腦脊液二代測(cè)序技術(shù)確診單核細(xì)胞增生李斯特菌腦膜炎兩例報(bào)道

陳平，茍惠，吳文兵，黃露雯，任思沖

單核細(xì)胞增生李斯特菌腦膜炎（Listeria monocytogenes meningitis，LMM）是由單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）感染引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌性腦膜炎，其病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，死亡率高且臨床特征不典型。傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)且陽(yáng)性率極低，通常不能為臨床提供有效的病原學(xué)證據(jù)。目前，LM感染的早期診斷與精準(zhǔn)治療仍面臨挑戰(zhàn)。近幾年隨著腦脊液病原學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）的蓬勃發(fā)展，腦膜炎的病原學(xué)診斷陽(yáng)性率不斷提高，為L(zhǎng)MM的診斷提供了新思路?，F(xiàn)將2例經(jīng)腦脊液NGS確診的LM感染引起的LMM診治經(jīng)過(guò)報(bào)道如下，以供臨床醫(yī)生參考。

1 病例簡(jiǎn)介

1.1 病例1 患者，男性，76歲，主因“四肢麻木1個(gè)月”于2021-02-02就診于遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。1個(gè)月前，患者無(wú)明顯誘因出現(xiàn)四肢麻木，雙下肢麻木自遠(yuǎn)端向上逐漸進(jìn)展，伴有雙下肢無(wú)力感，逐漸出現(xiàn)雙上肢手指尖麻木，就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，給予甲鈷胺、維生素B12等營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，癥狀未明顯改善，遂就診于遂寧市中心醫(yī)院。既往史及個(gè)人史：既往體健，否認(rèn)結(jié)核、免疫疾病，否認(rèn)鴿子糞接觸史，無(wú)食物、藥物過(guò)敏史。體格檢查：體溫36.8 ℃，脈搏95次/min，血壓156/93 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），呼吸頻率20次/min。心、肺、腹部檢查未見異常；意識(shí)清楚，精神可，言語(yǔ)清晰，記憶力、理解力均正常。雙下肢踝關(guān)節(jié)以下針刺痛覺減退，雙上肢腱反射減弱，跟膝脛試驗(yàn)欠穩(wěn)準(zhǔn)。閉目難立征陽(yáng)性，余基本正常。輔助檢查：血、尿、便常規(guī)及肝腎功能、免疫全套、凝血功能、電解質(zhì)檢查未見明顯異常。影像學(xué)檢查：（1）顱腦MR平掃+增強(qiáng)檢查未見明顯異常；（2）腦脊液檢查：壓力正常，白細(xì)胞計(jì)數(shù)2×106/L，蛋白定量偏低（1.33 g/L），病毒系列、抗酸染色、墨汁染色均陰性。臨床考慮：多發(fā)性周圍神經(jīng)病變，格林巴利綜合征？

治療經(jīng)過(guò)：入院第1天，給予靜脈注射人免疫球蛋白沖擊治療，當(dāng)日患者出現(xiàn)過(guò)敏性休克，改用甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊治療，癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。入院第19天，患者出現(xiàn)發(fā)熱伴頭痛，最高體溫39.0 ℃，頸阻（+），意識(shí)模糊。輔助檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)28.2×109/L，中性粒細(xì)胞比例84.1%，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)23.74×109/L，全血超敏C反應(yīng)蛋白5.28 mg/L；腦脊液檢查：壓力400 mm H2O（1 mm H2O=0.009 8 kPa），淺黃色，潘氏蛋白定性（+），白細(xì)胞計(jì)數(shù)230×106/L，多核細(xì)胞比例79%，蛋白定量1.77 g/L，氯化物107.3 mmol/L，葡萄糖4.01 mmol/L，腦脊液細(xì)菌、結(jié)核、真菌等病原學(xué)常規(guī)涂片及培養(yǎng)陰性，病毒抗體陰性。顱腦MR平掃+增強(qiáng)檢查未見明顯異常。臨床考慮化膿性腦膜腦炎可能性大？給予美羅培南（2 g/次，1次/8 h）聯(lián)合萬(wàn)古霉素（1 g/次，1次/12 h）經(jīng)驗(yàn)性的廣覆蓋病原菌抗感染治療，甘露醇（125 ml/次，1次/8 h）聯(lián)合甘油果糖氯化鈉（250 ml/次，1次/12 h）交替靜脈輸注以脫水降顱壓，輔以補(bǔ)鈣、補(bǔ)鉀維持電解質(zhì)，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)，補(bǔ)液等對(duì)癥支持治療。入院第24天，患者體溫恢復(fù)正常，頭痛程度明顯減輕，頸阻（+），腦脊液NGS結(jié)果回報(bào)LM，停用萬(wàn)古霉素，繼續(xù)使用美羅培南抗感染治療。入院第42天，患者體溫正常，無(wú)頭痛，頸阻（-），腰椎穿刺腦脊液檢查基本正常，見表1。予以出院。

