基于“腸-腦互動”探討溫腎健脾方對脾腎陽虛型腹瀉型腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性及c-Fos表達(dá)的影響

蔣天媛，牛然，劉倩，羅曉穎，張濤，楊洋，蘇曉蘭，吳寶麒，韓娟，魏瑋

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.功能性胃腸病中醫(yī)診治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；3.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；4.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是臨床常見功能性腸病，以腹痛、排便次數(shù)增多、大便不成形為主要臨床表現(xiàn)，同時缺乏器質(zhì)性改變。內(nèi)臟高敏感性被認(rèn)為是其核心病理機(jī)制，包括外周敏化和中樞敏化，內(nèi)臟高敏在一定程度上是“腸-腦互動”神經(jīng)信號傳遞異常的表現(xiàn)之一。背根神經(jīng)節(jié)作為外周神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞的中轉(zhuǎn)站，在“腸-腦互動”中具有重要作用。海馬是與認(rèn)知相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，母嬰分離作為早期生活不良事件，對海馬中成體神經(jīng)發(fā)生具有抑制效應(yīng)，并可使海馬可塑性降低。機(jī)體對傷害性刺激信號的放大可能是敏化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，c-Fos被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，應(yīng)激時可以放大傷害性刺激信號，與內(nèi)臟高敏感性密切相關(guān)，可能成為治療IBS-D的重要靶點(diǎn)。

IBS-D目前尚無特異性治療方案，給患者生命健康和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響。傳統(tǒng)對癥治療主要關(guān)注腸道局部癥狀，難以實(shí)現(xiàn)對腸道及中樞的多維調(diào)控。課題組前期基于文獻(xiàn)研究認(rèn)為脾腎陽虛是IBS-D反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的重要原因，并基于臨床實(shí)踐歸納提出溫腎健脾法，擬溫腎健脾方應(yīng)用于臨床，療效顯著?；诖?，本實(shí)驗(yàn)觀察溫腎健脾方對脾腎陽虛型IBS-D大鼠糞便性狀、內(nèi)臟敏感性、腸道吸收功能及c-Fos在結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)和海馬組織表達(dá)的影響，基于“結(jié)腸-背根神經(jīng)節(jié)-海馬”3個環(huán)節(jié)探討溫腎健脾方改善IBS-D模型大鼠內(nèi)臟敏感性，緩解IBS-D癥狀的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

1日齡SPF級雄性SD大鼠32只、12周齡SPF級SD母鼠5只，中國中醫(yī)醫(yī)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號SCKK（京）2012-0004。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，溫度（23±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h晝夜交替。予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（D2021-03-16-3）。

1.2 藥物及制備

溫腎健脾方（肉豆蔻15 g，補(bǔ)骨脂30 g，五味子9 g，吳茱萸6 g，太子參30 g，白術(shù)10 g，郁金18 g，生姜10 g，大棗10 g），復(fù)方顆粒購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院顆粒藥房，1劑顆粒相當(dāng)于原藥材12.2 g，使用時加蒸餾水配制成0.11 g/mL溶液。番瀉葉顆粒，中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥配方顆粒藥房提供（購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司），取50 g番瀉葉顆粒，加入50 mL 100℃飲用水完全溶解，配制成濃度為1 g/mL番瀉葉水溶液。匹維溴銨片，法國Mylan Laboratories SAS公司，批號0160396，50 mg/片，將匹維溴銨片研碎后與適量蒸餾水混合，配制成濃度為2.7 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

D-木糖測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號A035-1-1；蘇木素染液，武漢云克隆科技股份有限公司，貨號C1001；TRNzol Universal Reagent試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP424；EasyScrpt One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號AE311-03；HieffqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，上海翊圣生物，貨號11201ES08；c-Fos抗體，英國Abcam，貨號ab208942；組織裂解液，武漢云克隆科技股份有限公司，貨號A101；BCA總蛋白定量測定試劑盒（微孔板法），武漢云克隆科技股份有限公司，貨號A202。Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質(zhì)儀，美國Omni；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機(jī)，北京DragonLab；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，瑞士Roche；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，美國Thermo；ELx808酶標(biāo)儀，美國BioTek；5600F掃描儀，佳能（中國）有限公司；CK31正置光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯；TVO.63XC-MO成像系統(tǒng)，廣州明美。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、匹維溴銨組和溫腎健脾方組，每組8只。除正常組外，其余各組采用母子分離聯(lián)合番瀉葉灌胃建立脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型：每日上午9:00－12:00將子鼠與母鼠分籠3 h，連續(xù)3周；適應(yīng)性喂養(yǎng)1周；第5周開始予番瀉葉水溶液1 g/mL灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

2.2 干預(yù)

造模結(jié)束后，根據(jù)人與大鼠體表面積換算給藥劑量，匹維溴銨組予匹維溴銨混懸液13.50 mg/kg灌胃，溫腎健脾方組予溫腎健脾方溶液1.1 g/kg灌胃，正常組和模型組予生理鹽水灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 糞便性狀評分

