復合酶法提取菜籽油工藝優(yōu)化

邱展英， 李琳何， 范方舒， 吳衛(wèi)國,， 凌 閩， 張 喻,

(湖南農業(yè)大學食品科學技術學院1，長沙 410128) (湖南省菜籽油營養(yǎng)健康與深度開發(fā)工程技術研究中心2，長沙 410128)

菜籽油是世界三大植物油之一，是我國食用油的重要來源，占國內食用油銷售總量的50%[1]。我國菜籽油的傳統(tǒng)制取方法主要有壓榨法、溶劑浸出法[2]。目前工業(yè)上常采用預榨-浸出法制取菜籽油，由于炒制和壓榨等預處理溫度較高，容易導致菜籽油中營養(yǎng)物質的損失。此外，溶劑浸提法還存在溶劑殘留問題[3,4]。水酶法作為一種新興的提油工藝，相比于傳統(tǒng)提油方法，其提取條件溫和，綠色環(huán)保，所得油脂品質高，同時，可獲得低變性且無毒的蛋白質，目前已成為研究熱點[5-7]。

在水酶法提油工藝中，常用的酶主要有纖維素酶、半纖維素、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶以及復合酶等[8,9]。其中復合酶具有多種酶的不同活性，各活性之間有協(xié)同作用，更有利于細胞壁的破裂，以釋放油脂，因此提油效果比單一酶好[10-12]。陶海英等[13]研究了單一酶及復合酶對小麥胚芽油提油率的影響，得到以酸性蛋白酶和纖維素酶為主的復合酶提油效果最好，提油率可達65.53%。周玥等[14]對水酶法提取茶籽油的復合酶制劑配方及酶解工藝進行了研究，得到高溫淀粉酶結合酸性蛋白酶在最優(yōu)酶解條件下提油率最高，達92.45%。令玉林等[15]對水酶法提取菜籽油與菜籽蛋白的酶解工藝參數進行研究，確定了纖維素酶和果膠酶配比的復合酶處理效果較好，破乳后油脂的總提取率為92.6%。油料不同所使用的酶種類與配比也不一樣，酶的種類及用量應根據油料的種類、主要成分、含油率及制油方式等條件來選擇[16]。此外，在酶解過程中，酶解溫度、酶解時間、料液比、酶解pH和酶質量分數等因素對酶解效果也有很大的影響。

因此，本實驗以擠壓預處理后的油菜籽為原料，在對復合酶制劑中酶種類進行篩選以及混料設計優(yōu)化配比的基礎上，采用單因素實驗和響應面優(yōu)化實驗研究不同酶解條件對水酶法提取油菜籽清油提油率的影響，確定最佳的復合酶配比及酶解工藝參數，以期為水酶法技術在油菜籽中的工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

油菜籽：香油Ⅰ號。

纖維素酶(酶活≥400 U/mg)、果膠酶(≥500U/mg)、中性蛋白酶(酶活10萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活≥200 U/mg)、α-淀粉酶(酶活≥4 000 U/g)、木聚糖酶(酶活≥6 000 U/mg)；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，均為分析純。

1.2 主要儀器設備

FMHE36-24R型雙螺桿擠壓膨化機，SHZ-B型恒溫水浴振蕩器，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，TDZ5型臺式低速離心機，KQ5200型超聲波清洗器。

1.3 實驗方法

1.3.1 菜籽油的提取工藝

油菜籽→清理粉碎→雙螺桿擠壓→水酶法酶解→滅酶→離心→吸取上清油→干燥→菜籽油

具體操作要點：油菜籽粉碎過40目篩，擠壓膨化機設定套筒溫度為90 ℃、喂料量為12 kg/h、物料加水量為10%、螺桿轉速為210 r/min，其中，擠壓膨化機處理物料方式為常溫進量，中段加熱，最后階段出料溫度小于50 ℃。取20.0 g擠壓后的菜籽于250 mL錐形瓶中，按照不同的料液比加入溫度為70～80 ℃、不同pH的熱緩沖液，將原料攪拌均勻，放入60 ℃的水浴鍋中浸提1 h。取出樣品置于室溫下，將其溫度降至40 ℃左右，稱取不同添加量的酶加入樣品，混勻后置于恒溫水浴振蕩器中酶解，酶解結束后取出，在水浴鍋中以90 ℃滅酶20 min。將其離心吸取上清油，在90 ℃的烘箱中烘1 h，稱量計算清油提取率。

