+濃度影響，通過內(nèi)源性(如組胺、凝血酶、血管內(nèi)皮生長因子及脂多糖)和外源性(如機械作用)刺激而被激活后的RhoA與ROCK結(jié)合促進鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)形成[32]，從而增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，活化肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)，由此升高了p-MLC水平[33]；磷酸化的MLCP抑制p-MLC去磷酸化，增加血管內(nèi)皮通透性，破壞血管屏障[34-35]。此外，Rho/Rho激酶信號通路激活后可以破壞緊密連接，表現(xiàn)在血管時可有血管屏障受損，表現(xiàn)在腸內(nèi)皮細胞時可有腸壁通透性增加、屏障受損[36]。

2.3 Rho/Rho激酶信號通路對組織收縮及生長的影響 Rho/Rho激酶信號通路可以誘導(dǎo)組織對Ca2+敏感性增加，增強平滑肌細胞收縮[37]并誘導(dǎo)MLCP和MLC磷酸化，ROCK Ⅱ是該過程中起主導(dǎo)作用的亞型[38]。在病理情況下這種多重效應(yīng)可能導(dǎo)致血管痙攣，誘發(fā)腦出血。ROCK Ⅱ通過黏著斑(focaladhesion)的形成和成熟調(diào)節(jié)成肌細胞的定向移動，促使骨骼肌的生長和再生[39]。Rho/Rho激酶信號通路還可調(diào)控神經(jīng)細胞生長錐和軸突再生和突觸的數(shù)目結(jié)構(gòu)[40]。因此，Rho/Rho激酶信號通路的失活，神經(jīng)生長抑制因子釋放減少，中樞神經(jīng)損傷后突觸再生，減輕軸突損傷，神經(jīng)細胞軸突生長錐(growth cone)的體積增加、運動性提高、軸突延伸過程啟動，對治療腦出血中神經(jīng)損傷有重要意義。

3 Rho/Rho激酶信號通路對血-腦屏障的破壞

血-腦屏障能控制腦內(nèi)物質(zhì)交換，維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮，而內(nèi)皮細胞間的緊密連接(tight junctions，TJs)對于微環(huán)境的改變更加敏感，是血-腦屏障功能變化的基礎(chǔ)，使腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvessel endothelia cells，BMECs)緊密相連發(fā)揮血-腦屏障的屏障作用。Rho/Rho激酶信號通路的激活，與血-腦屏障內(nèi)皮功能損傷有重要聯(lián)系，對緊密連接和內(nèi)皮細胞屏障有反向調(diào)節(jié)作用[41]。參與構(gòu)成血-腦屏障緊密連接成分的閉合蛋白-5(claudins-5)，在腦血管內(nèi)皮細胞中高度表達，對調(diào)節(jié)血-腦屏障通透性起關(guān)鍵作用。研究表明，ROCK活化后，使p-MLC水平上調(diào)，緊密連接屏障功能降低，claudin-5蛋白表達減少，或上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表達，降低基底膜導(dǎo)致的血-腦屏障通透性增加，擴大腦水腫，促進炎性細胞浸潤及不斷進展[33，42]。在腦微血管內(nèi)皮細胞中抑制該通路能誘導(dǎo)咬合蛋白(occludins)和claudin-5的磷酸化[43]。因此，Rho/Rho激酶信號通路對維持血-腦屏障結(jié)構(gòu)完整性具有重要作用[44]。

4 Rho/Rho激酶信號通路與腦出血

血-腦屏障被破壞是腦出血所致腦損傷的重要標志[45]。腦出血后血腦屏障被破壞，白細胞的流入以及潛在的神經(jīng)活性物質(zhì)進入大腦組織可導(dǎo)致腦損傷[46]。炎癥介質(zhì)反應(yīng)(如炎性細胞和趨化因子)、凝血酶的釋放、血紅蛋白降解產(chǎn)物、氧自由基的活性、補體系統(tǒng)的平衡以及基質(zhì)金屬蛋白酶的水平升高，并在數(shù)小時內(nèi)在血腫周圍引起水腫[47]。此外，腦出血后Rho/Rho激酶信號通路被激活，Rho A與ROCK Ⅱ結(jié)合，使p-MLC水平升高，血-腦屏障功能減弱，緊密連接蛋白發(fā)生解體，腦微血管內(nèi)皮細胞通透性增加進而形成腦水腫[48-49]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[50]，Rho/Rho激酶信號通路還可介導(dǎo)氧化應(yīng)激，使氧自由基的生成增多、抑制神經(jīng)細胞再生。腦出血后，Rho/Rho激酶信號通路對內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，血管平滑肌的收縮與舒張以及相關(guān)細胞遷移等作用動態(tài)和持續(xù)，促進腦血管重構(gòu)[51-52]。因此，Rho/Rho激酶信號通路在血-腦屏障被破壞的病理過程中扮演了重要角色。