干預(yù)結(jié)束后將大鼠單籠飼養(yǎng)，于飼養(yǎng)籠內(nèi)放置濾紙以觀察大鼠糞便性狀，并根據(jù)Bristol糞便性狀量表進(jìn)行評分：1分，分散的硬塊，似堅(jiān)果；2分，臘腸狀，但成塊；3分，臘腸狀，表面有裂縫；4分，似臘腸或蛇，光滑柔軟；5分，軟團(tuán)，邊緣清楚；6分，絨狀物、邊緣不清，糊狀便；7分，水樣，無固狀物。

2.3.2 內(nèi)臟敏感性檢測

干預(yù)結(jié)束后，參照腹壁撤退反射（AWR）實(shí)驗(yàn)方法自制結(jié)直腸測壓計(jì)，測定大鼠內(nèi)臟敏感性。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水18 h，確認(rèn)其排盡大便后，將球囊涂抹石蠟油并塞入大鼠肛門約7 cm，在肛門外1 cm處用醫(yī)用膠帶將其固定于大鼠尾根部，將大鼠置于18 cm×8 cm×6 cm特制小籠中，使其不得轉(zhuǎn)頭，待其完全平靜后緩慢向球囊內(nèi)充氣，觀察大鼠腹壁對腸腔球囊擴(kuò)張刺激的反應(yīng)。分別使用20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）4個壓力，每次擴(kuò)張持續(xù)20 s。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，給予結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時大鼠情緒基本穩(wěn)定；1分，給予刺激時情緒不穩(wěn)定，偶爾扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，腹背部肌肉較強(qiáng)烈收縮且腹部抬離地面；4分，腹部肌肉強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形且腹部、會陰部抬離地面。

2.3.3 腸道吸收功能檢測

大鼠先予5%D-木糖溶液0.3 g/kg灌胃，1 h后腹腔注射5%異戊巴比妥（4 mL/kg）麻醉，仰臥固定于平板上，腹主動脈取血5～8 mL，室溫靜置20 min，3000 r/min離心15 min，收集上清液，采用生化法檢測血清D-木糖含量。

2.3.4 HE染色

取距肛門5～8 cm處結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗干凈，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切片（厚度2 μm），常規(guī)HE染色，用CaseViewer 2.1軟件觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.3.5 qRT-PCR檢測

取距肛門3～5 cm處結(jié)腸組織；參照文獻(xiàn)[14-15]分離背根神經(jīng)節(jié)；斷頭取腦，距離大腦皮質(zhì)后緣約5 mm位置沿中弧線用刀片切開，將切開的皮質(zhì)鈍性分離后取海馬。分別將結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織置于2 mL凍存管中，放入液氮中暫存，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。

采用Trizol法提取總RNA，按照42℃、15 min，85℃、5 s反應(yīng)程序?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入相應(yīng)引物和熒光染料擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃、5 min，95℃、5 s，55℃、30 s，72℃、20 s，共44個循環(huán)。采用2法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.6 Western blot檢測

將組織剪成小塊，按1∶20加入預(yù)冷的裂解液，充分裂解后，4℃、10000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白含量；將蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1混合，蛋白變性后上樣，進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；加入c-Fos一抗（1∶1000），37℃搖床孵育120 min，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；加入二抗，37℃孵育60 min，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參，Image J1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 溫腎健脾方對模型大鼠Bristol糞便性狀評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著減少（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著減少（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，每組8只）

4.2 溫腎健脾方對模型大鼠腹壁撤退反射評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠20、40、60、80 mm Hg壓力水平下AWR評分均顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠20、40、60、80 mm Hg壓力水平下AWR評分均顯著減少（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠40 mm Hg壓力水平下AWR評分顯著減少（＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同壓力水平下AWR評分比較（±s，分）

4.3 溫腎健脾方對模型大鼠血清D-木糖含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清D-木糖含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠血清D-木糖含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠血清D-木糖含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清D-木糖含量比較（±s，每組8只）

4.4 溫腎健脾方對模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠結(jié)腸黏膜完整，上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)一致，未見糜爛、潰瘍病變；模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見輕度水腫，上皮細(xì)胞排列紊亂；匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織病變有不同程度改善。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×80）

4.5 溫腎健脾方對模型大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織c-Fos mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.01），海馬組織c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同組織c-Fos mRNA表達(dá)比較（±s）

4.6 溫腎健脾方對模型大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01，＜0.05）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織c-Fos蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），背根神經(jīng)節(jié)c-Fos蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）。見表4、圖4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos蛋白表達(dá)比較（±s）

