基于GC-MS分析傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

張琦夢，顧華蓉，穆洪濤，趙孟斌，陳瑜珠，高向陽*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 廣東省功能食品活性物重點實驗室 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；3.汕頭魚露廠有限公司，廣東 汕頭 515021）

魚露又被稱為魚醬油，以低值魚和一定比例的海鹽作為原料，經(jīng)過數(shù)月甚至數(shù)年的自然發(fā)酵制成，是廣東、福建等地常見的調(diào)味品。作為一種流行的調(diào)味品，傳統(tǒng)魚露具有突出的鮮味和咸味，并伴有一定的甜味和苦味。魚肉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶等作用下分解并發(fā)生美拉德反應(yīng)，脂肪氧化、斯特勒克降解等代謝反應(yīng)，產(chǎn)生醛、酮、醇、酯等化合物，從而形成魚露獨特的風(fēng)味。發(fā)酵過程通常需要很長時間才能確保魚露的溶解以及風(fēng)味和顏色的發(fā)展，因此在不同的發(fā)酵時間下具有不同的味道特征。

整個發(fā)酵過程中，醛類物質(zhì)通常被認為是魚露的主要揮發(fā)性風(fēng)味貢獻物質(zhì)，如3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛和2-辛烯醛等[1]，通常帶有肉香味和燒焦味[2]。而其他物質(zhì)隨著發(fā)酵進程逐漸轉(zhuǎn)化，表達出不同的變化趨勢，對魚露揮發(fā)性風(fēng)味進行修飾。研究表明，魚露在前期（1～3個月）變化較為緩慢，醇類、酸類和醛類物質(zhì)迅速積累；而到中期（3～9個月），醇類（除1-辛烯-3-醇以外的醇類，尤其是乙醇）含量達到頂峰后，開始消耗，酯類物質(zhì)含量顯著增加，醛類和酸類含量仍然逐漸增加，開始形成較強的香氣物質(zhì)；隨著發(fā)酵時間的變化，尤其是12個月，魚露的代謝物明顯與其他發(fā)酵時期不同[3-5]。然而，目前對魚露的揮發(fā)性物質(zhì)的變化研究多集中在0～12個月，對于12個月后的變化則不明。魚露的揮發(fā)性風(fēng)味是非常復(fù)雜的體系，對其完整的還原即不破壞其風(fēng)味并將其完整提取出來是對風(fēng)味物質(zhì)研究的重要前提。

頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro-extraction，HS-SPME）彌補了傳統(tǒng)樣品前處理過程技術(shù)的不足，提高了分析檢測的整體效率，且較能真實的反應(yīng)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)組成。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gaschromatographmass spectrometer，GC-MS）可同時實現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)的分離和鑒定。HS-SPME-GC-MS技術(shù)聯(lián)用目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)性物質(zhì)檢測與分析，如發(fā)酵魷魚[6]、發(fā)酵蝦醬[7]、發(fā)酵乳[8]和酸湯[9]等產(chǎn)品。

本研究以鳀魚為原料，采用傳統(tǒng)發(fā)酵加工技術(shù)進行魚露制作，并利用HS-SPME-GC-MS方法分析從原料到發(fā)酵成熟過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量變化，為魚露特殊風(fēng)味的形成機理及發(fā)酵過程中的質(zhì)量動態(tài)控制及提高魚露的風(fēng)味口感提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚露發(fā)酵液（未發(fā)酵，發(fā)酵3個月、6個月、9個月、12個月、15個月）：廣東省汕頭魚露廠有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國Agilent公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取針：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

向25 mL的頂空瓶中加入5 mL魚露樣品和1.5 g NaCl，室溫條件下攪拌20 min，45 ℃條件下平衡30 min；將已活化好的SPME纖維頭（270 ℃老化30 min）在45 ℃條件下頂空萃取揮發(fā)性化合物30 min；于260 ℃條件下解吸5 min，完成進樣。

1.3.2 揮發(fā)性成分的GC-MS分析

GC條件：色譜柱為HP-INNOWax TM聚乙二醇毛細管柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度為260 ℃，柱初始溫度為35 ℃，保持5 min，以6 ℃/min的速率上升至225 ℃并持續(xù)10 min；載氣為氦氣（He），柱流速為1 mL/min；分流比為10∶1。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，MS四級桿溫度為150 ℃；掃描范圍：50～550 m/z。

定性定量分析：GC-MS數(shù)據(jù)由計算機檢索并與圖譜庫美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）0.8L的標準質(zhì)譜圖對照分析，確認物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱?；衔锵鄬坎捎梅迕娣e歸一化法進行分析確定。