1.2 病例2 患者，女性，25歲，2 d前，患者無(wú)明顯誘因出現(xiàn)頭痛伴發(fā)熱、惡心、嘔吐，體溫波動(dòng)在40.0～40.8 ℃，社區(qū)診所給予布洛芬退熱，癥狀改善不明顯。4 h前，患者頭痛加重，出現(xiàn)胡言亂語(yǔ)，因“頭痛伴發(fā)熱2 d”于2021-08-04就診于遂寧市中心醫(yī)院，家屬訴患者喜食冰凍瓜果、熬夜喝酒等。既往史及個(gè)人史：既往體健，否認(rèn)結(jié)核、免疫疾病，否認(rèn)鴿子糞接觸史，無(wú)食物、藥物過(guò)敏史。體格檢查：體溫40.9 ℃，脈搏100次/min，血壓125/76 mm Hg，呼吸頻率20次/min。心、肺、腹部檢查未見明顯異常；雙側(cè)瞳孔等大形圓，直徑約2.5 mm，直接及間接對(duì)光反射靈敏；眼球各向活動(dòng)檢查不配合，鼻唇溝無(wú)變淺，伸舌不配合；四肢肌力不配合，四肢肌張力正常；四肢腱反射對(duì)稱存在；共濟(jì)運(yùn)動(dòng)檢查不配合；雙側(cè)針刺痛覺不配合；雙側(cè)病理征陰性；頸阻（+）。輔助檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)15.2×109/L，中性粒細(xì)胞比例91.6%，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)13.9×109/L，全血超敏C反應(yīng)蛋白184.25 mg/L，血清降鈣素原1.55 μg/L；腦脊液檢查：外觀呈黃色渾濁，壓力480 mm H2O，白細(xì)胞計(jì)數(shù)800×106/L，潘氏蛋白定性（+），多核細(xì)胞比例72%，蛋白定量1.92 g/L，氯108.1 mmol/L，葡萄糖0.37 mmol/L，腦脊液抗酸墨汁、新型隱球菌涂片及一般細(xì)菌涂片均為陰性。尿常規(guī)、便常規(guī)、肝腎功能、免疫全套、凝血功能、電解質(zhì)檢查未見明顯異常。入院診斷“顱內(nèi)感染，原因待查？膿毒血癥？”。

治療經(jīng)過(guò)：入院第1天給予頭孢曲松（2 g/次，1次/12 h）抗感染治療，患者體溫波動(dòng)在39.0～40.8 ℃，入院第3天升級(jí)為美羅培南（2 g/次，1次/8 h）繼續(xù)抗感染治療，患者仍反復(fù)發(fā)熱，熱峰值波動(dòng)在39.0～39.4 ℃，腦脊液NGS結(jié)果回報(bào)LM，立即停用美羅培南，改用青霉素（800萬(wàn)U/次，1次/8 h）繼續(xù)抗感染治療。入院第9天，患者體溫恢復(fù)正常，頭痛明顯緩解，意識(shí)清楚，頸阻（-），腰椎穿刺腦脊液檢查結(jié)果較前好轉(zhuǎn)。入院第14天，患者體溫正常，無(wú)頭痛，精神可，頸阻（-），主動(dòng)要求出院，醫(yī)生建議出院后繼續(xù)在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院抗感染治療，總療程維持在3周以上。2021-09-01隨訪，患者病情穩(wěn)定，無(wú)發(fā)熱、頭痛等，外院復(fù)查腦脊液結(jié)果已基本趨于正常，見表1。