1.3.2 清油提取率的計算

清油提取率計算公式為：

式中：Y為清油提取率/%；m0為菜籽酶解后所得清油的質量/g；m1為菜籽的質量/g；m2為擠壓后油菜籽含油率/%。

1.3.3 酶種類的篩選

在料液比1∶5、酶質量分數3%、酶解時間4 h、每種酶最適的溫度和pH條件下，選用6種不同的酶對油菜籽進行處理，每個處理組設3個重復。根據提油率篩選出適宜提油的酶制劑種類。所用酶的種類、最適溫度及pH見表1。

表1 6種酶的最適pH及溫度

1.3.4 D-最優(yōu)混料設計優(yōu)化復合酶的配比

基于單一酶對提油率的影響，選擇中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶3種酶作為復合酶的目標酶。設定酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h、酶解pH 6、料液比1∶5、復合酶質量分數2%，按照Design-expert 8.06混料實驗設計原理，對3種酶的不同混合比例進行優(yōu)化，確定3種酶的適宜配比。

1.3.5 復合酶酶解條件的確定1.3.5.1 單因素實驗

在酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h、酶解pH 6、料液比1∶5和復合酶質量分數2.5%的條件下，分別以酶解溫度40、45、50、55、60 ℃，酶解時間2、3、4、5、6 h，酶解pH 4、5、6、7、8，料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，復合酶質量分數1%、1.5%、2%、2.5%、3%為單因素，探究不同的酶解條件對提油率的影響。

1.3.5.2 Box-Behnken實驗設計優(yōu)化最佳酶解條件

在單因素實驗實驗基礎上，選取酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶解pH(C)、料液比(D)和復合酶質量分數(E)作為Box-Behnken實驗設計的5個自變量，通過響應面實驗設計建立提油率(Y)與自變量之間的函數關系，得到復合酶法酶解油菜籽的最佳條件。Box-Behnken實驗因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計因素水平

1.3.6 數據處理方法

D-最優(yōu)混料設計和Box-Behnken實驗設計采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件，圖形制作采用Excel和Origin 2018數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 酶種類的篩選

酶具有專一性，不同的酶在提取油脂的過程中產生的效果不同。根據油菜籽的主要成分及已報道的相關實驗研究，選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶6種酶，并在各不同酶的最適條件下對擠壓后的油菜籽進行酶解提油，實驗結果如圖1所示。當酶的質量分數相同時，不同種類的酶在各自較適宜的酶解條件下對菜籽油的提取率差異較大，使用堿性蛋白酶和中性蛋白酶提取效果最好，其次是果膠酶和α-淀粉酶，木聚糖酶、纖維素酶提取效果較低。這說明油菜籽中油脂與蛋白質結合的最多，蛋白酶能對脂質復合體進行降解，促使油脂和蛋白質的分離[17]。原料經過擠壓之后，油料的顆粒分子結構被破壞，可能導致菜籽組分中的部分不溶性纖維轉變?yōu)榭扇苄岳w維，所以使用纖維素酶酶解效果較差[18]。中性蛋白酶與堿性蛋白酶對菜籽油提油率的影響不顯著，而油料在堿性條件下進行酶解容易導致油脂皂化，因此選擇酶解條件相近的中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶這3種酶為復合酶的目標酶。

圖1 不同酶對提油率的影響

2.2 D-最優(yōu)混料設計實驗結果與分析

2.2.1 混料實驗模型的建立

設定中性蛋白酶(F)、果膠酶(G)和α-淀粉酶(H)這3種酶的添加比例在0.1～1之間，且三者添加比例之和為1，以3種酶的添加比例為自變量，提油率為因變量，采用Design-expert 8.06軟件中混料實驗設計確定實驗因素空間內的候選點，組成16個模型組合，確定復合酶中3種酶的質量分數。每次實驗重復3次，取平均值作為實驗結果，實驗方案及結果見表3。

表3 混料實驗設計方案及結果

應用分析軟件對表3的數據進行回歸擬合，得到Y與F、G和H之間的二次多元回歸方程為：

Y=76.16F+56.77G+71.85H+66.74FG-6.29FH+16.40GH+270.92FGH+12.52FG(F-G)+246.95FH(F-H)-24.77GH(G-H)