圖4 各組大鼠不同組織中c-Fos蛋白免疫印跡

5 討論

腦-腸軸是“腸-腦互動”的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)間存在雙向聯(lián)系，從而影響感覺、運(yùn)動、內(nèi)分泌、自主神經(jīng)、免疫功能。一方面，當(dāng)情緒變化，如焦慮、恐懼，或生理應(yīng)激時，可以刺激結(jié)腸運(yùn)動功能，表現(xiàn)為結(jié)腸收縮加強(qiáng)、誘發(fā)排便，甚至出現(xiàn)腹瀉癥狀，同時可以改變內(nèi)臟敏感性/腸道疼痛閾值，削弱黏膜屏障功能；另一方面，內(nèi)臟器官炎癥和損傷可放大上行內(nèi)傳通路信號，影響腦區(qū)活動，引起更明顯的疼痛。

IBS-D是較為典型的“腸-腦互動”異常疾病，內(nèi)臟高敏可能是“腸-腦互動”異常導(dǎo)致的表現(xiàn)之一。機(jī)體疼痛閾值降低和/或機(jī)體對疼痛信號的放大是形成內(nèi)臟高敏狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)臟感覺信號經(jīng)內(nèi)臟感覺傳入神經(jīng)傳遞至位于脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元胞體后交叉至對側(cè)，上行傳輸至大腦皮層產(chǎn)生內(nèi)臟感覺。背根神經(jīng)節(jié)所含的初級感覺神經(jīng)元可以將傷害性刺激轉(zhuǎn)化為動作電位，從外周傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生傷害性或疼痛信號。反復(fù)應(yīng)激可強(qiáng)化海馬區(qū)傷害性刺激相關(guān)的神經(jīng)連接。c-Fos屬于早期即刻基因，可被第二信使誘導(dǎo)，能對神經(jīng)遞質(zhì)、激素、神經(jīng)沖動等外界刺激引起的傳入信息在短時間內(nèi)作出反應(yīng)，可作為傷害性神經(jīng)元激活的標(biāo)志，是影響突觸功能的重要因子。多項(xiàng)研究顯示，應(yīng)激刺激后，大鼠脊髓、延髓孤束核和腦組織c-Fos表達(dá)明顯增加。據(jù)此，基于“腸-腦互動”異常，考慮反復(fù)慢性應(yīng)激可以通過調(diào)節(jié)突觸可塑性影響感覺信號傳導(dǎo)，進(jìn)而改變結(jié)腸功能及內(nèi)臟敏感性。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著增加，血清D-木糖含量顯著減少，各壓力水平下AWR評分均顯著升高，表明模型組大鼠糞便性狀、腸道吸收功能及內(nèi)臟敏感性均有明顯改變。與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著降低，血清D-木糖含量顯著增加，AWR評分在各壓力水平下均顯著降低，表明溫腎健脾方可以改善IBS-D模型大鼠糞便性狀、腸道吸收功能及內(nèi)臟敏感性。PCR和Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，提示IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos表達(dá)具有一致性，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致；溫腎健脾方組大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，表明溫腎健脾方可以下調(diào)IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos表達(dá)。課題組前期研究顯示，溫腎健脾方可能通過調(diào)節(jié)IBS-D模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體及其磷酸化蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性。同時相關(guān)研究表明，NMDA受體對c-Fos表達(dá)有促進(jìn)作用。因此，本研究表明溫腎健脾方通過調(diào)節(jié)結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos表達(dá)，緩解內(nèi)臟高敏狀態(tài)，改善腸道吸收功能及糞便性狀。

中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，脾為后天之本，疾病發(fā)作日久往往累積于腎，因此，脾腎陽虛是IBS-D發(fā)作的關(guān)鍵病機(jī)，治以溫腎健脾為主，選用《證治準(zhǔn)繩》所載四神丸加減化裁。方中補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽、溫脾止瀉，尤善補(bǔ)命門之火以散寒邪；肉豆蔻溫補(bǔ)脾腎、澀腸止瀉，為治療虛寒性瀉痢之要藥；吳茱萸溫暖脾胃以散其陰寒之邪；五味子溫腎固澀，與吳茱萸相配共奏溫澀止瀉之功。在此基礎(chǔ)上，以太子參、白術(shù)健脾益氣，郁金清心解郁；姜棗同煮，溫補(bǔ)脾胃，鼓舞中焦運(yùn)化。全方溫補(bǔ)并用，通調(diào)兼施?，F(xiàn)代藥理研究表明，太子參多糖可以作用于腦神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)活動的調(diào)控作用；白術(shù)提取物具有保護(hù)神經(jīng)活性作用，能通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸受體發(fā)揮抗焦慮作用；郁金提取物可通過降低神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平減輕神經(jīng)病理性疼痛。

綜上，本研究表明溫腎健脾方能下調(diào)IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織、背根神經(jīng)節(jié)、海馬組織c-Fos表達(dá)，可能是該方調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏性的重要靶點(diǎn)，為該方“腦腸同調(diào)”的臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。