5 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑與腦出血

5.1 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑的作用機制 Rho/Rho激酶參與腦出血病理機制的發(fā)生發(fā)展過程，血鈣離子濃度異常能夠激活細胞表面受體，使Rho蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位至細胞膜并與三磷酸鳥苷結(jié)合后活化，損傷神經(jīng)與內(nèi)皮細胞。Rho/Rho激酶信號通路抑制劑可作用于多個靶點，通過降低炎癥反應(yīng)、氧自由基產(chǎn)生提升Ca2+濃度拮抗凝血等作用，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損害，改善輕度認知功能障礙；通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和緊密連接，保護血管內(nèi)皮細胞的通透性，修復(fù)血-腦屏障功能等[53-54]。法舒地爾是異喹磺酰胺類藥物，是目前唯一應(yīng)用于臨床的新型Rho激酶抑制劑，其他類抑制劑僅限于實驗研究。

法舒地爾作為Rho/Rho激酶信號通路抑制劑，是治療腦血管痙攣的一種強效血管擴張劑，能雙重抑制磷酸化，包括Rho激酶系統(tǒng)、MLCP等，進而抑制炎癥反應(yīng)、自由基形成，促進神經(jīng)損傷后修復(fù)。法舒地爾易與Rho激酶催化結(jié)構(gòu)中的ATP結(jié)合位點相結(jié)合，因此，對Rho的選擇抑制性較強并且能在無Ca2+的情況下，抑制腎上腺素受體(adrenergic receptors，ARs)活化引起的血管痙攣[55]。

5.2 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑在腦出血中的作用 目前，腦出血內(nèi)科治療措施主要包括安靜臥床，避免情緒波動；以脫水、降顱壓為治療基礎(chǔ)，亞低溫治療為輔；保持呼吸道通暢、調(diào)整血壓與血糖、止血等。但臨床療效不佳，總體預(yù)后差。多項關(guān)于腦出血臨床療效及動物實驗研究證明，法舒地爾一方面能有效縮小腦水腫體積，維護血-腦屏障[56]；另一方面改善腦出血后遺癥期腦內(nèi)物質(zhì)能量代謝，減少有害代謝產(chǎn)物堆積[57]。

2011年，宋明浩等[58]對78例腦出血病人的研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾組病人格拉斯哥昏迷量表評分、格拉斯哥預(yù)后量表評分、腦水腫體積明顯優(yōu)于常規(guī)治療組。2015年，Lee等[59]建立腦出血大鼠模型，采用Wharton氏膠質(zhì)源性骨髓間充質(zhì)干細胞，證明法舒地爾可促進腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。該過程可能是通過促進膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達從而使其向類神經(jīng)元細胞分化。2017年，Dang等[60]研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾能保持腦出血大鼠模型血腦屏障的完整性，以及MMP-9引起血管基質(zhì)降解。2018年，Akhter等[5]的實驗研究表明，法舒地爾對Rho激酶參與腦出血病理過程存在一定的保護作用。Zhou等[61]的實驗研究證實法舒地爾通過抑制Rho/Rho激酶信號通路，使內(nèi)皮細胞穩(wěn)定，減少出血發(fā)生和縮小出血面積，從而改善腦出血病人預(yù)后。2019年，游海鋒[62]對74例高血壓腦出血術(shù)后病人采用醒腦靜聯(lián)合鹽酸法舒地爾治療，結(jié)果顯示，可改善神經(jīng)功能和認知功能，促進意識恢復(fù)。2019年日本卒中中心的一份關(guān)于質(zhì)量指標及其測量的可行性一文中指出，法舒地爾可減輕腦血管痙攣[63]。

6 小 結(jié)

腦出血發(fā)病機制復(fù)雜[47]。在其病理變化過程中，腦水腫是否發(fā)生及其發(fā)生程度極大地影響了病情發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。腦出血發(fā)生后，通過降低Rho/Rho激酶信號通路的活性，可改善血流狀態(tài)，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，改善神經(jīng)細胞功能，調(diào)節(jié)認知障礙。以Rho/Rho激酶信號通路作為腦出血后神經(jīng)元損傷的干預(yù)靶點，分析Rho/Rho激酶信號通路抑制劑(法舒地爾)的作用機制，對腦出血的治療具有重要的臨床意義。