不同濃度紫草素對培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的毒性作用分析

陳菊英 黃文東 高 琦 練曉珊

（1.廣州泰和腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510030；2.廣東省茂名市人民醫(yī)院藥劑科，廣東 茂名 525099；3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510600）

心臟可以為血液流動提供動力，是循環(huán)系統(tǒng)重要的器官之一，臨床藥物的細(xì)胞毒性均可能引起不同程度心臟循環(huán)壓力，甚至?xí)斐尚墓δ艿膼夯?。采用MTT法可以檢測臨床藥物對心肌細(xì)胞存活率[1]。紫草具有涼血、活血功效的中草藥，有研究發(fā)現(xiàn)，從紫草中提取出來的紫草素、乙酰紫草素對細(xì)菌、真菌具有明顯的抑制作用。主要通過升高不同類型腎癌細(xì)胞中活性氧水平和p38活性來觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡，達(dá)到抗炎、抗癌等效果[2]。紫草素對多種腫瘤細(xì)胞增殖也有抑制效果，其機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制新生血管形成，從而起到抗腫瘤作用[3]。但目前紫草素對心肌毒性的作用尚不清楚，有關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)較少?；诖?，為探討紫草素對心肌細(xì)胞的毒性作用，本研究將采用新生乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物：紫草素購自廣州市藥檢所，純度＞97%，8mg紫草素溶解于1mL二甲基亞砜（DMSO）中，充分溶解后置于-20℃保存。

1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Science Cell公司；0.25%胰蛋白酶購自杭州吉諾公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。

1.3 動物：SD大鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意使用。

1.4 心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：將新生（出生1～3d）大鼠用75%乙醇消毒，取其心臟，將心房和血管組織去除，沖洗心室后將其剪碎，剪成1mm左右組織塊，加入5mL的0.25%胰酶和0.1%EDTA消化液在搖床中搖勻，溫度保持在37℃，以100轉(zhuǎn)/分搖10min，去除消化液。加入新的胰酶，使用滴管吹打3～5次后搖20min，收集消化液，在重復(fù)上述操作3次。收集到的消化液使用15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中和，使用消毒后的300目尼龍網(wǎng)過濾。過濾液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中離心4min，棄上清液，收集細(xì)胞，使用15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后分裝至培養(yǎng)瓶中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。75min后吸出尚未貼壁的細(xì)胞懸液，移至培養(yǎng)板的蓋玻片上，24h后換液，清除未貼壁細(xì)胞，往后隔2d換液1次，使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，每天對細(xì)胞的自發(fā)收縮進(jìn)行計(jì)數(shù)和照相。

1.5 MTT檢測：將培養(yǎng)24h后的心肌細(xì)胞按每孔5×104個細(xì)胞接種于96孔板中，在培養(yǎng)2d后，往每孔加入濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L的紫草素處理，時間分別為48h和72h后，將培養(yǎng)液倒掉，到終點(diǎn)時間時加入2mg/mL的MTT于每孔。37℃培養(yǎng)4h，倒掉MTT溶液，再每孔加入150μL的DMSO液，振蕩10min，充分溶解后使用酶標(biāo)儀在490處測定各孔的OD值。設(shè)立空白對照組和正常對照組，空白對照組即無細(xì)胞、培養(yǎng)液和MTT；正常對照組，即有細(xì)胞和相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液和MTT。細(xì)胞存活率=（OD樣品-OD對照）/（OD對照-OD空白）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各濃度紫草素處理48h后心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較：與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著（P＜0.05），其他兩個濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），紫草素為1×10-5mol/L濃度時，OD均值與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表1，圖1。

表1 各濃度紫草素處理心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較（±s）

表1 各濃度紫草素處理心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較（±s）

組別 減去底色的OD值對照組 0.67±0.0510-7紫草素 0.78±0.1510-6紫草素 0.75±0.1210-5紫草素 0.009±0.007

圖1 MTT檢測結(jié)果（紫草素處理心肌細(xì)胞作用48h）

2.2 各濃度紫草素處理72h后心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較：與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著（P＜0.05），其它兩個濃度均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），紫草素為1×10-5mol/L濃度時，OD均值與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表2，圖2。

圖2 MTT檢測結(jié)果（紫草素處理心肌細(xì)胞作用72h）

表2 各濃度紫草素處理心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較（±s）

表2 各濃度紫草素處理心肌細(xì)胞毒性O(shè)D值比較（±s）

組別 減去底色的OD值對照組 0.83±0.0610-7紫草素 0.77±0.1210-6紫草素 0.82±0.1010-5紫草素 0.015±0.006

3 討論

近年來，關(guān)于中藥提取物對心肌細(xì)胞毒性作用的相關(guān)研究日趨增多。心肌細(xì)胞是研究藥物毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)對象[4]。紫草素在2010版藥典中，將紫草素作為紫草的含量和質(zhì)量測定指標(biāo)[5-6]。中醫(yī)上常見紫草作為外用藥物，熬膏或用植物油浸泡涂擦方式用于溫?zé)岚哒睢岫咎N(yùn)結(jié)引起的多種皮膚疾病，如燒傷、濕疹、丹毒等[7]。以往學(xué)者多認(rèn)為紫草無毒性或小毒性的天然材料，如《名醫(yī)別錄》中認(rèn)為紫草苦寒無毒[8]?？紤]原因是紫草多外用，紫草素進(jìn)入人體內(nèi)部的含量相對較少，不會達(dá)到有毒的含量。因此，關(guān)于紫草素對心肌細(xì)胞的毒性尚未清楚。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，紫草素可以抑制炎癥因子、加速癌細(xì)胞凋亡以及抗血管新生等作用，但組織中存在的吡咯里西啶生物堿一定的毒性，阻礙了其藥物作用[9-10]。Li等研究表明，紫草素通過激活活性氧（ROS）的產(chǎn)生并抑制細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷水平、糖酵解相關(guān)蛋白和PI3K-AKT-mTOR信號通路，誘導(dǎo)RA-FLS的細(xì)胞凋亡和自噬[11]。有研究表示，紫草素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有較高的毒性作用，不同濃度紫草素的毒性有差異[12-13]。本研究結(jié)果顯示，紫草素濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在48h的心肌細(xì)胞處理?xiàng)l件下，與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著，其它兩個濃度均未作出顯著毒性。紫草素濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在72h的心肌細(xì)胞處理?xiàng)l件下，與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著，其他兩個濃度均未作出顯著毒性。提示為紫草素處理濃度小于1×10-6mol/L時，無明顯毒性，當(dāng)紫草素處理濃度為1×10-5mol/L時作用于大鼠心肌細(xì)胞48h、72h后產(chǎn)生了明顯毒性細(xì)胞毒性。綜上所述，紫草素具有一定的細(xì)胞毒性，紫草素濃度小于1×10-6mol/L時，未表現(xiàn)出明顯毒性，當(dāng)紫草素濃度為10-5mol/L時處理心肌細(xì)胞48h、72h后，對大鼠心肌細(xì)胞有明顯毒性。本研究還存在一定的局限性，未做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此心肌細(xì)胞采用不同濃度紫草素的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是否會存在毒性反應(yīng)還需進(jìn)一步研究。