1.3.3 關(guān)鍵風(fēng)味化合物分析

參照劉登勇等[10]的方法計算樣品中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用相對氣味活度值（relativeodoractivityvalue，ROAV）。

選擇對樣品總體風(fēng)味貢獻最大的組分定義為ROAVstan=100，其他揮發(fā)性物質(zhì)ROAV則按下式計算：

式中：C%A、TA分別表示各揮發(fā)性組分的相對百分含量/%和對應(yīng)的感覺閾值/（mg/kg）；C%stan、Tstan分別表示對樣品風(fēng)味貢獻最大組分的相對百分含量/%和感覺閾值/（mg/kg）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

用IBM SPSS 25.0、Excel 2019軟件和Origin 2019b 64Bit進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵期間魚露揮發(fā)性香氣成分的鑒定

采用HS-SPME-GC-MS對不同發(fā)酵階段魚露樣品的揮發(fā)性成分進行測定。不同發(fā)酵階段魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流色譜圖見圖1。由圖1可知，魚露在不同發(fā)酵階段共檢測出178種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類11種、醇類48種、醛類32種、酮類27種、酯類16種、烴類14種、苯環(huán)類10種、雜環(huán)類10種以及其他類10種。在各個發(fā)酵階段，分別檢測出65、69、75、90、90、92種揮發(fā)性物質(zhì)。隨著發(fā)酵時間的延長，魚露中的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量逐漸增加，尤其是酸類、酮類、烴類、苯環(huán)類。與其他研究相比[3，11-13]，本研究發(fā)酵時間更長，所檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量也更多。

圖1 不同發(fā)酵時間魚露揮發(fā)性成分物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in fish sauce at different fermentation time analysis by GC-MS

不同發(fā)酵時間魚露的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量見表1。由表1可知，酸類（2.99%～30.02%）、醇類（13.97%～41.77%）和醛類（8.67%～51.61%）總含量明顯高于其他類揮發(fā)性化合物，這與陳麗麗等[13-14]的檢測結(jié)果一致。

表1 不同發(fā)酵時期魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Table 1 Analysis of volatile flavor compounds in fish sauce at different fermentation periods

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

酸類物質(zhì)主要來源于氨基酸的分解代謝或脂肪酸的氧化，對魚露提供奶酪香味。魚露中含有多種短鏈揮發(fā)性有機酸，如乙酸、丙酸、丁酸及4-甲基戊酸，在整個發(fā)酵過程中均被檢測到，其主要來源于直鏈脂肪酸。其中，由葡萄球菌和乳酸菌通過脂肪酸氧化和丙氨酸代謝產(chǎn)生的乙酸隨著發(fā)酵時間增加，由原來的1.88%增加到12.99%，這與SAKPETCH P等[15]的研究結(jié)果一致。丙酸和4-甲基戊酸隨著發(fā)酵時間先增加后減少。另外異戊酸和戊酸在發(fā)酵前期存在，而壬酸只在后期出現(xiàn)。然而，由于酸的閾值較高，酸對發(fā)酵魚的揮發(fā)性風(fēng)味作用較小。

醇類通過氨基酸降解或脂質(zhì)氧化生成，通常被認為是發(fā)酵產(chǎn)品中許多生化反應(yīng)的前體[16]。發(fā)酵水產(chǎn)品中的大部分醇是多不飽和脂肪酸氧化的降解產(chǎn)物，具有蘑菇香味和類金屬風(fēng)味，能夠影響發(fā)酵水產(chǎn)品風(fēng)味的形成。正丁醇、正戊醇、1-戊烯-3-醇、正己醇、（Z）-2-戊烯-1-醇及1-辛烯-3-醇在整個發(fā)酵過程中均被檢測到。其中，丁醇、戊醇隨著發(fā)酵時間呈減少趨勢，1-戊烯-3-醇、己醇、（Z）-2-戊烯-1-醇隨著發(fā)酵時間先增加后減少，1-辛烯-3-醇隨著發(fā)酵時間先減少后增加。1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化而成的，具有蘑菇香味，ZHOU Y Q等[17]的研究也檢測到1-辛烯-3-醇，并認為其是魚露中一種重要的氣味化合物。異戊醇、1,3-戊二醇在發(fā)酵前期存在，糠醇只在發(fā)酵后期出現(xiàn)。異戊醇是由碳水化合物經(jīng)糖酵解途徑（Embden-meyerhof pathway，EMP）途徑和氨基酸經(jīng)Ehrlich途徑產(chǎn)生的支鏈醇，脫羧酶和乙醇脫氫酶參與Ehrlich途徑[18]。