表1 病例1及病例2抗生素治療前后腰椎穿刺腦脊液檢查結(jié)果Table 1 Results of lumbar puncture cerebrospinal fluid test before and after antibiotic treatment in case 1 and case 2

2 討論

LM是一種革蘭陽(yáng)性菌兼厭氧性細(xì)菌，在20世紀(jì)80年代被首次確認(rèn)為食源性病原體，可污染多種食物，主要通過(guò)奶制品、果蔬、肉類食品進(jìn)行傳播［1］，具有高度噬神經(jīng)性［2］，因LM嗜冷，能夠在4 ℃下生長(zhǎng)繁殖，故常被稱為“冰箱殺手”［3-4］。荷蘭一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)LM感染患者中50歲以下者常伴有免疫力低下，而未合并免疫力低下患者均大于50歲［6］。2019年波蘭的一項(xiàng)單中心回顧性研究顯示，高齡、腫瘤、飲酒、接受免疫抑制劑治療的人群容易感染LM［7］。攝入LM污染的食物，LM經(jīng)口進(jìn)入消化道，侵犯腸黏膜并透過(guò)腸道屏障與血-腦脊液屏障誘發(fā)感染，易聚集于哺乳動(dòng)物的胎盤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦膜炎甚至腦膿腫［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年LM感染的發(fā)病率為3/100萬(wàn)～6/100萬(wàn)［9］，20%～25%的LM感染累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10-11］，導(dǎo)致嚴(yán)重的LMM［12］，病死率高達(dá)20%～30%，免疫缺陷患者的病死率甚至達(dá)70%［13-15］，造成了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。有研究發(fā)現(xiàn)，推遲使用有效的抗菌藥物超過(guò)6 h，患者病死率增加2.7倍［16］。因此，快速準(zhǔn)確識(shí)別病原體并給予有效的抗菌藥物治療是患者預(yù)后良好的關(guān)鍵。細(xì)菌培養(yǎng)是LM感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但傳統(tǒng)方法培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為40%［17］，故多數(shù)患者不能明確病原體，給臨床診治帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。NGS具有高通量、檢測(cè)周期短、準(zhǔn)確率高、可快速明確致病微生物等特點(diǎn)，近幾年已經(jīng)發(fā)展成為腦脊液病原體檢測(cè)高效敏感的方法，提高了LM感染檢出率［18-20］，彌補(bǔ)了以腦脊液涂片、鑒定、細(xì)菌培養(yǎng)為主的傳統(tǒng)病原體檢測(cè)的不足［21］。2016年，北京協(xié)和醫(yī)院YAO等［22］在國(guó)際上首次報(bào)道了3例腦脊液培養(yǎng)陰性的急性/亞急性腦膜腦炎患者，其腦脊液標(biāo)本采用NGS最終診斷為L(zhǎng)MM。2017年，王曉娟等［23］采用NGS確診了5例LMM患者，且均通過(guò)PCR驗(yàn)證，但腦脊液培養(yǎng)結(jié)果提示陰性。2020年，LAN等［24］采用NGS檢測(cè)1例臨床表現(xiàn)疑為結(jié)核性腦膜腦炎的患者腦脊液，最終確診為L(zhǎng)MM。以上報(bào)道足以說(shuō)明NGS在LMM檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文病例1為老年患者，既往體健，入院后檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤，但住院期間接受大劑量激素沖擊治療，考慮患者顱內(nèi)感染可能與年齡偏大、大劑量使用激素引起免疫力低下有關(guān)。病例2為年輕女性，喜食冰箱冷藏水果、熬夜飲酒，既往體健，未發(fā)現(xiàn)腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病，考慮感染可能與食用被LM污染的冷藏水果，熬夜飲酒導(dǎo)致抵抗力降低有關(guān)。2例患者腦脊液涂片、培養(yǎng)均為陰性，NGS提示LM感染。因此，對(duì)于不明原因的嚴(yán)重顱內(nèi)感染患者，若家屬同意，可積極嘗試腦脊液NGS，有利于病原學(xué)診斷并及時(shí)給予精準(zhǔn)治療，以提高患者治愈率。