2.2.2 混料實驗模型的顯著性分析

表4 回歸方程的方差分析結果

以擠壓后油菜籽提油率(Y)為響應值，繪制3個自變量之間交互作用的等高線圖和響應面圖，如圖2所示。3種酶線性混合交互作用達到了極顯著水平(P<0.000 1)，當中性蛋白酶用量高，果膠酶和α-淀粉酶用量較少時，油菜籽提油率約為80%；當果膠酶用量高，中性蛋白酶和α-淀粉酶用量較少時，提油率為60%左右；當α-淀粉酶用量很高，中性蛋白酶和果膠酶用量較少時，提油率為50%左右。這表明在酶解過程中，中性蛋白酶占主導地位，果膠酶和α-淀粉酶對提油率都有一定的影響。因此在酶解過程中，將3種酶進行合適的配比所組成的復合酶體系之間可產生協(xié)同作用，顯著提高油菜籽提油率。

圖2 3種酶交互作用對菜籽油提油率影響的等高線圖和響應面圖

2.2.3 驗證實驗

通過 Design expert 8.06軟件求解方程，得出中性蛋白酶、果膠酶、α-淀粉的配比為0.573∶0.315∶0.112，理論提油率為87.840%。為驗證該配比的可靠性，進行3次驗證實驗，提油率的平均值為 87.624%，與理論預測值基本吻合。這也表明使用中性蛋白酶、果膠酶、α-淀粉酶按比例組成的復合酶進行酶解，其酶解效果要顯著高于單一酶的酶解效果。

2.3 復合酶酶解條件的確定

2.3.1 單因素實驗結果與分析2.3.1.1 酶解溫度對提油率的影響

固定其他參數不變，探究酶解溫度對提油率的影響，結果如圖3所示。提油率隨酶解溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，當溫度達到50 ℃時提油率最高。呈現(xiàn)這種趨勢的主要原因是大多數酶對熱敏感，溫度較低時不易催化酶的活性，但當溫度過高時容易導致酶變性失活[19]。酶的催化功能主要取決于酶分子結構的完整及嚴格的構象，在一定范圍內升高溫度，可以使酶的分子構象發(fā)生改變，增加分子的動能，促進擴散作用，有利于酶解的進行[20]。但當溫度升高到一定程度，高溫使酶的分子結構被破壞，逐漸失去催化活性，從而導致提油率降低[19,21]。所以酶解溫度選擇50 ℃較為合適。

圖3 復合酶酶解條件對提油率的影響

2.3.1.2 酶解時間對提油率的影響

酶解時間的長短決定了酶對底物的作用程度。固定其他參數不變，探究酶解時間對提油率的影響，實驗結果見圖3。 酶解時間1～4 h的范圍內，提油率隨酶解時間的增長呈不斷上升的趨勢，當酶解時間達到4 h后增加較為緩慢。酶解反應時間越長，酶解反應越充分，較多的油脂被釋放出來，油脂的提油率也就越高。酶解4 h之后，基本達到完全酶解的狀態(tài)，而時間較長時蛋白質被逐漸分解成分子量更小的肽類，在不斷振蕩過程中部分油脂發(fā)生乳化，故提油率有所降低[16]。而且時間過長還會造成油脂的氧化，油脂的品質下降[22]。所以酶解時間選擇4 h較為適宜。

2.3.1.3 酶解pH對提油率的影響

pH是影響水酶法提油的關鍵因素之一，主要通過影響酶的活性和油脂與蛋白質的分離來影響提油率的大小[23]。固定其他參數不變，探究酶解pH對提油率的影響，結果見圖3。在酶解pH 4～8之間，提油率隨酶解pH的升高呈先升高后降低的趨勢，當酶解pH 6時提油率達到最高。其原因可能是pH 影響了酶的活性，酸或堿能夠改變酶的空間結構，影響了底物與酶結合后復合物的離解，從而影響了酶解產物和酶的釋放[16]；在一定范圍內，隨著pH的增加，菜籽蛋白溶解度增大，蛋白結構疏松，油脂容易流出[24]。所以該復合酶選擇酶解pH 6較為合適。