醛類化合物閾值低，是食品中重要的香氣化合物。通過賦予青草、堅果、糖果和奶酪的氣味，醛類化合物通常在不同的發(fā)酵產(chǎn)品中被消費者廣泛接受[19]。本研究檢測到的醛類主要由脂肪醛組成，其中戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-辛烯醛等來源于不飽和脂肪酸的自氧化和酶氧化，而支鏈醛是由氨基酸通過Strecker降解和微生物代謝活性生成的[20]。己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-辛烯醛、壬醛及苯甲醛在整個發(fā)酵過程中均被檢測到。其中，己醛、壬醛和苯甲醛隨著發(fā)酵時間先減少后增加，（E）-2-己烯醛及（E）-2-辛烯醛隨著發(fā)酵時間呈增加趨勢。3-甲硫基丁醛只在發(fā)酵前期存在，2-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛在中后期出現(xiàn)。其中，2-甲基丁醛提供堅果香味，是魚露的特征氣味之一[21]，來源于異亮氨酸的Strecker降解。3-甲硫基丙醛的產(chǎn)生是一個由氨基轉(zhuǎn)移酶和α-酮酸脫羧酶活性介導(dǎo)的過程，具有較低的閾值，賦予成品肉味和熟土豆的香味[18]，GIRI A等[21]在發(fā)酵魚醬、魚露、醬油和醬油制品也檢測到3-甲硫基丙醛，并對魚露的氣味影響最大。

酮類化合物由多不飽和脂肪酸氧化或降解，氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生。據(jù)GAO P等[22]報道，酮類物質(zhì)導(dǎo)致魚露氣味中有奶酪味。在整個發(fā)酵過程中，2-丁酮、2,3-戊二酮及3,5-辛二烯-2-酮等均被檢測到。其中，2-丁酮和2,3-戊二酮含量呈穩(wěn)定趨勢；3,5-辛二烯-2-酮含量不斷增加（0.03%～0.96%），具有動物油脂味和哈喇味，對腥味有一定加和作用[23]。烷基二酮可令食品具有強烈的奶香，2,3-戊二酮及2-丁酮均呈現(xiàn)奶香味，黃油的香味可增強腥味物質(zhì)的腥味[24]。

酯類是通過有機酸和醇的酯化反應(yīng)形成的。由短鏈酸合成的酯類通常有助于產(chǎn)生水果香氣，而由長鏈酸合成的酯類則提供脂肪味[25]。本研究檢出了10種芳香族類化合物，有研究表明這些物質(zhì)可能是因環(huán)境被污染而在魚肉中富集導(dǎo)致，會使魚露呈不愉快的風(fēng)味[26]。在樣品中檢測到的雜環(huán)化合物包括吡啶、呋喃及其衍生物。這些化合物通常由美拉德反應(yīng)或氨基酸分解形成。據(jù)報道，在雜環(huán)化合物中，呋喃類化合物會對發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生氣味影響，使其具有焦糖、甜味和烘焙風(fēng)味[27]。吲哚是一類具有復(fù)雜氣味特征的含氮化合物，被認為是微生物酶分解色氨酸的產(chǎn)物[28]。它們在低濃度時伴隨著令人愉悅的氣味，而在高濃度時會變成強烈而持久的糞便氣味[29]。

烷烴和烯烴是由脂肪酸的自氧化生成的。烷烴類化合物（0.46%～0.97%）通常認為不具有氣味活性，故對魚露整體風(fēng)味貢獻不大。烯烴類化合物（0.32%～5.04%），具有較低的閾值，并且大多帶有果香味，因此能賦予魚露清新和香甜味[25]。在樣品中還檢測到檸檬烯，通常來自香料，由于其存在于飼料中，可能在魚中積累[30]。

將各類別揮發(fā)性物質(zhì)含與發(fā)酵時間進行皮爾遜相關(guān)性分析，其相關(guān)性如圖2所示，酸類、酮類、烴類、酯類、苯環(huán)類、雜環(huán)類的相關(guān)系數(shù)＞0，說明隨著發(fā)酵時間的延長，這些物質(zhì)總含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，15月時百分含量分別達到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%；醇類、醛類、其他類化合物的相關(guān)系數(shù)＜0，說明這些物質(zhì)總含量整體呈現(xiàn)下降趨勢，15月時百分比分別達到了13.97%、27.84%、1.84%。

圖2 魚露中各類揮發(fā)性物質(zhì)與發(fā)酵時間相關(guān)系數(shù)圖Fig.2 Correlation coefficient between various volatile substances and fermentation time of fish sauce