LMM目前尚未有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床常根據(jù)患者急性高熱，意識(shí)改變，腦膜刺激征陽(yáng)性，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，C反應(yīng)蛋白升高，腰椎穿刺腦脊液檢查顯示壓力升高、外觀渾濁、白細(xì)胞計(jì)數(shù)與蛋白定量升高等與病毒性腦炎、結(jié)核性腦炎等相鑒別，但LMM本質(zhì)屬于細(xì)菌性腦膜炎，與臨床常見的細(xì)菌性腦膜炎相比，其臨床特征無(wú)明顯特異性。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［25-26］并總結(jié)本文2例患者臨床特征，筆者認(rèn)為如果出現(xiàn)以下臨床表現(xiàn)，可懷疑LM感染：（1）夏季發(fā)病，有食用冰箱冷藏瓜果或熬夜飲酒；（2）急性起病伴高熱、意識(shí)改變、腦膜刺激征陽(yáng)性；（3）使用免疫抑制劑；（4）血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（10～20）×109/L，以中性粒細(xì)胞為主，超敏C反應(yīng)蛋白升高；（5）腦脊液壓力升高，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)升高，葡萄糖和氯化物基本正常。

臨床醫(yī)生常采用第三代頭孢菌素經(jīng)驗(yàn)性治療常見細(xì)菌性腦膜炎，但LM對(duì)頭孢菌素類抗生素天然耐藥，常導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)性治療失敗而延誤病情，因此，及時(shí)準(zhǔn)確地明確病原體和識(shí)別LMM尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)外均推薦氨芐西林或青霉素作為治療LM的一線用藥，單藥治療或與氨基糖苷類聯(lián)用［27-29］，二者聯(lián)合可以增強(qiáng)體內(nèi)殺菌作用［30］?！稓W洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)急性細(xì)菌性腦膜炎診治指南》［31］提出可選用美羅培南、復(fù)方新諾明、利奈唑胺作為治療LM感染的替代藥物，但美羅培南治療LM感染的效果不一，如2016年丹麥對(duì)229例患者展開的一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，使用美羅培南治療的患者3 d死亡率高于使用芐青霉素或氨基青霉素治療的患者［32］，而大量臨床案例也提示美羅培南可成功治療LMM［33］。至于抗感染療程，《ABX指南：感染性疾病的診斷與治療》［34］建議LMM患者抗菌治療至少3周，腦膿腫或后腦腦炎療程可達(dá)4～6周。本文病例1初始病情危重，病原學(xué)未明確，故選用可覆蓋多種病原菌的廣譜抗生素美羅培南聯(lián)合萬(wàn)古霉素抗感染治療，患者臨床癥狀及相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果趨于好轉(zhuǎn)，腦脊液NGS結(jié)果回報(bào)提示LM感染后立即停用萬(wàn)古霉素，繼續(xù)使用美羅培南抗感染治療，治療有效。病例2為年輕女性，起病急，病情危重，先后使用第三代頭孢（頭孢曲松）、美羅培南治療效果不理想，腦脊液NGS結(jié)果回報(bào)提示LM感染，立即改用青霉素抗感染治療，患者臨床癥狀及相應(yīng)炎性指標(biāo)明顯改善，治療有效，可供臨床參考。

綜上所述，LMM臨床少見，病情兇險(xiǎn)，臨床特征缺乏特異性，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)LM耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，且LM對(duì)經(jīng)驗(yàn)性治療細(xì)菌性腦膜炎的三代頭孢天然耐藥，導(dǎo)致臨床漏診、誤診，延誤治療。因此，早期精準(zhǔn)診斷、及時(shí)給予合理抗生素治療可改善患者預(yù)后，減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)，腦脊液NGS有助于病原學(xué)診斷，為臨床醫(yī)生提供有效的病原學(xué)參考，對(duì)于病情危重但病原菌未明確的細(xì)菌性腦膜炎患者，若條件允許可考慮行腦脊液NGS，并根據(jù)結(jié)果給予合理的抗菌藥物治療。

作者貢獻(xiàn)： 陳平、黃露雯進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、可行性分析；茍惠進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集；吳文兵進(jìn)行文獻(xiàn)/資料整理；陳平撰寫、修訂論文；任思沖負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。