醒腦解郁方對(duì)卒中后抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及凋亡的影響

王豆，李濤，馮亞倫，楊一帆，毛美玲，閆詠梅

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常見的神經(jīng)精神并發(fā)癥，表現(xiàn)為除卒中以外的情緒低落、興趣下降、思維悲觀等抑郁癥狀，伴有相應(yīng)軀體癥狀的綜合征。Meta分析表明，三分之一卒中幸存者出現(xiàn)PSD。PSD是功能恢復(fù)不良、生活質(zhì)量不佳和康復(fù)結(jié)果不理想的主要因素。PSD涉及心理因素、遺傳易感性、單胺類遞質(zhì)缺乏、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足、下丘腦-垂體-腎上腺軸失調(diào)、神經(jīng)炎癥、突觸可塑性損傷、神經(jīng)元凋亡等。陜西省名中醫(yī)閆詠梅教授團(tuán)隊(duì)創(chuàng)制的醒腦解郁方臨床治療PSD療效顯著。本研究觀察醒腦解郁方對(duì)PSD模型大鼠海馬組織病理形態(tài)和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，從海馬神經(jīng)元凋亡方面探討醒腦解郁方防治PSD的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2020-030，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物及制備

醒腦解郁方（石菖蒲12 g，遠(yuǎn)志12 g，丹參30 g，柴胡12 g，合歡皮15 g，姜黃10 g，巴戟天10 g），飲片購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。所有飲片混勻，加10倍量蒸餾水常規(guī)煎煮2次，每次30 min，混合2次煎液，濃縮至原藥材濃度為1.05、2.1 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸氟西汀膠囊，20 mg/粒，禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)7723A，用蒸餾水配制成濃度為0.208 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

多聚甲醛固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)G1101），DAB顯色液（北京中杉金橋生物試劑公司，批號(hào)K182720A），中性樹膠（西安灝洋，批號(hào)LWG-15），HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1120），Nissl染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1432），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光液（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為14F27C02、14D28C78、14G02A83、14G30C40、14G22C12、14G29C38、14G10A97），PVDF膜（美國(guó)Epizyme，批號(hào)280679876），Bcl-2抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)BF9103），Bax抗體、β-actin抗體、抗兔二抗、抗鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為BM3964、BM0627、MF094、MF093）。TC-120S型組織脫水機(jī)（上海寰熙醫(yī)療器械），TB-718E型組織包埋機(jī)（湖北泰維科技），RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），DP73型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），JXFSTPRP-64型全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），Micro 17R型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司），PowerPac Basic凝膠電泳系統(tǒng)、GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

采用大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）聯(lián)合慢性不可預(yù)知溫和刺激（CUMS）制備PSD大鼠模型。72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、卒中組、PSD組、氟西汀組和醒腦解郁方低、高劑量組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余各組采用線栓法制備MCAO模型，大鼠術(shù)前禁食禁水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿頸部正中縱向切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離后，充分暴露并分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，結(jié)扎近心端頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈近心端穿線備用，將栓線從頸總動(dòng)脈分叉處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度約18～22 mm，60 min后撤掉栓線，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈近心端。假手術(shù)組僅暴露并分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，不插入栓線。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（4萬(wàn)U/只）預(yù)防感染。術(shù)后24 h采用Longa 5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，取評(píng)分1～3分大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。卒中造模成功后次日，除假手術(shù)組、卒中組外，其余各組采用改良CUMS法制備抑郁模型，包括禁食禁水、濕籠、夾尾、強(qiáng)迫游泳、電擊、晝夜顛倒、晃籠，每日給予大鼠1種刺激，7種刺激隨機(jī)進(jìn)行，相鄰2 d刺激不同，連續(xù)21 d，造模期間每種刺激共使用3次；同時(shí)，氟西汀組予鹽酸氟西汀2.08 mg/kg灌胃；醒腦解郁方低、高劑量組分別予10.5、21 g/kg醒腦解郁方藥液灌胃（相當(dāng)于60 kg成人劑量的1、2倍），假手術(shù)組、卒中組和PSD組予0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃體積3 mL/只，連續(xù)21 d。

2.2 取材

末次給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)取6只大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取全腦，冰盤上分離海馬組織，置于4%多聚甲醛中，4℃固定，用于HE染色和Nissl染色。剩余大鼠麻醉后用150 mL生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，迅速取腦，于冰盤上快速分離海馬組織，置于-80℃冰箱凍存，用于Western blot檢測(cè)。