2.2 基于ROAV計算分析魚露的主要揮發(fā)性風(fēng)味變化

對檢測結(jié)果中的風(fēng)味成分在水中的香味閾值進行查詢并計算，按照食品風(fēng)味研究的一般方法[31]，當(dāng)物質(zhì)的ROAV≥1時，則該物質(zhì)對于揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻大，為主要香氣成分，ROAV越大，對風(fēng)味的貢獻就越大；當(dāng)0.1≤ROAV＜1時，該成分起到風(fēng)味修飾作用[32]。ROAV越大說明這種物質(zhì)對樣品的總體風(fēng)味貢獻也越大。結(jié)合表1數(shù)據(jù)，可判斷魚露發(fā)酵0月時，正辛醛對其總體風(fēng)味貢獻程度最大，故規(guī)定其ROAV=100，同理，魚露發(fā)酵3月時2-乙基呋喃總體風(fēng)味貢獻程度最大，魚露發(fā)酵6、9、12、15月時3-甲硫基丙醛總體風(fēng)味貢獻程度最大，其他風(fēng)味成分的ROAV由式（1）計算得出，結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)酵時間的魚露主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對風(fēng)味活度值Table 2 ROAVs of the main volatile compounds in fish sauce at different fermentation time

如表2所示，發(fā)酵0月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醛類、醇類、含氮化合物和含硫化合物；發(fā)酵3月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為酸類、醇類、醛類、酮類、苯環(huán)類、雜環(huán)類、含氮化合物和含硫化合物；發(fā)酵6月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類、雜環(huán)類和含硫化合物；發(fā)酵9月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和酯類化合物；發(fā)酵12月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和雜環(huán)類化合物；發(fā)酵15月魚露的主體風(fēng)味物質(zhì)為醇類、醛類、苯環(huán)類和雜環(huán)類化合物。異戊醇是整個魚露發(fā)酵過程中的主體風(fēng)味物質(zhì)；丁酸、異戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫是魚露發(fā)酵前期的主體風(fēng)味物質(zhì)；丁酸乙酯是魚露發(fā)酵中期的主體風(fēng)味物質(zhì)；癸醛、（E）-2-壬烯醛、3-乙基苯酚是魚露發(fā)酵后期的主體風(fēng)味物質(zhì)；3-甲硫基丙醛是魚露發(fā)酵中后期的主體風(fēng)味物質(zhì)且風(fēng)味貢獻率最大，這與李春生等[3]的研究結(jié)果一致。為進一步明晰魚露揮發(fā)性風(fēng)味化合物在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化。

2.3 熱圖聚類分析

本研究選取在發(fā)酵過程中各階段的主體風(fēng)味物質(zhì)，對其含量的變化進行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物含量變化的聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat map of volatile compounds contents during fish sauce fermentation

由圖3可知，丁酸、（Z）-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚九種物質(zhì)隨發(fā)酵時間逐漸增加，說明這9種化合物很大程度上影響了魚露發(fā)酵過程中的風(fēng)味。發(fā)酵3月和6月的魚露氣味相似，發(fā)酵9月、12月和15月的魚露氣味相似，說明在發(fā)酵3月、9月時，揮發(fā)性風(fēng)味發(fā)生顯著變化。

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，檢測了魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動態(tài)變化，對比分析其發(fā)酵過程中變化較明顯的化合物，共檢測出化合物178種，分別為酸類11種、醇類48種、醛類32種、酮類27種、酯類16種、烴類14種、苯環(huán)類10種、雜環(huán)類10種以及其他類10種。酸類（2.99%～30.02%）、醇類（13.97%～41.77%）和醛類（8.67%～51.61%）總量明顯高于其他類揮發(fā)性化合物。酸類、酮類、烴類、酯類、苯環(huán)類、雜環(huán)類的含量隨著發(fā)酵時間的延長整體呈現(xiàn)上升趨勢，15月時相對含量分別達到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%；醇類、醛類、其他類化合物的含量則整體呈現(xiàn)下降趨勢，15月時相對含量分別達到了13.97%、27.84%、1.84%。然后采用ROAV法和聚類分析發(fā)酵過程中各樣品的主體風(fēng)味構(gòu)成。結(jié)果表明魚露發(fā)酵前期的主體風(fēng)味物質(zhì)有丁酸、異戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫；發(fā)酵中期的主體風(fēng)味物質(zhì)是丁酸乙酯；發(fā)酵后期的主體風(fēng)味物質(zhì)有癸醛、（E）-2-壬烯醛、3-乙基苯酚；3-甲硫基丙醛是魚露發(fā)酵中后期風(fēng)味貢獻率最大的物質(zhì)。魚露的主要關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)由丁酸、（Z）-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚組成。通過研究鳀魚發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)種類和相對含量變化，為魚露特殊風(fēng)味的形成機理及發(fā)酵過程中的質(zhì)量動態(tài)控制提供參考依據(jù)，進一步指導(dǎo)鳀魚發(fā)酵的風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)化。