2.3.1.4 料液比對提油率的影響

固定其他參數不變，探究料液比對提油率的影響，實驗結果如圖3所示。當料液比在1∶(3～4)的范圍內，隨著溶劑用量的增大，提油率呈明顯上升的趨勢(P<0.05)。當料液比為1∶4時最高，提油率達到89.980%。其原因主要是隨著溶液用量的增加，酶能更充分的作用于底物，底物濃度剛好達到酶促反應速度最大值，此時提油率最高[25]。但是溶劑用量過大，酶和底物的作用面積減小，不利于酶的作用。所以結合生產成本和工廠生產的可能性，在保證原料底物與酶充分接觸的情況下，盡可能的減少溶劑的用量。所以料液比選擇1∶4較為合適。

2.3.1.5 復合酶質量分數對提油率的影響

酶添加量會影響酶和底物的接觸面積，進而影響酶解速率。固定其他參數不變，探究復合酶質量分數對提油率的影響，實驗結果見圖3。復合酶質量分數在0%～2%的范圍內，隨著復合酶質量分數的增加，油菜籽的提油率不斷增加，且增幅較大；當復合酶質量分數大于2%后，菜籽油提油率增加幅度減緩。其原因可能是反應體系中復合酶的添加量趨于飽和，底物的接觸位點不能充分暴露出來，因此過量的酶無法和底物發(fā)生反應，導致提油效果升高緩慢[26]。此外，復合酶質量分數增加，在工業(yè)化生產中會導致生產成本大幅增加，所以當復合酶質量分數為2%～3%，提油效果均較好時，選擇復合酶質量分數為2%較為合適。

2.3.2 Box-Behnken設計實驗結果與分析

根據Design-Expert 8.06實驗設計原理，以酶解溫度、酶解時間、酶解pH、料液比和復合酶質量分數為自變量，提油率作為響應值，設計了五因素三水平共46個點的響應面實驗，每個實驗做3個平行，取平均值作為實驗結果，實驗結果見表5，方差分析見表6。

通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.06對數據進行多元回歸擬合，對提油率(Y)與酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶解pH(C)、料液比(D)、復合酶添加量(E)之間建立二次響應面回歸模型為：

Y=92.35-2.42A+1.71B+0.24C+0.53D+1.91E-2.61AB-1.08AC-5.26AD+2.22AE-3.75BC+0.75BD+0.12BE-4.97CD-1.56CE-1.80DE-17.07A2-0.85B2-7.24C2-4.80D2-2.57E2

所得模擬方程具有較好的相關性，相關系數為R2=0.994 4。此外為了考察模型的擬合度，對模型進行了ANOVA方差分析，分析結果見表5。

表5 響應面實驗方案及結果

表6 二次多項式模型方差分析

根據Box-Behnken模型響應面優(yōu)化的結果，得出最優(yōu)提取工藝參數為酶解溫度49.08 ℃、酶解時間4.05 h、酶解pH 6.03、料液比1∶4.09、復合酶質量分數2.27%，此時菜籽的油脂提取率為92.378%。為便于操作，確定最佳的提取工藝參數為：酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h、酶解pH 6、料液比1∶4、復合酶質量分數2%。為證實響應面優(yōu)化結果的可靠性，對該酶解條件進行實驗驗證，在此條件下提油率分別93.124%、92.457%、91.417%，平均值為92.333%，與理論值92.378%基本一致。說明通過Box-Behnken實驗設計所得到復合酶法提菜籽油的工藝條件是可靠的。

3 結論

以提油率為考察指標，通過單因素實驗篩選出中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶為復合目標酶。在此基礎上，利用D-最優(yōu)混料設計確定中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶的最佳配比為0.573∶0.315∶0.112時提油效果好，為87.624%。結合響應面優(yōu)化實驗和方差分析，確定了酶解工藝參數對提油率影響的大小順序為：酶解溫度>復合酶質量分數>酶解時間>料液比>酶解pH，其中酶解溫度、酶解時間和復合酶添加量對提油率的影響極顯著；最佳酶解工藝條件為酶解溫度50 ℃、復合酶質量分數2%、酶解時間4 h、料液比1∶4、酶解pH 6，在此條件下，水酶法提油率的模型預測值為92.378%，而實測值為92.333%，二者接近，這表明通過Box-Behnken實驗設計所得到復合酶法提菜籽油的工藝條件是可靠的。