2.3 一般狀況觀察

每日觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)、自主活動(dòng)、毛色、進(jìn)食、飲水、糞便情況。

2.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

給藥結(jié)束后即刻，按照Longa 5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分，無(wú)神經(jīng)缺損；1分，肢體癱瘓側(cè)前爪舒展不完全；2分，行走時(shí)向肢體癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向肢體偏癱側(cè)傾斜；4分，喪失自發(fā)行走能力，存在意識(shí)喪失現(xiàn)象。

2.5 海馬組織病理觀察

取4%多聚甲醛固定的海馬組織，經(jīng)脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋，切片，行HE、Nissl染色，顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)變化。

2.6 Western blot檢測(cè)

取100 mg海馬測(cè)組織，按1∶10加入裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑），冰上裂解30 min，超聲勻漿，12000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮5 min。按30 μg蛋白/孔道上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h。TBST洗膜，加入Bcl-2一抗（1∶1000）、Bax一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶2000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，滴加二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。超敏ECL試劑曝光，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。利用Image J 2.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 醒腦解郁方對(duì)模型大鼠一般狀況的影響

卒中組大鼠精神萎靡，活動(dòng)尚可，形體較瘦弱，毛色少光澤，毛量減少，飲食與糞便尚可；PSD組大鼠精神萎靡，活動(dòng)性差，形體消瘦，毛色枯黃，毛量減少，飲食減少，糞便量較少、偶有稀溏；氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠精神狀態(tài)尚可，活動(dòng)量增加，毛色有光澤，毛量增多，飲食增多，糞便正常。

4.2 醒腦解郁方對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，卒中組和PSD組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（＜0.01）；與PSD組比較，氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s，每組12只）

4.3 醒腦解郁方對(duì)模型大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整、排列密集，胞漿染色均勻，核仁清晰，細(xì)胞間隙無(wú)水腫，尼氏體豐富，未見明顯壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變；卒中組和PSD組大鼠海馬組織可見部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂、數(shù)量減少，胞核固縮，尼氏體數(shù)量減少，壞死灶邊緣有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞數(shù)量較多，排列較為緊密、整齊，尼氏體較豐富。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠海馬組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖3 各組大鼠海馬組織形態(tài)（Nissl染色，×400）

4.4 醒腦解郁方對(duì)模型大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值的影響

與假手術(shù)組比較，卒中組和PSD組大鼠海馬組織Bax蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值明顯降低（＜0.01）；與PSD組比較，氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠海馬組織Bax蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值明顯升高（＜0.01）。見圖4、表1。

圖4 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡

表1 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較（±s）

5 討論

根據(jù)PSD癥狀，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“郁證”范疇。依據(jù)發(fā)病次序，為“中風(fēng)后郁證”，但多從“郁證”論治。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為PSD是抑郁的一種特殊類型?！禖CMD-3中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)（第二版）》將其歸入“腦血管病所致精神障礙”。此外，PSD的臨床表現(xiàn)具有復(fù)雜性、多樣性，除具備卒中本身的神經(jīng)功能損傷癥狀外，還有核心和非核心癥狀之分。其中核心癥狀為抑郁、興趣減退、易疲勞，嚴(yán)重者有自殺傾向。非核心癥狀以體質(zhì)量下降、睡眠障礙、不明原因疼痛、食欲減退或亢進(jìn)、性欲減退等生理癥狀為主，可伴有注意力下降、緊張不安、焦慮、運(yùn)動(dòng)性激越、自責(zé)、自罪等。

PSD發(fā)生的機(jī)制和學(xué)說主要包括遺傳機(jī)制、社會(huì)心理學(xué)說、生物學(xué)機(jī)制等。PSD的遺傳機(jī)制與個(gè)人、家族史、基因等有關(guān)。社會(huì)心理學(xué)說即生物-心理-社會(huì)模式，卒中后患者日常生活質(zhì)量下降，疾病負(fù)擔(dān)沉重，家庭及社會(huì)環(huán)境改變，致患者心理應(yīng)激障礙，心理平衡失調(diào)，導(dǎo)致PSD發(fā)生。PSD作為一種器質(zhì)性情感障礙，其神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)主要是5-羥色胺、去甲腎上腺素及多巴胺等單胺類遞質(zhì)失衡，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足，下丘腦-垂體-腎上腺軸功能異常，機(jī)體腸道菌群紊亂，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子水平升高，海馬、杏仁核、額葉皮質(zhì)等部位神經(jīng)突觸可塑性損傷，細(xì)胞自噬與凋亡等。其中神經(jīng)細(xì)胞凋亡在PSD的發(fā)病過程中存在持續(xù)作用，被認(rèn)為與PSD等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，生理情況下有益于機(jī)體代謝，病理狀態(tài)下則造成組織損傷。卒中后缺血、缺氧導(dǎo)致腦內(nèi)自由基、谷氨酸、炎癥因子等異常增多，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而損傷神經(jīng)元及突觸可塑性，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響卒中恢復(fù)或?qū)е乱钟舻群喜Y。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Bcl-2蛋白是重要的抗凋亡蛋白，Bax是主要的促凋亡蛋白。Bcl-2/Bax比值可直接反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)，Bcl-2/Bax比值降低提示促進(jìn)凋亡，升高則細(xì)胞凋亡被抑制。已有研究顯示，抑制凋亡可明顯改善神經(jīng)功能，改善抑郁癥狀。臨床研究顯示，PSD患者血清Bax、Caspase-3等凋亡因子表達(dá)顯著升高，藥物逆轉(zhuǎn)凋亡蛋白表達(dá)后，抑郁癥狀明顯改善。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSD模型大鼠海馬組織Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降。部分抗抑郁藥物可調(diào)節(jié)海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，改善PSD大鼠抑郁狀態(tài)，可能與促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)有關(guān)。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醒腦解郁方可通過BDNF/ERK/CREB通路和降低促炎因子表達(dá)改善PSD模型大鼠抑郁狀態(tài)，發(fā)揮明顯抗抑郁作用。因此，本研究進(jìn)一步探討醒腦解郁方對(duì)PSD模型大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，醒腦解郁方可通過上調(diào)海馬組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，升高Bcl-2/Bax比值，發(fā)揮抗PSD作用。

PSD與海馬區(qū)神經(jīng)元萎縮密切相關(guān)。影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，重度抑郁患者大腦海馬體積有不同程度縮小，突觸數(shù)量亦有所減少。動(dòng)物模型可見海馬超微結(jié)構(gòu)改變，包括海馬樹突萎縮、神經(jīng)元增殖減少。慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁動(dòng)物模型還可觀察到海馬區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)萎縮和缺失現(xiàn)象，且上述改變?cè)趹?yīng)用抗抑郁藥物后可逆轉(zhuǎn)。相較于單純中風(fēng)患者，PSD患者日常生活質(zhì)量明顯下降，尤其在認(rèn)知、情感、肢體功能及社會(huì)功能等領(lǐng)域。中風(fēng)后神經(jīng)元損傷或凋亡是PSD不良預(yù)后的重要原因。減輕神經(jīng)元損傷，保護(hù)神經(jīng)元存活，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和再生可能是預(yù)防和治療PSD的重要手段。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體發(fā)生溶解和消失。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSD模型大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、排列紊亂，胞核皺縮、溶解、碎裂，胞漿濃縮，細(xì)胞間隙變大，尼氏體數(shù)量減少；醒腦解郁方治療后，大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)呈圓形或橢圓形，排列較為緊密、整齊，尼氏體較豐富，表明醒腦解郁方可減輕和修復(fù)神經(jīng)元損傷。

PSD臨床治療以抗抑郁藥物為主，雖具有不同程度療效，然而存在肝腎毒性、撤藥綜合征，增加心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)等，限制臨床應(yīng)用。閆詠梅教授將PSD的核心病機(jī)概括為痰瘀交阻、氣郁不暢、正氣虧虛，創(chuàng)制醒腦解郁方，臨床應(yīng)用數(shù)十年，療效顯著。醒腦解郁方由石菖蒲、遠(yuǎn)志、丹參、柴胡、合歡皮、姜黃和巴戟天組成。藥理研究表明，石菖蒲超臨界萃取物可改善大鼠抑郁樣行為，其主要成分β-細(xì)辛醚可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活發(fā)揮抗抑郁作用；遠(yuǎn)志活性部位YZ-50可抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡，發(fā)揮抗抑郁作用；丹參酮可保護(hù)腦缺血引起的神經(jīng)元損傷及凋亡；柴胡皂苷A可通過促進(jìn)海馬區(qū)BDNF表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上，醒腦解郁方可通過改善海馬神經(jīng)元形態(tài)，促進(jìn)海馬組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，增加Bcl-2/Bax比值，發(fā)揮抗PSD作用。